高國香 王 艷,2 張 婷 李 錚

鳳仙花霜霉病的病原菌鑒定

高國香1王 艷1,2張 婷1李 錚1

（1.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院 甘肅蘭州 730000；2.西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 甘肅蘭州 730000）

為鑒定鳳仙花霜霉病的病原菌類型，對病原菌進行常規(guī)形態(tài)學鑒定，并提取菌物DNA，利用cox2-mtDNA和ITS、LSUrDNA基因序列進行分子鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確其分類地位。形態(tài)學鑒定結(jié)果表明，病原菌孢囊梗長90.00 μm～530.12 μm（平均435.94 μm），寬8.00 μm～15.00 μm（平均10.82 μm），主軸長50.05 μm～340.70 μm（平均164.88 μm），占全長1/3～2/3，基部略膨大，平均寬12.65 μm；孢子囊淡褐色，圓形或橢圓形，長11.37 μm～28.55 μm（平均17.30 μm），寬12.00 μm～21.15 μm（平均15.00 μm），分布較多，符合軸霜霉屬菌物的形態(tài)特征。cox2-ITS-LSU基因序列串聯(lián)系統(tǒng)發(fā)育樹表明，病原菌與鳳仙花軸霜霉（）聚類在一起，相似度為100%。因此，采集于甘肅省隴西縣首陽藥圃園內(nèi)的鳳仙花霜霉病病原菌鑒定為鳳仙花軸霜霉。

鳳仙花；霜霉?。徊≡b定；鳳仙花軸霜霉

鳳仙花（L.）為鳳仙花科鳳仙花屬一年生草本植物，因其花朵艷麗，培育方法簡單，現(xiàn)普遍作為園藝觀賞花卉，我國各地庭院廣泛栽培[1]，主產(chǎn)于江蘇、浙江、河北、安徽等地[2]。鳳仙花霜霉病是鳳仙花最主要的病害之一，自1877年在德國的野生鳳仙花（）上首次發(fā)現(xiàn)霜霉病以來，其在世界范圍內(nèi)廣泛流行[4]，已侵染同屬的水金鳳、齒萼水金鳳、峨山水金鳳等多種植物[5]。鳳仙花霜霉病是一種極具破壞性的葉面病害，尤其在潮濕、夜間涼爽的環(huán)境下容易發(fā)病，一旦發(fā)病便迅速傳播。發(fā)病時鳳仙花葉片出現(xiàn)白色霉層，嚴重時會侵染整株植物，葉片、葉柄、莖稈均布滿白色至灰白色霜狀霉層，花朵和葉片凋落，甚至植株倒伏、枯死，降低植株觀賞性，造成嚴重的經(jīng)濟損失[6]。本研究通過形態(tài)學和分子生物學手段，對鳳仙花霜霉病病原菌進行了鑒定，從而為病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標樣采集

于2020年8月在甘肅省定西市隴西縣首陽鎮(zhèn)首陽藥圃園（104°24′E，35°50′N，海拔1 904 m）調(diào)查鳳仙花霜霉病的病害。記錄病害植株的癥狀，拍照，采集標樣并置于裝有冰袋的泡沫箱中，帶回實驗室備用，將部分標樣壓制成標本留存。

1.2 病原菌形態(tài)鑒定

從低溫保存的發(fā)病葉片上輕輕刮取新鮮有活力的霉層，以蒸餾水為浮載劑制成玻片，置于顯微鏡（BX51T-32H01，Olympus，日本）下，觀察病原菌形態(tài)，測定大小并拍照。測定項目包括孢囊梗長和寬、主軸長、基部寬、分枝數(shù)、末枝長，以及孢子囊長和寬，并計算孢囊梗主軸占全長的比例，每個項目測定100個數(shù)據(jù)。

1.3 吸器和卵孢子的觀察

采用NaOH組織透明法：用直徑1 cm的打孔器在回軟葉片的霜霉病斑處打取圓片，置于燒杯中，加入10％NaOH溶液少許，煮沸5 min～7 min，至葉片透明但未消解為止，用挑針輕輕地劃開葉片細胞，在細胞之間鏡檢吸器的形狀及卵孢子有無、形狀、大小、顏色等。

