王昕雯,曹長春,朱 亮,杜 宇,孫增先

(1．徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院藥學(xué)部,江蘇連云港 222061;2．徐州醫(yī)科大學(xué)淮安臨床學(xué)院藥學(xué)部,江蘇淮安 223300;3．南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院藥學(xué)部,江蘇淮安 223300)

膠質(zhì)瘤(glioblastoma,GBM)被認(rèn)為是惡性程度最高、治療難度最大的原發(fā)性腦腫瘤之一,發(fā)病率占惡性腦腫瘤的45%以上[1-3]。盡管多學(xué)科管理和靶向治療在臨床方面取得了一定進(jìn)展,但惡性膠質(zhì)瘤的現(xiàn)有治療方案仍然較為局限[4-5]。抑癌基因的失活是膠質(zhì)瘤不斷進(jìn)展的重要原因,也是治療的主要障礙之一[6-8]。因此,深入了解這一過程所涉及的分子機(jī)制對于開發(fā)更有效的干預(yù)措施至關(guān)重要。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)是絲裂原活化蛋白激酶家族中的一員,具有獨(dú)特的C末端結(jié)構(gòu)域[9-10]。越來越多的證據(jù)表明ERK5參與腫瘤起始和進(jìn)展的各個階段[11-13]。研究認(rèn)為,ERK5信號級聯(lián)的激活會誘導(dǎo)多種細(xì)胞周期分子增殖[14]。此外,ERK5對周期蛋白依賴性激酶抑制因子的表達(dá)具有下調(diào)作用[15]。藥物干預(yù)和基因策略明確證實(shí),靶向ERK5通路對于癌癥治療具有潛力[16-17]?；虮磉_(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)ERK5 mRNA在原發(fā)性腦腫瘤,特別是GBM中明顯高表達(dá)[18]。新型小分子激酶抑制劑XMD17-109作為ERK5強(qiáng)效抑制劑被成功合成。XMD17-109在生化上抑制ERK5,IC50為(0.162±0.006)μmol/L,在細(xì)胞內(nèi)阻斷表皮生長因子誘導(dǎo)的ERK5自磷酸化。目前XMD17-109用于膠質(zhì)瘤治療的研究尚未見報道,且XMD17-109作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。1,4,5-三磷酸受體(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R)相互作用蛋白已被證明是IP3R的結(jié)合伴侶,其與IP3R相互作用促進(jìn)IP3R通道的鈣離子抑制功能。前期研究已經(jīng)證明肌醇1,4,5-三磷酸受體相互作用蛋白(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor interacting protein,ITPRIP)通過連接肌球蛋白調(diào)節(jié)輕多肽9和死亡相關(guān)蛋白激酶1促進(jìn)GBM進(jìn)展[19]。本研究假設(shè)ERK5在膠質(zhì)瘤中可能作為腫瘤促進(jìn)ITPRIP的刺激分子。通過研究ERK5抑制劑XMD17-109對膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251活力的影響及ERK5與ITPRIP之間的相互作用,可揭示ERK5介導(dǎo)促進(jìn)ITPRIP表達(dá)的分子機(jī)制,及其在膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的意義,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞

本研究中人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251來自中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心。

1.1.2試劑

XMD17-109購于美國MCE公司;DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購于美國Gibco公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Thermo Fisher公司;PrimeScriptTMRT Master Mix和SYBR &Premix Ex TaqTM試劑盒購于日本TaKaRa公司;BCA試劑盒和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)試劑購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;ERK5抗體購于美國Cell Signaling公司(1∶1 000,#12950);ITPRIP抗體(1∶1 000,26055-1-AP)和GAPDH抗體(1∶5 000,60004-1-Ig)購于美國Proteintech公司;辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗小鼠IgG抗體(1∶5 000,PA2201)和HRP-山羊抗兔IgG抗體(1∶5 000,PA2202)購于南京普諾恩生物技術(shù)有限公司;CCK8檢測試劑盒購于南京建成公司;7-氨基放線菌素D(7-AAD)/藻紅蛋白(PE)試劑盒和Transwell小室購于美國BD公司;ERK5、陰性對照siRNA(siNC)序列和質(zhì)粒由上海GenePharma公司設(shè)計(jì)并合成。

