祝亞杰，王佳彬，李珊珊，向文勝,2*，張艷艷*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

微生物天然產(chǎn)物農(nóng)藥具有高效、低毒、環(huán)境相容性好的特性，在農(nóng)作物病蟲害綠色防控和保障糧食安全等領域具有重要的戰(zhàn)略地位。鏈霉菌是天然產(chǎn)物農(nóng)藥的主要來源之一[1]，例如，可可鏈霉菌Streptomyces cacaoi可以產(chǎn)生能夠防治水稻紋枯病和其它真菌病害的多氧霉素；吸水鏈霉菌井岡變種Streptomyces hygroscopicusvar.jinggangensis5008 可以產(chǎn)生井岡霉素用于防治水稻紋枯??；阿維鏈霉菌Streptomycesavermitilis能夠產(chǎn)生廣譜殺蟲劑阿維菌素，用于糧食作物，蔬菜和水果等的害蟲防治；春日鏈霉菌Streptomyceskasugaensis和小金色鏈霉菌Streptomycesmicroaureus能夠產(chǎn)生可以防治水稻稻瘟病的春雷霉素。此外，我們所熟知的中生菌素、武夷菌素、寧南霉素和本研究團隊具有自主知識產(chǎn)權的米爾貝霉素等也分別是由不同鏈霉菌所產(chǎn)生的天然產(chǎn)物農(nóng)藥。值得注意的是，天然產(chǎn)物農(nóng)藥并非鏈霉菌生長所必需，其產(chǎn)生和產(chǎn)量受到細胞復雜調(diào)控網(wǎng)絡的嚴謹控制，往往發(fā)酵產(chǎn)量低，嚴重制約了天然產(chǎn)物農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和應用[2,3]。造成這一問題的主要原因之一便是對菌株天然產(chǎn)物生物合成調(diào)控機制認知的不足，導致可用于高產(chǎn)菌株改造的有效靶點相對匱乏。因此，聚焦于天然產(chǎn)物農(nóng)藥生物合成調(diào)控研究，探尋有助于米爾貝霉素產(chǎn)量提高的有效靶點，對于構建高產(chǎn)工程菌具有重要意義。

米爾貝霉素（milbemycin A3/A4）是由鏈霉菌所產(chǎn)生的十六元大環(huán)內(nèi)酯類化合物（圖1），是一種具有高效殺蟲、殺螨活性，且環(huán)保、低毒的綠色生物農(nóng)藥，能夠防治對有機磷農(nóng)藥和阿維菌素產(chǎn)生抗性的螨，粉虱和蚜蟲等多種農(nóng)業(yè)害蟲，具有廣闊的應用前景[4]。冰城鏈霉菌是米爾貝霉素的重要產(chǎn)生菌，多年來，本研究團隊在米爾貝霉素生物合成調(diào)控研究中取得一系列研究進展，報道了多個影響米爾貝霉素產(chǎn)生的正調(diào)控子（MilR、SbbR 和KelR）和負調(diào)控子（SbbA、SbrH1-R 和SspH）[2,4-7]，并對相應調(diào)控機制進行了深入研究，一定程度上豐富了我們對米爾貝霉素生物合成調(diào)控網(wǎng)絡的了解，同時也提供了多個可用于菌株高產(chǎn)改造的有效靶點。然而，冰城鏈霉菌中存在大約600 個調(diào)控因子編碼基因[8]，且絕大多數(shù)功能未知。若能從這些功能未知的大量調(diào)控因子中篩選能夠影響米爾貝霉素產(chǎn)生的調(diào)控蛋白，將加深我們對米爾貝霉素調(diào)控網(wǎng)絡的認知，也為高產(chǎn)工程菌的構建提供更多可供選擇的靶點。

