明 浩,張?jiān)瞥?梅勝蘭,余艷麗,孟慶濤,夏中元

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科,武漢 430060)

腎臟缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的主要原因。除腎移植外,IRI還常發(fā)生于在心臟術(shù)后、敗血癥和休克等相關(guān)的疾病進(jìn)程中[1-2]。腎臟IRI的病理生理學(xué)復(fù)雜,涉及多方面的病理生理改變,包括氧化應(yīng)激[3],上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞間的炎癥[4]、凋亡、自噬[5]及鐵死亡[6]等。腎小管的損傷是AKI的主要病理特征[7]。輕度的腎小管損傷可完全修復(fù),但嚴(yán)重或反復(fù)的AKI通常會(huì)導(dǎo)致腎小管異常修復(fù),腎纖維化,最終發(fā)生慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)[8]。腎臟的線粒體含量和耗氧量在人體中位居第2,僅次于心臟[9]。因此,線粒體穩(wěn)態(tài)對(duì)于維持正常的腎功能至關(guān)重要。既往研究發(fā)現(xiàn)線粒體損傷和功能障礙對(duì)AKI發(fā)展和腎臟修復(fù)異常有重要影響[10]。作為線粒體質(zhì)量控制的關(guān)鍵組成部分,線粒體自噬可以靶向清除受損或功能失調(diào)的線粒體,從而防止過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生[11]。有研究發(fā)現(xiàn),激活線粒體自噬可以減輕腎臟IRI[12],在腎臟IRI中維持線粒自噬的正常功能是一種潛在的治療措施之一。紫檀芪(pterostilbene,PTE)是一種天然芪類,與白藜蘆醇二甲基化類似,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激[13]、抗腫瘤[14]、延緩衰老等作用,毒性較低、不良反應(yīng)較少[15]。已有研究發(fā)現(xiàn)PTE可以通過(guò)抑制環(huán)氧合酶-2及相關(guān)的炎癥反應(yīng)來(lái)減輕腦IRI[16]。因此,本研究探討PTE減輕腎臟IRI效果及其具體機(jī)制,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

24只雄性C57BL/6小鼠購(gòu)于武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠8～12周齡,體重20～25 g,在恒溫室12 h光照/黑暗環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為4組,每組6只:假手術(shù)組(S組)、腎缺血再灌注組(IR組)、腎缺血再灌注+5 mg/kg PTE組(IR+PTE1組)和腎缺血再灌注+10 mg/kg PTE組(IR+PTE2組)。PTE購(gòu)于美國(guó)MedChemExpress公司。所有實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1小鼠腎臟IRI模型的建立

4組小鼠術(shù)前禁食12 h,用腹腔注射2%戊巴比妥(80 mg/kg)麻醉。采用腹部中線切口,分離出腎蒂,用微動(dòng)脈瘤夾將腎蒂雙側(cè)夾閉,觀察腎臟顏色由鮮紅色變?yōu)榘导t色,40 min后打開動(dòng)脈夾,觀察腎臟顏色恢復(fù)鮮紅色后關(guān)閉腹部。S組僅開腹不夾閉腎蒂。IR+PTE1組在缺血30 min后腹腔注射PTE 5 mg/kg,IR+PTE2組則注射PTE 10 mg/kg,缺血時(shí)間合計(jì)40 min,于再灌注24 h后處死動(dòng)物,采集血液和腎組織[17]。

1.2.2腎功能及氧化應(yīng)激的測(cè)定

采集的血液2 000 r/min、4 ℃離心15 min,取上清液,送本院檢驗(yàn)科檢測(cè)血清肌酐(creatinine,Cr)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平;按照試劑盒說(shuō)明書操作檢測(cè)血清丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平,MDA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2.3血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的測(cè)定

取1.2.2中的上清液測(cè)定腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6水平。按梯度制備相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,將待測(cè)血清和緩沖液按1∶1共100 μL/孔加入96孔的酶標(biāo)板,PBST洗3次后加入100 μL生物素標(biāo)記的抗體,充分洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記Streptavidin 100 μL/孔。室溫避光孵育30 min。再次洗滌后加入顯色劑TMB溶液100 μL/孔,室溫避光孵育30 min。最后加入終止液50 μL/孔,混勻后立即測(cè)量450 nm吸光度,并計(jì)算出相應(yīng)的濃度水平。上述相關(guān)試劑均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)及TUNEL染色觀察腎臟組織病理改變及凋亡情況

