胡 志,付 橋,張 煒,孫 偉,徐 律,陳一衍,褚 浩

(武漢市第三醫(yī)院泌尿外科,武漢 430000)

睪丸缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)被認(rèn)為是睪丸扭轉(zhuǎn)和退扭的潛在機(jī)制,睪丸缺血因?yàn)橛醒醮x受損會(huì)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞死亡,睪丸再灌注后由于活性氧(ROS)的產(chǎn)生和局部毛細(xì)血管功能障礙,組織進(jìn)一步損傷,誘導(dǎo)DNA損傷,使精子發(fā)生永久性損傷[1-2]。但目前臨床上還沒有緩解睪丸IRI的有效藥物。

研究發(fā)現(xiàn),自噬在多種組織器官的IRI過程中具有保護(hù)作用,自噬受損會(huì)增加再灌注期間細(xì)胞的損傷[3]。自噬是溶酶體分解代謝過程,能消除老化的細(xì)胞器和大分子蛋白,為細(xì)胞器更新和細(xì)胞修復(fù)提供原料和營養(yǎng)[4]。自噬受缺氧、滲透性和活性氧等因素影響,在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用[5]。自噬是IRI的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,不僅可用于抑制大鼠腎小管凋亡和減輕腎IRI期間的腎功能損害,還具有神經(jīng)保護(hù)作用,能夠減輕心肌IRI[6-7]。在適度范圍內(nèi)增強(qiáng)自噬活性也許能補(bǔ)償線粒體損傷,并有助于IRI中的蛋白平衡,恢復(fù)受損的自噬通量可能是緩解IRI的有效途徑[8]。因此,為了探究自噬在睪丸組織的IRI過程中扮演的角色,本研究構(gòu)建小鼠精原細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷(hypoxia reoxygenation injury,H/RI)模型,模擬睪丸組織的IRI階段,從多方面觀察自噬對大鼠睪丸組織IRI的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠精原細(xì)胞GC-1 spg購自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司,胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)、dNTP Mix和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,自噬激動(dòng)劑RAPA和自噬抑制劑3-MA購自美國MCE公司,活性氧檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,硫氰酸熒光素標(biāo)記的鈣離子依賴磷脂結(jié)合蛋白/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司,兔抗LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、p62、Bcl-2、Bax和GAPDH購自武漢貝茵萊生物科技,兔抗caspase-3購自德國CST公司。

1.2 儀器

311型CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司,DMIL LED倒置熒光顯微鏡購自德國Leica公司,Forma-8000三氣培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher Scientific公司,AMR-100酶標(biāo)儀、Nano-300超微量分光光度計(jì)購自杭州奧盛儀器有限公司,NovoCyte流式細(xì)胞儀購自美國Acea公司,Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀購自上海天能生命科學(xué)有限公司,GE48527型PCR儀購自杭州柏恒科技有限公司,CFX-Connect 96熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

將融化后的細(xì)胞懸液400×g離心3 min,棄上清液后重懸,在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。打開T25培養(yǎng)瓶,瓶口過火,丟棄培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)液,用PBS洗去殘留。培養(yǎng)瓶加入0.25%胰酶,37 ℃消化,用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察,細(xì)胞收回突起變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,倒掉與細(xì)胞脫離的胰酶,加入培養(yǎng)基潤洗,使細(xì)胞脫壁并分散,制成細(xì)胞懸液,分裝。

1.3.2細(xì)胞模型構(gòu)建

將完成傳代的細(xì)胞分為4組:對照組、模型組、自噬激動(dòng)劑干預(yù)組和自噬抑制劑干預(yù)組。收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為5×105/孔。對照組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)24 h。模型組細(xì)胞按照文獻(xiàn)[9],用預(yù)先缺氧的無血清培養(yǎng)基在5% CO2、1% O2和94% N2的三氣培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,構(gòu)建H/RI模型。自噬激動(dòng)劑干預(yù)組在模型構(gòu)建成功后,將細(xì)胞移至常氧培養(yǎng)箱復(fù)氧2 h后,添加50 nmol/L的自噬激動(dòng)劑RAPA常規(guī)孵育12 h。自噬抑制劑干預(yù)組在細(xì)胞復(fù)氧2 h后,添加5 mmol/L的自噬抑制劑3-MA常規(guī)孵育12 h。