圖1 Milbemycin A3 和A4 的化學結構Fig.1 The chemical structures of milbemycin A3 and A4

雙組份信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)（Two-component system，TCS）在鏈霉菌天然產(chǎn)物生物合成調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。近年來，研究者們在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了一對高度保守的TCS MtrAB，其在DNA 復制、細胞分裂和天然產(chǎn)物產(chǎn)生過程中發(fā)揮著關鍵作用[9,10]。該TCS 中應答調(diào)控蛋白組分MtrA 能夠直接控制委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Streptomycesvenezuelae中氯霉素生物合成基因簇的表達[9]，還能夠直接調(diào)控天藍色鏈霉菌Streptomyces coelicolor中放線紫紅素和十二烷基靈菌紅素生物合成基因簇的表達[10]；有趣的是，過表達mtrA能夠顯著促進氯霉素，放線紫紅素和十二烷基靈菌紅素的產(chǎn)生，表明操作mtrA的表達水平可用于提高鏈霉菌中天然產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，在本工作中，我們對mtrA在冰城鏈霉菌中的功能進行了探究。MtrAsbh為米爾貝霉素生物合成的關鍵激活子，能夠間接影響米爾貝霉素生物合成基因簇的表達水平；mtrAsbh過表達后能夠通過上調(diào)米爾貝霉素生物合成基因簇和前體合成相關基因的表達來促進米爾貝霉素的產(chǎn)生。mtrAsbh缺失后，冰城鏈霉菌基因組中許多天然產(chǎn)物生物合成基因表達水平也表現(xiàn)出顯著下調(diào)或上調(diào)趨勢。相關研究不僅豐富了對米爾貝霉素調(diào)控網(wǎng)絡的認知，為米爾貝霉素高產(chǎn)菌株改造提供有效靶點，同時也為挖掘新型天然產(chǎn)物提供了改造靶點。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及引物

本文使用的主要研究材料為米爾貝霉素產(chǎn)生菌——冰城鏈霉菌野生型菌株BC-101-4，該菌株為本實驗室保存。用于基因操作和蛋白異源表達的大腸桿菌JM109、ET12567/pUZ8002、BL21（DE3）均為實驗室保存。大腸桿菌-鏈霉菌穿梭載體pKC1139（AprRr）用于基因敲除。pSET152::PhrdB為本實驗基于鏈霉菌整合型質(zhì)粒pSET152 構建的用于基因回補或者過表達的通用質(zhì)粒（目的基因由組成型hrdB啟動子啟動表達）。pET23b(+)為蛋白異源表達用質(zhì)粒。本文所用引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，具體序列見表1 和表2。

表1 本研究遺傳操作及體外試驗所用引物Table 1 Primers for genetic manipulation and in vitro experiments in this study

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

冰城鏈霉菌產(chǎn)孢和種子液培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基都為SSPY，接合轉(zhuǎn)移用培養(yǎng)基為MS，發(fā)酵用培養(yǎng)同前期報道[4]。大腸桿菌使用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)。鏈霉菌培養(yǎng)溫度為28 ℃，大腸桿菌培養(yǎng)溫度為37 ℃。

1.3 試劑、酶、抗生素及使用濃度

質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒、DNA marker 及蛋白marker均購買于北京全式金生物有限公司；DNA 聚合酶KOD plus 購買于TOYOBO 公司；Q5 High-Fidelity DNA Polymerase 購買于New England Biolabs 公司；T4 DNA 連接酶購買于Thermo Fisher 公司；RNA 提取試劑盒購買于康為世紀生物科技有限公司；RNA 清除反轉(zhuǎn)試劑盒購買于天根生物科技有限；熒光定量用試劑PowerUp? SYBR? Green Master Mix 購買于賽默飛世爾科技有限公司；凝膠阻滯用染料SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain 購于Invitrogen 公司；Gibson 組裝所用試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司；高效液相分析所用甲醇、乙醇為色譜純，購買于美國Fisher 公司。其余化學試劑均購買于國藥集團化學試劑公司。安普霉素（100 mg/mL，水）、氯霉素（25 mg/mL，100%乙醇）、氨芐青霉素（100 mg/mL，水）和萘啶酮酸（25 mg/mL，0.1 mol/L NaOH）作為貯備液冷凍保存。在LB 培養(yǎng)基中，安普霉素、氯霉素和氨芐青霉素的使用濃度分別為100 μg/mL、25 μg/mL 和100 μg/mL。冰城鏈霉菌接合轉(zhuǎn)移用MS 和產(chǎn)孢培養(yǎng)基上安普霉素使用濃度都為6 μg/mL，萘啶酮酸使用濃度為25 μg/mL。