1.1.3儀器

Applied biosystemsTM7500熒光定量PCR儀、酶標(biāo)儀、培養(yǎng)箱和超凈臺購于美國Thermo Fisher公司;流式細(xì)胞儀購于美國Beckman公司;高速冷凍離心機(jī)購于芬蘭Eppendorf公司;Amersham Biosciences蛋白成像系統(tǒng)購于美國Cytiva公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞在含有10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中,37 ℃、5% CO2環(huán)境常規(guī)培養(yǎng)。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,使用濃度為1 μmol/L的XMD17-109處理細(xì)胞24 h以抑制ERK5活性(XMD17-109組),未處理的細(xì)胞納入Control組。

1.2.2RNA干擾

按照說明書提示方法,分別將ERK5 siRNA(siERK5)和siNC使用Lipofectamine 2000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,構(gòu)建ERK5敲低和陰性對照模型,分為siERK5組、siNC組。轉(zhuǎn)染6 h后,更換為含10% FBS的新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞進(jìn)行蛋白、RNA分離等研究。通過逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)測定ERK5敲低效率。siERK5組和siNC組所對應(yīng)RNA序列分別為5′-CGU GCC CUA UGG CGA AUU CAA TT-3′和5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′。

1.2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

人ERK5基因經(jīng)過擴(kuò)增和逆轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA(cDNA)。隨后,將人ERK5 cDNA克隆pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro載體中。將含有ERK5和對照結(jié)構(gòu)的溶液引入到U251細(xì)胞中,孵育48 h,構(gòu)建ERK5過表達(dá)和對照結(jié)構(gòu)模型,分別分為ERK5-OE組、Vector組。采用RT-qPCR和Western blot檢測證實(shí)ERK5在細(xì)胞中的過表達(dá)水平。進(jìn)一步將ERK5-OE組、Vector組細(xì)胞分別與XMD17-109進(jìn)行孵育,分為ERK5-OE+XMD17-109組、Vector+XMD17-109組。

1.2.4總RNA提取及RT-qPCR

轉(zhuǎn)染siRNA后,用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。使用納米微滴設(shè)備評估總RNA的純度和濃度。使用PrimeScriptTMRT Master Mix進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄,然后通過SYBR &Premix Ex TaqTM進(jìn)行RT-qPCR檢測。采用Ct(2-ΔΔCt)法(ΔΔCt=ΔCttarget-ΔCtGAPDH)對所有靶基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,以GAPDH為內(nèi)參基因。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.5Western blot

細(xì)胞收集后在冰上冷卻30 min,使用含有20 mmol/L Tris、1 mmol/L EDT A、150 mmol/L氯化鈉、1 mmol/L乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、1%脫氧膽酸鹽、1% Triton X-100,2 mmol/L正釩酸鈉的裂解緩沖液進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。隨后,裂解液在4 ℃下以13 000 r/min離心20 min。所得上清液使用BCA試劑盒測定。將每個樣品中等量的蛋白質(zhì)與SDS樣品緩沖液相結(jié)合,通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。蛋白轉(zhuǎn)移完畢后,用含有5%脫脂奶粉的TBST(TBS中含0.1%吐溫20)封閉1 h。然后將膜與ERK5抗體、ITPRIP抗體和GAPDH抗體在4 ℃下過夜孵育。用TBST清洗3次,每次清洗5 min。加入二抗,室溫下孵育1 h,其中ERK5和ITPRIP選用HRP-山羊抗兔IgG二抗,GAPDH選用HRP-山羊抗小鼠IgG二抗。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)對膜進(jìn)行檢測。使用Image J軟件進(jìn)行吸光度進(jìn)行分析,每個蛋白條帶的信號強(qiáng)度基于相對于各自的GAPDH加載對照進(jìn)行歸一化。

