王旭東，李秋月，王佳麗，姬 穎，馬曉倩，李 媛，梁俊玉

（西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070）

目前，中藥材種植和倉儲過程中出現(xiàn)的病蟲害問題，使得中藥材的藥用價值和商品價值大幅降低甚至喪失[1]。赤擬谷盜Triboliumcastaneum是中藥材儲存中發(fā)現(xiàn)的主要害蟲類群，其成蟲身上的腺體能分泌含有致癌物質(zhì)的臭液，導致產(chǎn)品結塊、變色、發(fā)臭和腐敗，造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。馬鈴薯腐爛莖線蟲Ditylenchusdestructor作為常見的植物寄生線蟲，寄主廣泛，可掠奪寄主營養(yǎng)，并造成機械損傷，是造成當歸麻口病的重要病原物之一，為害當歸生長周期，造成當歸減產(chǎn)，已成為制約當歸種植業(yè)發(fā)展的首要病害[3,4]。當前針對赤擬谷盜多采用擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殺蟲劑和磷化氫、溴甲烷熏蒸劑等化學藥劑進行防治[5,6]，針對馬鈴薯腐爛莖線蟲主要是利用鹵代烴類、有機磷類、氨基甲酸酯類等化學藥劑對線蟲進行防治[7]。但化學藥劑的長期使用易引起人畜中毒、農(nóng)藥殘留污染環(huán)境等問題[8]，因此開發(fā)環(huán)保、高效的新型殺蟲藥物，對中藥材種植及倉儲害蟲的綠色防控具有重要意義。

自Strobel 等[9]從短葉紅豆杉的內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae中得到紫杉醇以來，植物內(nèi)生真菌迅速被國內(nèi)外研究者關注，成為研究熱點。植物內(nèi)生真菌種類豐富，可代謝產(chǎn)生結構多樣和活性豐富的天然產(chǎn)物，與宿主植物具有相同或相似的生物活性，易于分離純化和培養(yǎng)，并可大量發(fā)酵生產(chǎn)，可以很好地發(fā)揮植物源殺蟲劑的優(yōu)勢。本試驗選取的千里香杜鵑Rhododendronthymifolium、頭花杜鵑Rhododendron capitatum、烈香杜鵑Rhododendronanthopogonoide、隴蜀杜鵑Rhododendronprzewalskii具有抗炎鎮(zhèn)痛、免疫、殺蟲等多方面的藥理活性。千里香杜鵑揮發(fā)油對赤擬谷盜和嗜卷書虱Liposcelisbostrychophila具有一定的觸殺作用，其植物活性成分具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性[10]。頭花杜鵑對煙草甲Lasioderma serricorne、赤擬谷盜和嗜卷書虱也表現(xiàn)出一定的毒殺作用[11]。烈香杜鵑資源豐富，具有清熱解毒、健胃消腫的功效，是藏藥達理的主要成分之一[12,13]。目前從烈香杜鵑莖和葉的醋酸乙酯部位分離出多種類型的化合物，如三萜類、黃銅類，香豆素類等[14,15]。此外，烈香杜鵑揮發(fā)油也具有很高的藥用價值，對草原毛蟲Gynaephoramenyuanensis表現(xiàn)出較強的毒殺和抑制活性[16]。孫景云[17]從隴蜀杜鵑中分離得到18 株內(nèi)生真菌，對抗單胺氧化酶、抗乙酰膽堿酯酶均有不同程度的活性作用，并對朱砂葉螨Tetranychuscinnabarinus表現(xiàn)出良好的毒殺作用，此外，還能夠抑制辣椒疫霉菌PhytophthoracapsiciLeonian 的生長。目前關于杜鵑屬植物內(nèi)生真菌對赤擬谷盜和馬鈴薯腐爛莖線蟲的防治作用報道較少，所以本試驗對四種杜鵑屬植物內(nèi)生真菌進行分離，并研究其粗提物對赤擬谷盜的觸殺和拒食作用以及對馬鈴薯腐爛莖線蟲的毒殺作用，初步篩選出具有良好抗蟲活性的菌株，對其進行形態(tài)學與分子生物學鑒定，為杜鵑屬植物內(nèi)生真菌防治赤擬谷盜和馬鈴薯腐爛莖線蟲以及發(fā)展中藥材生態(tài)種植和綠色倉儲進行基礎研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