1.4 DNA 基本操作與分析

常見的分子生物學操作方法見分子克隆指南[11]，鏈霉菌基因組提取見鏈霉菌操作手冊[12]。

1.5 基因敲除、回補與過表達的構建

為構建mtrAsbh缺失突變株，以冰城鏈霉菌BC-101-4 基因組為模板，使用引物6494-upF/6494-upR 和6494-downF/6494-downR 分別PCR 擴增mtrAsbh的上游（約2.1 kb）和下游（約2.2 kb）片段，然后將這兩個片段通過 Gibson 組裝連入pKC1139 的HindIII 和EcoR I 位點，得到mtrAsbh無痕敲除質(zhì)粒pKC1139::ΔmtrAsbh。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567/pUZ8002，進而通過接合轉(zhuǎn)移[13]轉(zhuǎn)入野生型菌株BC-101-4 中，得到具有安普霉素抗性的接合子。pKC1139 為溫度敏感型復制子，高于34 ℃不能自主復制。因此將收集到的孢子適量涂布于安普霉素抗性MS 平板中，37 ℃培養(yǎng) 9 d。隨后，收集孢子（此時孢子為基因敲除質(zhì)粒至少一側同源臂發(fā)生了同源重組）均勻涂布于無抗生素的固體SSPY 培養(yǎng)基上[4]，28 ℃連續(xù)傳3代，期間游離的pKC1139 基因敲除質(zhì)粒丟失，與基因組發(fā)生同源重組的敲除質(zhì)粒則發(fā)生第2 次同源重組。將傳代3 次的孢子制備孢子懸浮液，梯度稀釋涂布于無抗SSPY 平板上，將長出來的單克隆分別轉(zhuǎn)接入含安普抗性和無抗的固體SSPY 平板，挑選在抗性平板上不長，而在無抗平板上生長的單克隆。這樣的單克隆是發(fā)生兩次雙交換的，可能是突變株，也可能恢復為野生型，因此將進一步提取單克隆基因組作為模板，設計兩個同源臂更外側的引物（con6494F/R）進行 PCR 擴增和 DNA 測序，篩選正確的mtrAsbh無痕敲除菌株。同樣以冰城鏈霉菌BC-101-4 基因組為模板，使用引物對O6494-F/R 通過PCR 擴增含mtrAsbh編碼框序列的片段，然后將其通過Gibson 組裝連入整合型載體pSET152::PhrdB，獲得回補或者過表達用載體pSET152::PhrdB::mtrAsbh。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌ET12567/pUZ8002，進而通過接合轉(zhuǎn)移[13]導入mtrAsbh缺失株（ΔmtrAsbh）和野生型菌株BC-101-4 中獲得回補菌株ΔmtrAsbh/mtrAsbh和過表達菌株OmtrAsbh。

1.6 冰城鏈霉菌米爾貝霉素的發(fā)酵和HPLC 分析

米爾貝霉素發(fā)酵和HPLC 分析方法參照文獻方法[4]進行。

1.7 MtrAsbh 在大腸桿菌的表達及純化

以冰城鏈霉菌野生型BC-101-4 基因組為模板，使用引物對MtrAEP-F/R PCR 擴增MtrAsbh編碼序列。將獲得的編碼序列片段通過Gibson 組裝方式連入pET23b(+)的NdeI/HindIII 位點，得到蛋白表達載體pET23b::MtrAsbh。后續(xù)的蛋白異源表達和純化參照文獻[14]方法進行。

1.8 轉(zhuǎn)錄分析和凝膠阻滯試驗

收集米爾貝霉素發(fā)酵3 d 和6 d 的菌體提取總RNA，cDNA 合成和實時熒光定量PCR（qRT-PCR）操作步驟參考文獻[13]方法。凝膠阻滯試驗使用熒光染料法。使用的啟動子探針通過PCR 和膠回收制備。凝膠阻滯反應體系參考文獻[13]方法，其中，20 μL 反應體系中啟動子探針的濃度調(diào)整為20 ng。反應體系配置完畢室溫25 ℃反應25 min，然后通過4.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠對樣品進行電泳分析。電泳結束后，將膠置于10000 倍稀釋的SYBR Gold 染料溶液（0.5×TBE 緩沖液）中避光振蕩染色30 min 后用凝膠成像系統(tǒng)進行拍攝。