取小鼠左腎組織,采用多聚甲醛固定,石蠟包埋后切片(切片厚度為1.5 μm),HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察各組腎組織。觀察腎小管及腎小球的病變,計(jì)算腎小管損傷評(píng)分,在病變嚴(yán)重處采用Paller法對(duì)腎小管損傷評(píng)分,即每個(gè)高倍鏡視野選擇10個(gè)有病變的腎小管,按100個(gè)腎小管記分,計(jì)分標(biāo)準(zhǔn):腎小管明顯擴(kuò)張、細(xì)胞扁平為1分;刷狀緣損傷1分,脫落為2分;管型2分,腎小管管腔內(nèi)有脫落、壞死的細(xì)胞(未成管型或細(xì)胞碎片)計(jì)1分。部分切片采用TUNEL染色評(píng)估腎小管細(xì)胞的凋亡并計(jì)算凋亡指數(shù)。石蠟切片經(jīng)二甲苯浸洗3次脫蠟,每次5 min,梯度乙醇脫水,加入50 μL TdT酶反應(yīng)液,37 ℃避光孵育60 min;用PBS洗滌后采用DAB染液37 ℃避光孵育60 min,再用PBS洗滌后用蘇木素對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。每個(gè)標(biāo)本選擇5個(gè)高倍鏡視野,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。TUNEL試劑購(gòu)買于南京建成生物工程研究所。

1.2.5Western blot測(cè)定Bcl-2相互作用蛋白3(BNIP3)和微管相關(guān)蛋白輕鏈(LC)3Ⅱ表達(dá)水平

取部分腎組織,按照試劑盒說(shuō)明書提取腎組織裂解蛋白。聚丙烯酰胺凝膠電泳后,于聚偏二氟乙烯膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,5%牛奶封閉1 h,加入BNIP3、LC3-Ⅱ一抗4 ℃過(guò)夜孵育。PBST洗滌后用熒光二抗(1∶10 000)室溫孵育1 h。采用Odyssey雙色紅外激光掃描顯影儀掃描蛋白條帶灰度值,以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。蛋白質(zhì)提取試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司,BNIP3、LC3-Ⅱ一抗購(gòu)于美國(guó)CST公司,熒光二抗購(gòu)于美國(guó)Li-Cor公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠BUN、Cr和MDA水平比較

與S組比較,IR組血清Cr、BUN和MDA水平升高(P<0.05);與IR組比較,IR+PTE1組血清Cr、BUN和MDA水平降低(P<0.05);與IR+PTE1組比較,IR+PTE2組血清Cr、BUN和MDA水平進(jìn)一步降低(P<0.05),見表1。

表1 各組小鼠BUN、Cr和MDA水平比較

2.2 血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平的變化

與S組比較,IR組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高(P<0.05);與IR組比較,IR+PTE1組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低(P<0.05);與IR+PTE1組比較,IR+PTE2組血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平進(jìn)一步降低(P<0.05),見表2。

表2 各組小鼠TNF-α、IL-1β和IL-6水平比較

2.3 各組小鼠腎組織病理變化

S組小鼠腎臟組織中腎小球和腎小管細(xì)胞未見異常;IR組中可見腎小管水腫、擴(kuò)張,空泡化,部分可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及蛋白管型;IR+PTE1組和IR+PTE2組腎組織病理?yè)p傷較IR組減輕,其中IR+PTE2組較IR+PTE1腎小管損傷進(jìn)一步緩解。與S組比較,IR組中的腎小管損傷評(píng)分及凋亡指數(shù)明顯增加(P<0.05);與IR組比較,IR+PTE1組中的腎小管損傷評(píng)分及凋亡指數(shù)明顯降低(P<0.05);與IR+PTE1組比較,IR+PTE2組中的腎小管損傷評(píng)分及凋亡指數(shù)進(jìn)一步降低(P<0.05),見圖1。

a:P<0.05,與S組比較;b:P<0.05,與IR組比較;c:P<0.05,與IR+PTE1組比較。

2.4 各組小鼠腎組織BNIP3、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)比較

與S組比較,IR組中BNIP3、LC3-Ⅱ表達(dá)水平降低(P<0.05);與IR組比較,IR+PTE1組中BNIP3、LC3-Ⅱ表達(dá)水平升高(P<0.05);與IR+PTE1組比較,IR+PTE2組中BNIP3、LC3-Ⅱ表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P<0.05),見圖2。