千里香杜鵑、頭花杜鵑、烈香杜鵑、隴蜀杜鵑植物樣品于2021 年6 月采自甘肅省武威市天祝縣石門鎮(zhèn)，由西北師范大學生命科學學院梁俊玉副教授鑒定。樣品自然陰干，存放于西北師范大學生命科學學院中藥材質(zhì)量研究實驗室。樣品采集信息見表1。

表1 杜鵑屬植物樣品采集信息Table 1 Sample collection information of Rhododendron

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械獨資工廠）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海新諾儀器設備有限公司）；萬分之一分析天平（德國，賽多利斯）；超凈工作臺（ESCO 公司）；立式高壓蒸汽滅菌鍋（日本Hirayama）；大容量恒溫振蕩箱（江蘇太倉市試驗設備廠）；循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）；正己烷、二甲基亞砜、吐溫-20（購自煙臺市雙雙化工有限公司）；含灰葡萄孢菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基；96 孔細胞板。

1.2 試蟲飼養(yǎng)

赤擬谷盜試蟲由西北師范大學生命科學學院中藥質(zhì)量研發(fā)及產(chǎn)品開發(fā)實驗室提供，經(jīng)西北師范大學生命科學學院梁俊玉副教授鑒定確認。赤擬谷盜飼養(yǎng)于裝有面粉與酵母粉（10∶1）的0.5 L 玻璃培養(yǎng)瓶中，紗布封口，置于29 ℃、相對濕度75%±5%的恒溫培養(yǎng)箱中進行全黑培養(yǎng)。所選試蟲均為羽化后1～2 周的成蟲，且不分雌雄。

采用貝爾曼漏斗法從患麻口病的當歸中分離得到馬鈴薯腐爛莖線蟲[18]，用0.5%的次氯酸鈉對馬鈴薯腐爛莖線蟲懸浮液進行消毒處理，然后離心（2 min，4000 r/min），棄去上層的消毒液，加入無菌水振搖后再離心，棄去無菌水，重復處理3 次，得到無菌的馬鈴薯腐爛莖線蟲懸浮液，然后接到長滿灰葡萄孢菌菌落的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，在溫度為25 ℃，相對濕度為85%±5%的培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)。試蟲均為培養(yǎng)15 d 左右的馬鈴薯腐爛莖線蟲。

1.3 內(nèi)生真菌的分離與純化

取4 種新鮮植物的枝、葉，無菌水沖洗干凈。枝干部分切成0.5 cm3的正方體小塊，葉片切成0.5 cm2的小片；然后將其置于75%乙醇中浸泡3 min，無菌水沖洗3 次，0.1% HgCl2溶液浸泡0.5 min，無菌水沖洗3 次，切去邊緣材料使植物的截面充分暴露出來，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～7 d。運用漂洗檢驗法，將最后一次清洗所得無菌水涂布于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)3～7 d，觀察該培養(yǎng)基是否有菌落長出，以此驗證表面消毒是否徹底；每種供試植物材料進行3 次重復[19]。待長出菌絲后，轉(zhuǎn)接至新的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基中，逐步純化，對已經(jīng)純化的菌落編號，記錄。試驗過程均在超凈工作臺下完成。