2 結果與分析

2.1 冰城鏈霉菌中MtrA 同源蛋白序列分析

為研究冰城鏈霉菌中MtrA 的功能，首先通過生物信息學分析找到基因組中對應的同源蛋白編碼基因。利用天藍色鏈霉菌基因組 MtrA（SCO3013）氨基酸序列進行BLAST 分析，發(fā)現(xiàn)冰城鏈霉菌基因組中對應的同源蛋白編碼基因為sbi_06494，此處將其命名為mtrAsbh。mtrAsbh編碼產(chǎn)物MtrAsbh由225 個氨基酸組成，預測分子量為24.8 kDa。MtrAsbh與來自于天藍色鏈霉菌、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌和結核分枝桿菌H37Rv 中的MtrA同源蛋白一致性分別為99%、99%和75%（圖2）。

圖2 不同菌株來源MtrA 同源蛋白的氨基酸序列比對Fig.2 Amino acid sequence alignment of the MtrA homologs from different bacterial species

2.2 mtrAsbh 是米爾貝霉素合成的正調(diào)控基因

基因的表達時序與其功能存在一定關聯(lián)性。從冰城鏈霉菌野生型BC-101-4 的時序轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GSE147644）中抽提出mtrAsbh表達時序相關信息，并對獲得的對應FPKM 值（代表基因表達水平）進行分析。如圖3A 顯示，mtrAsbh在0.75 d 時的轉(zhuǎn)錄豐度最強，隨后轉(zhuǎn)錄豐度下降，但仍保持著較高的轉(zhuǎn)錄水平，即從米爾貝霉素產(chǎn)生初期（3 d）直至發(fā)酵結束（9 d），mtrAsbh轉(zhuǎn)錄本豐度一直維持在其在0.75 d時表達水平的一半左右。這表明MtrAsbh可能在整個發(fā)酵過程中都發(fā)揮一定的作用。緊接著，為了確定mtrAsbh的功能，我們構建了mtrAsbh同源重組缺失菌株ΔmtrAsbh。在ΔmtrAsbh中，mtrAsbh編碼框內(nèi)部456 bp編碼序列被刪除（圖3B）。隨后將獲得的ΔmtrAsbh連同野生型BC-101-4 進行米爾貝霉素發(fā)酵和HPLC 分析。結果表明mtrAsbh缺失后，菌株失去米爾貝霉素A3/A4 產(chǎn)生能力（圖3C）。為確定ΔmtrAsbh中米爾貝霉素不產(chǎn)生是由mtrAsbh缺失所導致的，進行了mtrAsbh回補試驗。將含有完整mtrAsbh編碼框的678 bp 序列進行PCR 擴增并將其連入含有hrdB啟動子（PhrdB）的整合型質(zhì)粒pSET152::PhrdB中，獲得回補質(zhì)粒pSET152::PhrdB::mtrAsbh。將該質(zhì)粒通過接合轉(zhuǎn)移導入ΔmtrAsbh獲得回補菌株ΔmtrAsbh/mtrAsbh，并對其進行米爾貝霉素產(chǎn)量分析。結果表明回補菌株ΔmtrAsbh/mtrAsbh中米爾貝霉素A3/A4 產(chǎn)量恢復到BC-101-4 水平的70%左右（圖3C）；與此同時，還測定了野生型、突變株和回補菌株在發(fā)酵過程中的菌體生長情況，結果顯示ΔmtrAsbh生物量顯著低于BC-101-4，而回補菌株ΔmtrAsbh/mtrAsbh的生物量則與BC-101-4 生物量基本一致（圖3D）。以上結果表明，MtrAsbh正調(diào)控米爾貝霉素的生物合成和細胞生長。