1.4 DNA提取、PCR擴增和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

根據(jù)尹玲等[7]的研究，利用一種改良的CTAB法提取病原菌的DNA。利用引物對cox2-F/cox2-R[8]、ITS300/ITS4[9]和LROR/LR6-O[10]分別擴增病原菌的cox2-mtDNA和ITS、LSUrDNA片段。PCR反應體系為20 μL，其中，2×TaqPCRMix 10 μL，模板DNA2 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 6 μL，混勻離心，置于PCR儀（Agilent Sure Cycler 8800，博日科技有限公司）進行擴增。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸1 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得目標產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化和測序。登錄GenBank，將所得序列在NCBI中進行比對，下載相關(guān)序列，利用MEGAX軟件中的鄰接法（N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病癥狀

在病害發(fā)生初期，病原菌侵染葉片，葉片背面產(chǎn)生白色霜狀霉層（見圖1 a），相應的葉片正面出現(xiàn)黃綠色病斑（見圖1 b），霉層較厚的葉片正面也會出現(xiàn)白色霜霉（見圖1 c）。之后，霉層逐漸擴大、增厚（見圖1 d），葉片正面呈黃綠色。發(fā)病嚴重時，霉層逐漸變成灰白色，侵染整個葉片、葉柄和莖稈，植株布滿灰白色霉層，葉片向下卷曲，花朵脫落，莖稈光禿，在持續(xù)潮濕和陰冷的條件下植株會發(fā)生倒伏或整株枯萎死亡，嚴重影響植株的觀賞性。

a.發(fā)病初期葉片正面癥狀；b.發(fā)病初期葉片背面癥狀；c.霉層較厚的葉片正面出現(xiàn)霉層；d.發(fā)病盛期霜狀霉層增厚。

圖1 鳳仙花霜霉病病害癥狀

2.2 病原菌形態(tài)學特征

病原菌孢囊梗直立，分枝發(fā)達，近直角（圖2 a），頂部二叉狀分枝2次～7次，頂端鈍圓（圖2 b）。孢囊梗長90.00 μm～530.12 μm（平均435.94 μm），寬8.00 μm～15.00 μm（平均10.82 μm），主軸長50.05 μm～340.70 μm（平均164.88 μm），占全長的1/3～2/3，基部略膨大（見圖2 c），平均寬12.65 μm。孢子囊為淡褐色，呈圓形或橢圓形，長11.37 μm～28.55 μm（平均17.30 μm），寬12.00 μm～21.15 μm（平均15.00 μm），分布較多（見圖2 d～f）。吸器透明，呈不規(guī)則形（見圖2 g～h），卵孢子未見。

a.孢囊梗；b.孢囊梗頂部；c.孢囊?；浚籨～f.孢子囊；g～h.吸器。

圖2 鳳仙花霜霉病病原菌形態(tài)

本研究中的鳳仙花霜霉病病原菌孢囊梗長度（90.00 μm～530.12 μm），與《中國真菌志·第六卷·霜霉目》記載的鳳仙花軸霜霉孢囊梗長（425.00 μm～820.12 μm）相差較大，同2014年夏威夷群島報道的鳳仙花軸霜霉孢囊梗長度（94.00 μm～300.00 μm）更為接近[12]。以上三者兩兩之間孢囊梗長度差異較大，其余指標則無明顯差別，根據(jù)形態(tài)和寄主，擬鑒定本研究中的鳳仙花霜霉病病原菌為鳳仙花軸霜霉（）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序得到的cox2、ITS和LSU基因序列分別用DNASTAR中的SeqMan進行拼接，其長度分別為416 bp、1 409 bp和1 213 bp。將它們分別在NCBI庫中進行BLAST檢索，3個序列均與鳳仙花軸霜霉的相似度最高，分別為97.36%、99.72%和99.92%。下載相關(guān)序列（見表1），在MEGAX軟件中利用鄰接法（N-J）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

構(gòu)建cox2-ITS-LSU多基因序列聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，發(fā)育樹分為兩個大支，一支為寄生在鳳仙花屬不同植物上的鳳仙花軸霜霉的4個菌株，另一支為葡萄生單軸霉（）、本菌和水金鳳上的鳳仙花軸霜霉。本菌FXHSM與來自水金鳳上的鳳仙花軸霜霉相似度最高，為100%。結(jié)合形態(tài)學特征，將其鑒定為鳳仙花軸霜霉。