1.4 內(nèi)生真菌粗提物提取

參照孫景云[17]試驗方法，無菌條件下將分離所得22 株菌分別接至裝有100 mL 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基PDB（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g）的250 mL 錐形瓶中（每種菌培養(yǎng)10 瓶），發(fā)酵條件為：接種量10%，起始pH 為自然pH，裝液量100 mL，搖床（28 ℃，170 r/min）培養(yǎng)15 d。待培養(yǎng)結束，進行減壓抽濾，獲得菌液和菌絲體。菌液通過減壓蒸餾得到菌液粗提物浸膏，菌絲體經(jīng)甲醇加熱回流提取3 次，每次加入甲醇的量與菌絲體的比例分別為10∶1、8∶1、6∶1，合并3 次的提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收，得到菌絲體甲醇粗提物浸膏。共得到44 個內(nèi)生真菌粗提物，將所得提取物置于4 ℃冰箱中冷藏備用。

1.5 抗蟲活性測定

1.5.1 赤擬谷盜觸殺活性測定 參照點觸法[20]測定內(nèi)生真菌粗提物對赤擬谷盜的觸殺活性。用丙酮溶解待測內(nèi)生真菌粗提物，根據(jù)預試驗配制成濃度為30%、15%、7.5%、3.75%、1.875%的待測溶液，將盛有試蟲的培養(yǎng)皿置于冰袋，每次10 頭健全的且大小一致的成蟲（不分雌雄），待試蟲不再活動，用移液器移取0.5 μL 待測樣品的丙酮稀釋液于試蟲的前胸背板上，然后每10 頭試蟲轉(zhuǎn)移至半徑為1 cm，高為5.5 cm玻璃瓶中，置于溫度28～30 ℃，相對濕度75%±5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。丙酮為陰性對照；除蟲菊酯為陽性對照，活性數(shù)據(jù)來源于參考文獻，其活性測定方法與本試驗一致。每個濃度重復5 次。24 h 后記錄死亡/存活情況。采用IBM SPSS V26.0 統(tǒng)計軟件計算半數(shù)致死劑量LD50。

1.5.2 赤擬谷盜拒食活性測定 赤擬谷盜拒食活性測定參照文獻[21]并進行改進，取內(nèi)生真菌粗提物待測樣品加80%乙醇溶解，根據(jù)預試驗配制成2 個濃度梯度（2 mg/mL、1 mg/mL），定容至2 mL，再分別加入0.8 g 面粉，攪拌均勻，配制成不同濃度的粗提物待測樣品面粉混濁液，然后吸取200 μL 面粉混濁液至干凈培養(yǎng)皿上，置于通風櫥中過夜，再置于溫度29～30 ℃，相對濕度75%±5%的培養(yǎng)箱中平衡水分后形成拒食活性測試面餅。每個計數(shù)瓶中放入1 個拒食活性測試面餅及20 只饑餓24 h 的試蟲（依次稱量空瓶重量、加入面餅重量以及放入20 頭試蟲后的總重量），最后將計數(shù)瓶置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 d 后，依次稱取總瓶重量、挑出試蟲后的重量及空瓶重量，最后計算試蟲取食量，處理組每個濃度重復5 次。以等體積的80%乙醇與等量面粉混勻作空白對照；以昆蟲拒食劑川楝素為陽性對照，活性數(shù)據(jù)來源于參考文獻，其活性測定方法與本試驗一致。

拒食率按如下公式計算：拒食率（FDI）（%）＝（C―T）/T×100，C＝對照組面餅消耗量；T＝處理組面餅消耗量。

1.5.3 馬鈴薯腐爛莖線蟲抗蟲活性測定 采用藥液浸泡法[22]，將待測內(nèi)生真菌粗提物用5%吐溫-20、3% DMSO 和蒸餾水配置成一定濃度的溶液備用，通過預試驗配制成濃度為2%、1%、0.5%、0.25%、0.125%的待測溶液。96 孔板中注入10 μL 線蟲懸浮液（每10 μL 線蟲懸浮液，約有80～120 只活性良好的線蟲）及90 μL 不同濃度的樣品溶液，共計100 μL，混合均勻后置于25 ℃，濕度為85%±5%的培養(yǎng)箱中。每組處理重復5 次。以等體積的5%吐溫-20 和3% DMSO 為陰性對照，以克百威為陽性對照，活性數(shù)據(jù)來源于參考文獻，其活性測定方法與本試驗一致。24 h 后吸去上層藥液，加入100 μL 蒸餾水，處理24 h 后檢查各處理組的線蟲死亡/存活情況，采用IBM SPSS V26.0 統(tǒng)計軟件計算半致死濃度LC50。