圖3 mtrAsbh 對米爾貝霉素產(chǎn)生和細胞生長的影響Fig.3 Effects of mtrAsbh on milbemycin production and cell growth

2.3 MtrAsbh 間接正調(diào)控了米爾貝霉素生物合成基因簇的表達

為了確定MtrAsbh是否影響米爾貝霉素生物合成基因簇的表達，提取了BC-101-4 和ΔmtrAsbh發(fā)酵3 d和6 d 的菌體總RNA，并進行反轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量試驗，分析基因簇中代表性基因milA2、milA4、milF、milR和milA1的表達情況。圖4A 結果顯示，與BC-101-4 相比較，ΔmtrAsbh中這5 個基因的轉(zhuǎn)錄豐度都大幅下調(diào)甚至不表達。這些結果表明，MtrAsbh能夠通過激活米爾貝霉素生物合成基因簇的表達而正調(diào)控米爾貝霉素的產(chǎn)生。為了確定MtrAsbh對米爾貝霉素生物合成基因簇表達的調(diào)控是直接還是間接作用，首先參照已經(jīng)報道的MtrA 保守結合基序（17 bp 不完美正向重復序列：G/T-T-G/A-A-C-C-N5-G-T-G/T-A-C-N）[15]對米爾貝霉素基因簇啟動子區(qū)域進行仔細分析；我們在3 個關鍵基因的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了與該保守結合基序有一定相似性的序列，它們分別位于milA4啟動子區(qū)（5′-GTGCTTAGGGGGTGCAG-3′），milF啟動子區(qū)（5′-GTCTT GAGGGGGTTCCG-3′）和milR啟動子區(qū)（5′-GTGAGCCACAAGTTGAT-3′，5′- GTCCGGAACCAGTCAT G-3′，5′-GTTTCAGGCGTGTCATC-3′）。然后，為了驗證MtrAsbh是否與這些啟動子存在直接相互作用，在大腸桿菌BL21（DE3）中異源表達了帶有His6標簽MtrAsbh蛋白，并通過凝膠阻滯實驗檢測MtrAsbh與這些啟動子區(qū)域的相互作用情況。于此同時也檢測了不含有該序列特征的啟動子區(qū)（PmilA2和PmilA1）與MtrAsbh的結合情況。在具體的凝膠阻滯試驗中以hrdB啟動子（PhrdB）作為負對照，選擇與PhrdB不結合的蛋白濃度進行相互作用試驗。結果顯示在此濃度范圍內(nèi)，MtrAsbh不能夠與米爾貝霉素基因簇中任何一個啟動子區(qū)域結合（圖4B）。我們猜測雖然PmilA4，PmilF和PmilR的啟動子區(qū)含有與MtrA 保守結合基序相似的序列，但是序列相似性偏低，這可能是導致不結合的原因之一。以上結果表明MtrAsbh可能間接正調(diào)控了米爾貝霉素生物合成基因簇的表達。

圖4 MtrAsbh 對米爾貝霉素生物合成基因表達的影響Fig.4 Effects of MtrAsbh on the expression of milbemycin biosynthesis genes

2.4 mtrAsbh過表達增強了米爾貝霉素生物合成基因簇和前體合成相關基因的表達，并促進米爾貝霉素的產(chǎn)生

如上所述，MtrAsbh是米爾貝霉素生物合成基因簇的激活子，因此推測mtrAsbh過表達可能有助于米爾貝霉素產(chǎn)量的提高。于是將構建的質(zhì)粒pSET152::PhrdB::mtrAsbh通過接合轉(zhuǎn)移導入BC-101-4 中獲得過表達菌株OmtrAsbh，并對其進行米爾貝霉素產(chǎn)量分析。結果表明與BC-101-4 相比較，獲得的5 株過表達菌株中米爾貝霉素產(chǎn)量提高幅度為32%～40%（圖5A）。由此可見，mtrAsbh是提升米爾貝霉素產(chǎn)量的有效靶點。為了確定mtrAsbh過表達后對米爾貝霉素生物合成基因簇表達的影響。提取BC-101-4 和過表達菌株OmtrAsbh發(fā)酵第3 d（米爾貝霉素產(chǎn)生初期）的總RNA 樣品進行轉(zhuǎn)錄分析。結果顯示在過表達菌株OmtrAsbh中，mtrAsbh表達豐度顯著提高，表明mtrAsbh過表達成功；同時，米爾貝霉素生物合成基因簇中的5 個重要基因（milA2、milA4、milF、milR和milA1）也表現(xiàn)出不同程度的顯著上調(diào)（圖5B），說明mtrAsbh過表達顯著強化了米爾貝霉素生物合成基因簇的表達水平。