1.3.3MTT檢測各組細(xì)胞增殖活力

調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為3×103/孔,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜,使細(xì)胞貼壁。按照1.3.2不同分組處理細(xì)胞,培養(yǎng)24 h后加入10 μL MTT 溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后棄去上清液,加入二甲基亞砜(DMSO)溶解液充分溶解結(jié)晶物。用分光光度計(jì)測量各孔的吸光度(A)值。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞ROS水平

收集各組細(xì)胞懸浮于10 μmol/L的活性氧熒光探針(DCFH-DA)中,濃度為1×106/mL,37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。DCFH-DA和細(xì)胞充分接觸后,用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用PBS重懸細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測ROS。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡水平

收集各組細(xì)胞,重懸使細(xì)胞濃度為1×106/孔,400×g離心5 min,棄上清液,重懸于200 μL PBS。加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC和10 μL PI,4 ℃避光孵育30 min;加入300 μL PBS,進(jìn)行流式檢測。

1.3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測細(xì)胞中自噬和凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平

取細(xì)胞約1×106個(gè),加1 mL TRIzol提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將合成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性5 s,56 ℃退火10 s,72 ℃延伸25 s,共40個(gè)循環(huán)。其中GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行樣品間的校正,使用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因mRNA表達(dá)水平,各目標(biāo)基因引物見表1。

表1 引物序列

1.3.7Western blot法檢測自噬和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取各組細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液,用蛋白提取試劑盒提取總蛋白,并用BCA法檢測蛋白濃度。取20 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。4 ℃封閉過夜,分別加入兔抗Beclin1、Bax、caspase-3、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、Bcl-2和GAPDH單克隆抗體(1∶1 000),室溫孵育1 h。加入二抗,室溫孵育1 h。洗膜后加入化學(xué)發(fā)光試劑顯色,讀取條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測各組細(xì)胞增殖能力

與對照組比較,模型組小鼠精原細(xì)胞增殖能力明顯下降(P<0.01),自噬激動(dòng)劑干預(yù)組小鼠精原細(xì)胞增殖能力較模型組明顯提高(P<0.01),自噬抑制劑干預(yù)組小鼠精原細(xì)胞增殖能力較模型組明顯降低(P<0.01),見圖1。

1:對照組;2:模型組;3:自噬激動(dòng)劑干預(yù)組;4:自噬抑制劑干預(yù)組;a:P<0.01,與對照組比較;b:P<0.01,與模型組比較。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞ROS水平

與對照組比較,模型組小鼠精原細(xì)胞ROS水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,自噬激動(dòng)劑干預(yù)組小鼠精原細(xì)胞ROS水平明顯降低(P<0.01),自噬抑制劑干預(yù)組小鼠精原細(xì)胞ROS水平明顯升高(P<0.01),見圖2。

A:流式細(xì)胞圖;B:定量分析圖;1:對照組;2:模型組;3:自噬激動(dòng)劑干預(yù)組;4:自噬抑制劑干預(yù)組;a:P<0.01,與對照組比較;b:P<0.01,與模型組比較。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率

與對照組比較,H/RI模型組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01);與模型組比較,自噬激動(dòng)劑干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01),而自噬抑制劑干預(yù)組細(xì)胞凋亡率則明顯升高(P<0.01),見圖3。

A:流式細(xì)胞圖;B:定量分析圖;1:對照組;2:模型組;3:自噬激動(dòng)劑干預(yù)組;4:自噬抑制劑干預(yù)組;a:P<0.01,與對照組比較;b:P<0.01,與模型組比較。

2.4 qPCR檢測各組細(xì)胞中Beclin1、Bax、Bcl-2的mRNA表達(dá)水平

與對照組比較,模型組小鼠精原細(xì)胞中Beclin1和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯下降,Bax mRNA表達(dá)水平明顯上升(均P<0.01);與模型組比較,自噬激動(dòng)劑干預(yù)組小鼠精原細(xì)胞中Beclin1和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯上升(P<0.01),Bax mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.01);與模型組比較,自噬抑制劑干預(yù)組小鼠精原細(xì)胞中Beclin1和Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.01),Bax mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01),見圖4。

a:P<0.01,與對照組比較;b:P<0.01,與模型組比較。

2.5 Western blot檢測各組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

與對照組比較,模型組小鼠精原細(xì)胞Beclin1、Bax、caspase-3表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值水平明顯上升(P<0.01),p62和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01);與模型組比較,自噬激動(dòng)劑干預(yù)組小鼠精原細(xì)胞Beclin1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值均明顯上升(P<0.01),p62、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.01);與模型組比較,自噬抑制劑干預(yù)組Beclin1、Bcl-2蛋白表達(dá)水平和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值均明顯下降(P<0.01),p62、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯上升(均P<0.01),見圖5。