1.6 內(nèi)生真菌的形態(tài)學鑒定

采用點植法將菌株接種至PDA 培養(yǎng)基上[23]，28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)3～5 d，待菌株生長為單菌落，觀察菌株的菌落特征，并做相應記錄。顯微觀察：在潔凈載玻片上滴加1～2 滴乳酸酚棉蘭染色液，用解剖針從菌落邊緣輕輕挑取少量帶有孢子的菌絲置于染色液中，加蓋潔凈的蓋玻片，輕輕按壓排除氣泡，制成裝片觀察。通過光學顯微鏡觀察菌絲形態(tài)及產(chǎn)孢結構。

1.7 內(nèi)生真菌的分子生物學鑒定

采用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）測序的方法。刮取適量待測菌株的新鮮菌絲于液氮中研磨，采用改良CTAB 法[24,25]提取其基因組DNA。將提取得到的DNA 樣本送至楊凌天潤奧科生物科技有限公司進行后期純化和測序工作，其中測序引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。依據(jù)測序結果，在NCBI 數(shù)據(jù)庫對測序所得的ITS 序列進行BLSAT 比對，在MEGA 7.0 軟件中構建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定內(nèi)生真菌的分類地位。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

從千里香杜鵑、頭花杜鵑、烈香杜鵑、隴蜀杜鵑4 種杜鵑屬植物的枝和葉中共分離得到22 株內(nèi)生真菌，其中千里香杜鵑中分離獲得 5 株內(nèi)生真菌、頭花杜鵑中分離得到7 株內(nèi)生真菌、烈香杜鵑中分離得到3 株內(nèi)生真菌、隴蜀杜鵑中分離得到7 株內(nèi)生真菌。全部保存在實驗室4 ℃冰箱中，結果見表2。根據(jù)分離過程，我們發(fā)現(xiàn)4 種杜鵑屬植物中，葉片相對較大的隴蜀杜鵑和頭花杜鵑的葉片部位內(nèi)生真菌較多，更易分離，尤其葉片較大的隴蜀杜鵑，在其葉片中分離出5 種內(nèi)生真菌。然而葉片相對較小的千里香杜鵑和烈香杜鵑的葉片部位的內(nèi)生真菌較少，而在枝干部位組織中分離得到較多的內(nèi)生真菌。

表2 四種植物中分離得到的內(nèi)生真菌及其編號Table 2 Endophytic fungi isolated from four plants and their numbers

2.2 內(nèi)生真菌粗提物對赤擬谷盜觸殺活性測試

采用點觸法，用分離得到的22 株內(nèi)生真菌粗提物對赤擬谷盜進行觸殺活性測定，結果見表3，多數(shù)菌株的菌絲體粗提物觸殺活性較菌液粗提物更好，其中LS-Y-2 菌絲體粗提物對赤擬谷盜的觸殺活性較好（LD50＝69.31 μg/adult)，其次為TH-Z-1 菌絲體粗提物（LD50＝75.95 μg/adult）和QLX-Z-1 菌絲體粗提物（LD50＝80.98 μg/adult）。其余粗提物對赤擬谷盜觸殺活性較弱。

表3 內(nèi)生真菌粗提物對赤擬谷盜的觸殺活性Table 3 Contact activity of crude extracts of endophytic fungi against Tribolium castaneum