1.2.6CCK-8和細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

使用CCK-8檢測試劑盒評估細(xì)胞增殖能力。在96孔板中每孔加入100 μL密度為3×104/mL的細(xì)胞混懸液。在5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育0、24、48、72 h。隨后,每孔加入10 μL的CCK-8試劑,繼續(xù)孵育4 h后用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度(A)值,每組條件均設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.7流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

采用7-AAD/PE法檢測U251細(xì)胞凋亡情況。將U251細(xì)胞與7-AAD/PE在冰上孵育15 min,檢測細(xì)胞凋亡情況,應(yīng)用Flowjo軟件進(jìn)行定量分析。

1.2.8劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)

在劃痕實(shí)驗(yàn)中,將細(xì)胞以2×106個/孔的密度重懸于6孔板中。一旦細(xì)胞貼壁,使用20 μL移液器吸頭在細(xì)胞表面做出劃痕。每個實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置3個復(fù)孔。分別于劃痕后0、24 h在顯微鏡下觀察并拍照。每個孔中測量3個隨機(jī)位置,使用Image J軟件量化劃痕寬度。按照說明書提示方法使用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。將1×105個細(xì)胞接種于上室500 μL無血清培養(yǎng)基中,下室加入750 μL含10% FBS的新鮮培養(yǎng)基,將細(xì)胞在37 ℃下孵育36 h。然后將遷移過濾網(wǎng)的細(xì)胞用4%多聚甲醛(PFA)固定,并用結(jié)晶紫溶液染色20 min。用棉簽去除殘留在上室表面的細(xì)胞后,在顯微鏡下隨機(jī)拍照5個視野,采用直接計(jì)數(shù)法用Image J軟件對遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù),取平均值作為最終遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 XMD17-109對ERK5和ITPRIP的影響

Control組與XMD17-109組ERK5 mRNA和蛋白表達(dá)水平無明顯變化;與Control組相比,XMD17-109組ITPRIP mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與Control組相比,XMD17-109組吸光度降低,U251細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均明顯降低,細(xì)胞凋亡率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1、2。

A:ERK5 mRNA表達(dá)水平;B:細(xì)胞增殖能力;C:劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(100×);D:遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(200×);E:侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(200×);F:流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果;①:Control組;②:XMD17-109組;ns:P>0.05,與Control組比較;a:P<0.05,與Control組比較。

2.2 敲低與過表達(dá)ERK5對U251細(xì)胞的影響

與siNC組比較,siERK5組ERK5和ITPRIP mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào);與Vector組比較,ERK5-OE組ERK5和ITPRIP mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào);與siNC組比較,siERK5組U251細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均明顯降低,細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05);與Vector組比較,ERK5-OE組U251細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均明顯升高(P<0.05),見圖2～4。

A:8組ITPRIP mRNA表達(dá)水平;B:8組ERK5和ITPRIP蛋白Western blot結(jié)果;C:8組ERK5蛋白表達(dá)水平;D:8組ITPRIP蛋白表達(dá)水平;①Control組;②XMD17-109組;③siNC組;④siERK5組;⑤Vector組;⑥ERK5-OE組;⑦Vector+XMD17-109組⑧ERK5-OE+XMD17-109組;a:P<0.05,與Control組比較;b:P<0.05,與siNC組比較;c:P<0.05,與Vector組比較;d:P<0.05,與Vector+XMD17-109組比較。

A:ERK5 mRNA表達(dá)水平;B:細(xì)胞增殖能力;C:劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(100×);D:遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果(200×);E:侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(200×);F:流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果;①:SiNC組;②:SiERK5組;a:P<0.05,與SiNC組比較。

2.3 XMD17-109逆轉(zhuǎn)ERK5對U251細(xì)胞的調(diào)控作用

與Vector+XMD17-109組比較,ERK5-OE+XMD17-109組ERK5和ITPRIP mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào);與Vector+XMD17-109組比較,ERK5-OE+XMD17-109組U251細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力均明顯升高,細(xì)胞凋亡率明顯降低,見圖2、5。