A:Western blot圖;B:定量分析圖;1:對照組;2:模型組;3:自噬激動(dòng)劑干預(yù)組;4:自噬抑制劑干預(yù)組;a:P<0.01,與對照組比較;b:P<0.01,與模型組比較。

3 討 論

自噬是細(xì)胞存活的重要機(jī)制,在細(xì)胞分化、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞存活和死亡中發(fā)揮著重要作用[10]。自噬在哺乳動(dòng)物組織中發(fā)揮著多種生理和病理作用[11]。在生理?xiàng)l件下,自噬維持在基礎(chǔ)水平,但當(dāng)細(xì)胞受到營養(yǎng)缺乏、缺氧DNA損傷、細(xì)胞毒性劑等刺激時(shí),細(xì)胞自噬會(huì)上調(diào)以減輕應(yīng)激引起的損傷,幫助細(xì)胞生存[8]。而本研究中模型組細(xì)胞自噬在一定程度上被激活,進(jìn)一步為自噬減輕缺氧造成的損傷提供了理論支持。因此,本文利用公認(rèn)的自噬激動(dòng)劑RAPA[12]和抑制劑3-MA[13],對自噬與睪丸組織IRI之間的關(guān)系進(jìn)行了深入研究。RAPA能夠抑制雷帕霉素靶蛋白的表達(dá),激活自噬[14]。3-MA通過阻斷自噬體形成和阻止成核階段來抑制自噬[15]。本研究中H/RI模型組細(xì)胞自噬過程被激活時(shí),細(xì)胞增殖能力較模型組明顯上升,而自噬被抑制時(shí),增殖能力較模型組下降,說明調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬能夠影響H/RI模型細(xì)胞增殖,這與之前的研究一致[16]。

研究表明,自噬的激活能改善年輕大鼠的腎功能,減少腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和腎組織的損傷評分,對腎IRI損傷發(fā)揮保護(hù)作用[17]。本研究中,自噬在RAPA的激活下,細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值、Beclin1蛋白水平較模型組升高,p62水平較模型組下降。LC3是自噬小體成熟標(biāo)志蛋白,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)變,促進(jìn)自噬體的形成[18]。Beclin1作為自噬調(diào)控基因,其表達(dá)水平增加能夠誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。p62作為自噬降解的特異性受體,可作為自噬標(biāo)志物[19]。而自噬在3-MA的抑制下,Beclin1蛋白水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白比值較模型組下降,進(jìn)而抑制自噬體的形成。且當(dāng)自噬被抑制時(shí),p62會(huì)不斷累積,與LC3結(jié)合形成復(fù)合物,負(fù)性調(diào)節(jié)自噬活性[20]。

本研究中,在RAPA干預(yù)下,自噬被激活,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平較模型組明顯上升,caspase-3和促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平較模型組下降。這減少了因?yàn)槿毖獙?dǎo)致Bax向線粒體外膜易位,抑制了線粒體外膜通透性增加觸發(fā)的內(nèi)源性凋亡途徑,從而抑制了caspase-3級聯(lián)反應(yīng),使細(xì)胞凋亡率明顯下降[21]。該結(jié)果證明了增強(qiáng)自噬可以避免因ROS過度釋放導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡[22],修復(fù)精原細(xì)胞組織H/RI損傷。

此外,激活自噬可清除過量ROS,減輕睪丸組織H/RI[23]。IRI后ROS的大量積累會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激,阻礙線粒體功能,破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)環(huán)境,損害自噬小體的清除[24-25]。本研究中,RAPA干預(yù)時(shí),細(xì)胞ROS水平較模型組明顯降低,細(xì)胞凋亡率較模型組明顯下降;而3-MA干預(yù)時(shí),ROS在細(xì)胞內(nèi)大量積累,細(xì)胞凋亡率較模型組明顯上升。

綜上所述,本研究驗(yàn)證了增強(qiáng)自噬可以一定程度上修復(fù)小鼠精原細(xì)胞H/RI,抑制細(xì)胞凋亡,為治療睪丸組織IRI提供理論基礎(chǔ)。