2.3 內(nèi)生真菌粗提物對赤擬谷盜拒食活性測試

用分離得到的22 株內(nèi)生真菌粗提物對赤擬谷盜進行拒食活性測定，結果見表4，當粗提物質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時，LS-Y-2 和TH-Y-1 菌液粗提物拒食率在80%以上，與陽性對照川楝素活性相近，LS-Y-4、TH-Z-1和QLX-Z-2 菌液粗提物拒食率均達70%以上，當質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時，LS-Y-2 菌液粗提物的拒食率為70.71%。其他粗提物拒食活性較低，與觸殺活性不同的是大部分菌液粗提物對赤擬谷盜所表現(xiàn)出的拒食活性較好。

表4 內(nèi)生真菌粗提物對赤擬谷盜拒食活性Table 4 Antifeedant activity of crude extracts of endophytic fungi against Tribolium castaneum

2.4 內(nèi)生真菌粗提物殺馬鈴薯腐爛莖線蟲活性

采用藥液浸泡法，用分離得到的22 株內(nèi)生真菌粗提物對馬鈴薯腐爛莖線蟲進行殺蟲活性測定，結果見表5，與粗提物對赤擬谷盜觸殺活性相比，粗提物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的殺蟲活性更加顯著；共有33 種粗提物對馬鈴薯腐爛莖線蟲表現(xiàn)出良好的毒殺活性，其中LS-Y-2、TH-Z-1、TH-Y-1、TH-Y-1、QLX-Z-1 菌液粗提物和LS-Y-4 菌絲體粗提物殺線蟲活性較顯著，LC50分別為0.06、0.07、0.11、0.16、0.18 和0.19 mg/mL；LS-Y-2 和TH-Z-1 菌液粗提物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的毒殺活性與陽性對照克百威活性接近，這兩種粗提物中可能含有對馬鈴薯腐爛莖線蟲具有良好毒殺作用的化合物，也有可能是多種化合物相互作用產(chǎn)生協(xié)同效應，導致粗提物活性顯著，可進一步對其化學成分進行研究。

表5 內(nèi)生真菌粗提物對馬鈴薯腐爛莖線蟲的殺蟲活性Table 5 Nematocidal activity of crude extracts of endophytic fungi against Ditylenchus destructor

2.5 菌株形態(tài)學及分子生物學鑒定

通過以上抗蟲活性測定，篩選出TH-Z-1、LS-Y-2、LS-Y-4 菌株為研究對象，鑒定其種屬分類。

2.5.1 形態(tài)學鑒定 對TH-Z-1、LS-Y-2、LS-Y-4 菌株進行了初步形態(tài)學鑒定，其中TH-Z-1 菌落為白色，菌絲呈短茸狀，基質(zhì)為無色，邊緣較薄而銳，鏡檢發(fā)現(xiàn)孢子呈圓型，菌絲具鎖狀聯(lián)合，與栓菌屬Trametes真菌形態(tài)特征相似；LS-Y-2 菌落形態(tài)為暗灰色絮狀，基質(zhì)為深褐色；LS-Y-4 菌落形態(tài)特征為棕色絮狀，基質(zhì)為深棕色，與鏈格孢屬Alternaria真菌形態(tài)特征相似。鏡檢發(fā)現(xiàn)LS-Y-2 與LS-Y-4 的孢子均呈卵型，菌絲長，具有分支且彎曲。

2.5.2 分子生物學鑒定 菌株TH-Z-1，LS-Y-2 和LS-Y-4 的測序結果如下：

LS-Y-2 的ITS 序列：TTCCGTAGGGGGTGCCTGCGGAGGGATCATTACACAAATATGAAGGCGGG CTGGAACCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATTATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT TGGTGGGTTCGCCCACCACTAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAA TTAATAATTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGC GATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGG TATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTT GTCTCTAGCTTTGCTGGAGACTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAG CACAAGTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTTTTGACCTCG GATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGGGGGGAGGAA

LS-Y-4 的ITS 序列：CCCCTTTTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCA AAAGTTGAAAAAAAGGCTTAATGGATGCTAGACCTTTGCTGATAGAGAGTGCGACTTGTGCTGCGCT CCGAAACCAGTAGGCCGGCTGCCAATTACTTTAAGGCGAGTCTCCAGCAAAGCTAGAGACAAGACG CCCAACACCAAGCAAAGCTTGAGGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCTTTGGAATACCAA AGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCAT TTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAATTATTAATTTGT TACTGACGCTGATTGCAATTACAAAAGGTTTATGTTTGTCCTAGTGGTGGGCGAACCCACCAAGGAA ACAAGAAGTACGCAAAAGACAAGGGTGAATAATTCAGCAAGGCTGTAACCCCGAGAGGTTCCAGCC CGCCTTCATATTTGTGTAATGATCCCTCCGCAGCCCCC

TH-Z-1 的ITS 序列：GGGGCTGCGGAAGGATCATTAACGAGTTTTGAAACGGGTTGTTGCTGGCCT TCCGAGGCATGTGCACGCCCTGCTCATCCACTCTACACCTGTGCACTTACTGTAGGTTGGCGTGGGTT TCTAGCCTCCGGGCTGGGAGCATTCTGCCGGCCTATGTACACTACAAACTCTAAAGTATCAGAATGT AAACGCGTCTAACGCATCTTAATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGA ACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA CCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATGAAATTCTCAACCCATAAGTC CTTGTGATCTATGGGCTTGGATTTGGAGGCTTGCTGGCCCTAGCGGTCGGCTCCTCTTGAATGCATTA GCTTGATTCCGTGCGGATCGGCTCTCAGTGTGATAATTGTCTACGCTGTGACCGTGAAGCGTTTTGGC AAGCTCCTAACCGTCCATTAGGACAATCTTTCAACATCTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCT GAACTTAAGCATATCAAAAAGCGGGAGGA

將菌株TH-Z-1，LS-Y-2 和LS-Y-4 的測序結果在GeneBank 中進行BLAST 同源性比較，選取13 株親緣關系95%以上的栓菌屬真菌菌株，15 株親緣關系95%以上鏈格孢屬真菌，以及2 株親緣關系較遠的菌株，分別用NJ 法構建系統(tǒng)進化樹，結果見圖1 和圖2。由圖1 可知TH-Z-1 與已報道的栓菌屬真菌聚為一個分支，親緣關系最近，在分類地位上可將菌株TH-Z-1 歸屬為栓菌屬；由圖2 可知，LS-Y-2 和LS-Y-4與A.longipes，A.brassicicola和A.alternata等多株鏈格孢屬真菌聚為一支，這些菌株具有較高的相似性，親緣關系最近，在分類地位上菌株LS-Y-2 和LS-Y-4 歸為鏈格孢屬。結合形態(tài)學鑒定，菌株LS-Y-2 及LS-Y-4被鑒定為鏈格孢屬真菌，TH-Z-1 被鑒定為栓菌屬真菌。

圖1 菌株TH-Z-1 N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-Joining (N-J) phylogenetic tree of strain TH-Z-1

圖2 菌株LS-Y-2 和LS-Y-4 N-J 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-Joining (N-J) phylogenetic tree of strain LS-Y-2 and LS-Y-4