3 討 論

原發(fā)或復(fù)發(fā)的膠質(zhì)瘤起源于分化細(xì)胞,如成熟的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和成體神經(jīng)干細(xì)胞[20-21]。這一現(xiàn)象表明,惡性膠質(zhì)瘤可能保留神經(jīng)生物學(xué)特征和信號,使得神經(jīng)中心膠質(zhì)瘤治療成為一種有前途的方法[22-24]。ERK5在調(diào)節(jié)多種凋亡信號通路中發(fā)揮重要作用,不僅促進(jìn)腫瘤生長,還參與腫瘤細(xì)胞的增殖[25-26]。另一方面,ITPRIP缺陷已被證明會加重短暫性腦缺血和急性興奮性毒性后的神經(jīng)毒性[27]。基于這一認(rèn)識,作者認(rèn)為在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中,ERK5可能通過蛋白-蛋白相互作用對腫瘤啟動子ITPRIP發(fā)揮促進(jìn)作用,類似于其在神經(jīng)元細(xì)胞中的作用。

ERK5在癌癥中的致癌作用歸因于其靶向特定的mRNA[28]。采用siRNA/shRNA沉默或敲除ERK5基因的多項(xiàng)研究表明,ERK5信號通路對多種細(xì)胞表型發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究數(shù)據(jù)顯示,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中沉默ERK5均能抑制多種癌細(xì)胞細(xì)胞的增殖作用,如子宮內(nèi)膜癌、非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤、三陰性乳腺癌和膽管癌等[29]。在小細(xì)胞肺癌中,沉默ERK5后細(xì)胞相較于野生型細(xì)胞增殖活力明顯降低,這一結(jié)果強(qiáng)調(diào)了ERK5激酶活性在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖中的重要作用。此外,一項(xiàng)針對實(shí)驗(yàn)用增殖表皮癌細(xì)胞的研究顯示,表皮生長因子能夠引起ERK5的活化[30]。ERK5通過調(diào)節(jié)基質(zhì)相關(guān)基因、促血管生成因子和整合素維持三陰性乳腺癌細(xì)胞的遷移和間質(zhì)表型[17,31]。一項(xiàng)關(guān)于骨肉瘤的研究顯示,ERK5是一種有效的預(yù)后指標(biāo),調(diào)節(jié)ERK5-STAT3通路會加劇骨肉瘤細(xì)胞的惡性表型[32]。

通過數(shù)據(jù)庫對腫瘤基因表達(dá)譜進(jìn)行分析,結(jié)果表明ERK5與ITPRIP在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)上調(diào)。基于此,作者推測ITPRIP在膠質(zhì)瘤中的作用可能是通過調(diào)控ERK5軸介導(dǎo)。為證實(shí)這一假設(shè),本研究進(jìn)行了多項(xiàng)功能實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)XMD17-109處理后細(xì)胞表型明顯抑制,ERK5表達(dá)無明顯變化,ITPRIP表達(dá)降低。這是因?yàn)閄MD17-109作為ERK5選擇性抑制劑,通過阻斷細(xì)胞內(nèi)表皮生長因子誘導(dǎo)的ERK5自磷酸化,對ERK5下游分子發(fā)揮抑制作用,但其對ERK5本身無明顯抑制作用。敲低ERK5會抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,下調(diào)ITPRIP表達(dá)。相反,過表達(dá)ERK5對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能起到促進(jìn)作用,同時上調(diào)ITPRIP表達(dá)。ERK5抑制劑XMD17-109減弱了膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力,同時能夠逆轉(zhuǎn)過表達(dá)ERK5對膠質(zhì)瘤細(xì)胞表型的促進(jìn)作用。此外,前期研究證實(shí),敲低ITPRIP對于膠質(zhì)瘤細(xì)胞表型具有抑制作用[19],因此可以推論:XMD17-109通過阻斷ERK5自磷酸化抑制ITPRIP表達(dá),進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞表型。

綜上所述,本研究證實(shí)了XMD17-109通過抑制ERK5/ITPRIP信號通路進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤的進(jìn)展,ERK5、ITPRIP可以作為膠質(zhì)瘤預(yù)防、診斷和治療的潛在生物標(biāo)志物。