表1 本研究構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用序列GenBank菌株號和登錄號

圖3 菌株FXHSM的cox2-ITS-LSU基因片段聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

鳳仙花是一種重要的觀賞植物，但是由于種植越來越多，病害發(fā)生也越來越多，而霜霉病是鳳仙花最嚴重的病害。為防止病害的發(fā)生，近年來，科學家們培育出了抗鳳仙花霜霉病的雜交品種——非洲鳳仙，其花色艷麗，易于栽培管理，有很高的生產(chǎn)性。發(fā)生在鳳仙花上的軸霜霉屬菌物有三種，分別為、和，明確鳳仙花霜霉病病原菌的類型，有助于進一步了解病害的發(fā)生、發(fā)展及致病機理，以便快速采取相應的防治措施。

本研究通過形態(tài)學觀察和指標測量顯示病原菌孢囊梗直立，分枝近直角，符合軸霜霉屬的特征。但是本研究測得的孢囊梗長度為90.00 μm～530.12 μm（平均435.94 μm），與《中國真菌志·第六卷·霜霉目》中記載的發(fā)生在我國西南地區(qū)的鳳仙花軸霜霉孢囊梗長度（425.00 μm～820.12 μm）相比明顯較短，而2014年夏威夷群島報道的鳳仙花霜霉病病原菌孢囊梗長度為94.00 μm～300.00 μm。三者均為寄生在鳳仙花上的軸霜霉，但孢囊梗長度有較大的差別，可能與病原菌生長的地理環(huán)境、測量中的差異有關(guān)。cox2-ITS-LSU多基因序列聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，本研究中的病原菌在分子水平與鳳仙花軸霜霉相應序列的相似性較高，結(jié)合田間癥狀，確定了甘肅省隴西縣首陽藥圃園內(nèi)的鳳仙花霜霉病病原菌為鳳仙花軸霜霉。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志第47卷第二分冊[M].北京:科學出版社,2002:29.

[2]陳秀蓉.甘肅省藥用植物病害及其防治[M].北京:科學出版社,2015.

[4]G?RG M,PLOCH S,KRUSE J,et al.Revision of(Oomycota, Peronosporales) parasitic to[J].Mycological Progress,2017,16(8):791-799.

[5]余永年.中國真菌志·第六卷·霜霉目[M].北京:科學出版社,1998.

[6]呂三三.抗霜霉病能手:非洲鳳仙“領航”系列[J].中國花卉園藝,2020(14):36-37.

[7]尹玲,張雅麗,盧江.葡萄霜霉菌基因組DNA不同提取方法的比較[J].中外葡萄與葡萄酒,2010(3):4-7.

[8]CHOI Y J,THINES M.Host jumps and radiation, not co-divergence drives diversification of obligate pathogens. A case study in downy mildews and Asteraceae[ J].PloS One,2015,10(7):e0133655.

[9]WHITE T J,BRUNS T,LEE S,et al.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics[J].PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,1990:315-322.

[10]LEE J S,SHIN H D,CHOI Y J.Rediscovery of seven long-forgotten species ofand(Oomycota)[J].Mycobiology,2020,48(5):331-340.

[11]吳婷婷,馬凱歌,包程偉,等.鳳仙花花葉病的病原鑒定[J].植物病理學報,2022,52(2):291-295.

[12]CROUCH J A,KO M P,MCKEMY J M.First report of impatiens downy mildew outbreaks causedbythroughout the Hawai'ian Islands[J].Plant Disease,2014,98(5):696.

S436.8

A

2095-1205(2023)11-25-03

10.3969/j.issn.2095-1205.2023.11.07

國家自然科學基金（31960004）；中央本級重大增減支項目“名貴中藥資源可持續(xù)利用能力建設”（2060302）；西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心開放基金項目（Xbzzy-2022- 02）；道地藥材生態(tài)種植及質(zhì)量保障項目（國中醫(yī)藥科技〔2020〕153號）；甘肅省2021年度優(yōu)秀研究生“創(chuàng)新之星”（2021CXZX753）

高國香（1997—），女，漢族，甘肅蘭州人，碩士研究生在讀，研究方向為藥用植物保護與微生物開發(fā)利用。

王艷（1978—），女，漢族，安徽碭山人，博士研究生，副教授，研究方向為藥用植物保護與微生物開發(fā)利用。