3 討論

本研究中從千里香杜鵑、頭花杜鵑、烈香杜鵑和隴蜀杜鵑4 種杜鵑屬植物中共分離得到22 株內(nèi)生真菌，將其粗提物進行抗蟲活性測定，發(fā)現(xiàn)LS-Y-2 菌液粗提物、TH-Z-1 菌液粗提物和LS-Y-4 菌絲體粗提物對馬鈴薯腐爛莖線蟲具有較好的殺蟲活性，其LC50分別為0.06、0.07、0.18 mg/mL；LS-Y-2 菌液粗提物在質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時，對赤擬谷盜表現(xiàn)出明顯拒食活性，其拒食率為84.28%，與陽性對照具有相近拒食活性。為了更好地鑒定活性菌株和為之后的具有有效抗蟲活性的化合物分離鑒定，通過形態(tài)學和分子生物學手段對菌株LS-Y-2、LS-Y-4 和TH-Z-1 進行了鑒定，結果顯示可將菌株LS-Y-2 和LS-Y-4 歸為鏈格孢屬，但兩種菌之間存在一定的形態(tài)差異，更確切地鑒定還需要進一步的研究；菌株TH-Z-1 與栓菌屬真菌菌種具有較高的相似性，可將其歸為栓菌屬。因此，本試驗結果對4 種杜鵑屬內(nèi)生真菌的開發(fā)和對赤擬谷盜和馬鈴薯腐爛莖線蟲的防治提供了一定的試驗依據(jù)。

鏈格孢屬真菌，是植物內(nèi)生真菌中最常見的一個屬，相關的研究報道較多。苗智等[29]報道了鏈格孢屬真菌可產(chǎn)生包括生物堿等多種化合物的次級代謝產(chǎn)物，從中分離得到的生物堿類化合物有次黃嘌呤、腺嘌呤、尿囊素、胸腺嘧啶脫氧核苷和尿嘧啶核苷等，其中尿囊素具有一定的抑菌和抗氧化活性，腺嘌呤具有一定的抗氧化活性；Singh 等[30]研究發(fā)現(xiàn)鏈格孢屬真菌對乙酰膽堿酯酶具有一定的抑制活性，并且對斜紋夜蛾幼蟲有一定毒殺活性。而乙酰膽堿酯酶作為昆蟲體內(nèi)生物神經(jīng)傳導中的關鍵性酶，為有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的重要靶標[31]。所以，本研究中的鏈格孢屬真菌代謝產(chǎn)物對赤擬谷盜的抗蟲活性可能是對赤擬谷盜體內(nèi)的乙酰膽堿酯酶產(chǎn)生了影響，具體的抗蟲機制還需后期進一步驗證。此外，還有關于鏈格孢菌屬抗蟲活性方面的報道，證明其發(fā)酵液的萃取物對小菜蛾具有顯著的毒殺活性（LC50＝6.136 mg/mL），并且對粘蟲具有一定的拒食活性[32]。栓菌屬在分類學上屬于真菌門擔子菌亞門非褶菌目多孔菌科，屬內(nèi)許多菌具有抑制腫瘤、鎮(zhèn)痛、清熱除濕、消炎解毒功效，可治療癰疽瘡癤、咽喉腫痛、跌打損傷、風濕諸癥等[33,34]。在已有的研究報道中，桑志高等[35]從栓菌屬真菌的發(fā)酵液和菌絲體中分離并鑒定出6 個化合物，分別有isodrimenediol diacetatei、sodrimenediol 2-acetate、腦苷脂D、麥角甾醇、過氧化麥角甾醇和啤酒甾醇。目前，栓菌屬在抗蟲活性方面的研究較少，發(fā)揮抗蟲活性的化合物以及具體的抗蟲機理還需要進行進一步探究。

植物內(nèi)生真菌在新型化合物研究方面存在巨大潛力，并且在中藥材害蟲的綠色防治方面具有一定的研究價值，通過本研究，發(fā)現(xiàn)了杜鵑屬植物中的多種內(nèi)生真菌，而且在不同植物中的內(nèi)生真菌數(shù)量差異明顯，同種植物中不同組織部位分離結果也差異顯著，充分體現(xiàn)了內(nèi)生真菌的普遍性和多樣性，也對赤擬谷盜和馬鈴薯腐爛莖線蟲表現(xiàn)出一定防治作用，具有一定開發(fā)利用的潛力。