a:P<0.05,與S組比較;b:P<0.05,與IR組比較;c:P<0.05,與IR+PTE1組比較。

3 討 論

AKI是一種腎功能突然喪失的臨床綜合征,其病理特征是腎小管的亞致死性和致死性損傷。腎臟IRI涉及微循環(huán)障礙等多種病理生理改變,同時(shí)伴有線粒體損傷及自我修復(fù)的過(guò)程[18]。缺血組織需要恢復(fù)血供使細(xì)胞再生并清除有毒代謝物。另一方面,缺血再灌注可能會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的損傷。最近研究強(qiáng)調(diào)了線粒體功能障礙在AKI發(fā)展和進(jìn)展中的關(guān)鍵作用[19-20],因此針對(duì)線粒體保護(hù)和及時(shí)去除受損線粒體已被認(rèn)為是預(yù)防、治療AKI和阻礙AKI-CKD轉(zhuǎn)變的治療前景之一。本研究發(fā)現(xiàn),缺血再灌注可以明顯加重腎臟的損傷,IR組較S組Cr、BUN水平明顯升高,同時(shí)伴隨著氧化應(yīng)激和炎癥細(xì)胞因子水平升高,進(jìn)一步加重腎臟損傷。由腎臟組織的病理改變可以看出,S組損傷主要發(fā)生在腎小管,鏡下可見腎小管的水腫壞死,部分管型形成,腎小管細(xì)胞凋亡。

線粒體自噬是線粒體質(zhì)量控制的關(guān)鍵組成部分,這對(duì)于維持線粒體的功能和保持細(xì)胞活力至關(guān)重要,線粒體自噬在消除受損或功能失調(diào)的線粒體、維持線粒體穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用[21]。線粒體自噬被認(rèn)為是一種適應(yīng)性代謝反應(yīng),可防止ROS水平升高。氧化應(yīng)激與線粒體功能障礙密不可分,因?yàn)榫€粒體既是活性物質(zhì)的產(chǎn)生者,也是活性物質(zhì)的目標(biāo),氧化還原紊亂或線粒體功能障礙均會(huì)影響自噬活動(dòng)。BNIP3已被認(rèn)為是線粒體自噬的調(diào)節(jié)劑之一[22],BNIP3介導(dǎo)的線粒體自噬在AKI期間的線粒體質(zhì)量控制和腎小管細(xì)胞存活中具有關(guān)鍵作用,通過(guò)激活BNIP3介導(dǎo)的線粒體自噬可防止腎IRI[23]。本研究結(jié)果顯示,加入PTE的兩組小鼠,腎臟氧化應(yīng)激水平、腎小管細(xì)胞水腫和壞死減輕,炎癥細(xì)胞因子釋放得到抑制,腎小管細(xì)胞凋亡降低,促進(jìn)了線粒體自噬,有效減輕了腎IRI,改善了腎功能。

腎臟IRI中,線粒體自噬是否作為一種保護(hù)性生理過(guò)程仍然存在爭(zhēng)議[24]。研究表明,線粒體自噬在肝臟和肺中起保護(hù)作用。而在大腦[25]和心臟中,線粒體自噬的作用較為復(fù)雜。本研究發(fā)現(xiàn),與S組比較,IR組自噬相關(guān)蛋白(BNIP3和LC3-Ⅱ)表達(dá)明顯下調(diào),同時(shí)伴有Cr和BUN水平、腎小管損傷評(píng)分及凋亡指數(shù)升高,提示腎功能和腎臟的病理?yè)p傷仍然處于加重狀態(tài)。因此,作者推測(cè)可能存在自噬不足以對(duì)抗腎缺血再灌注中的細(xì)胞損傷,其具體原因仍需要進(jìn)一步研究。然而,在缺血再灌注后使用PTE可以明顯減輕腎小管損傷,降低腎小管細(xì)胞凋亡指數(shù),保護(hù)腎功能,且其與劑量相關(guān);同時(shí),伴有BNIP3和LC3-Ⅱ的表達(dá)增加,即線粒體自噬明顯增加,說(shuō)明PTE在腎IRI中能促進(jìn)線粒體自噬,減少炎癥細(xì)胞因子的釋放,抑制氧化應(yīng)激及腎小管細(xì)胞凋亡,進(jìn)而減輕腎損傷。

綜上所述,PTE可以有效減輕腎IRI,其機(jī)制可能是通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥細(xì)胞因子釋放、抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)線粒體自噬來(lái)改善IRI。