圖5 mtrAsbh 過表達對米爾貝霉素A3/A4 產(chǎn)量，米爾貝霉素基因簇和前體合成相關基因表達的影響Fig.5 Effects of mtrAsbh overexpression on production of milbemycin A3/A4, and on expression of milbemycin biosynthetic gene cluster and genes related to precursor supply

MtrAsbh是保守的全局性調(diào)控子，在液體發(fā)酵條件下能夠影響菌體生長（圖3D）。由于菌體生長也是初級代謝的一部分，因此推測mtrAsbh過表達也可能通過影響初級代謝，繼而影響前體供給來調(diào)控米爾貝霉素產(chǎn)生。為了驗證猜測，緊接著分析了冰城鏈霉菌中影響丙二酸單酰輔酶A 和甲基丙二酸單酰輔酶A（這兩種化合物均為米爾貝霉素合成關鍵延伸單元）合成的關鍵基因的表達情況。圖5C 結果顯示，負責丙二酸單酰輔酶A 合成的sbi_02769、sbi_02770和sbi_08290在OmtrAsbh中是顯著高表達的；甲基丙二酸單酰輔酶A 合成基因sbi_4601在OmtrAsbh中也有顯著上調(diào)。這表明MtrAsbh能夠通過影響前體合成相關基因的表達進而影響米爾貝霉素的合成。

2.5 MtrAsbh 差異化調(diào)控基因組中多個天然產(chǎn)物生物合成核心基因的表達

鏈霉菌不僅能夠產(chǎn)生很多結構已知的天然產(chǎn)物，其基因組中還編碼有大量結構和功能未知的天然產(chǎn)物生物合成基因簇，被稱為隱性基因簇。這些隱性基因簇的表達水平較低或是不表達是導致相應化合物不能夠被檢測出的主要原因之一[3]。聚酮（polyketides，PKS）、非核糖體肽（Nonribosomal peptides，NRPS）和聚酮-非核糖體肽（PKS-NRPS）是鏈霉菌基因組中存在的三種主要類型的天然產(chǎn)物生物合成基因簇。冰城鏈霉菌基因組中大約有31 種上述類型的天然產(chǎn)物基因簇[7]。為確定MtrAsbh對這些天然產(chǎn)物基因簇表達的影響，選取天然產(chǎn)物基因簇中決定產(chǎn)物合成的核心基因，并檢測它們在mtrAsbh缺失后表達水平的變化情況。圖6 結果表明，刪除mtrAsbh后，31 個生物合成核心基因中有12 個基因（sbi_00140、sbi_00220、sbi_00319、sbi_00522、sbi_00625、sbi_01983、sbi_02068、sbi_02764、sbi_08414、sbi_09249、sbi_09652和sbi_10015）的表達水平在第3 d 和第6 d 時都表現(xiàn)出顯著下調(diào)甚至不表達的趨勢，表明MtrAsbh是這些基因的關鍵激活子；值得注意的是，少數(shù)基因表達水平表現(xiàn)出顯著上調(diào)趨勢，如sbi_00822表達水平在第3 d 和第6 d 分別上調(diào)約15 倍和100 倍；sbi_01029表達水平在第3 d 和第6 d 分別上調(diào)約2 倍和9 倍；sbi_00655和sbi_00671表達水平在第3 d 和第6 d 也都有顯著上調(diào)；sbi_02232在第6 d 時表達水平上調(diào)約100 倍；此外，在第6 d時，sbi_06873、sbi_008957和sbi_09195等基因表達也表現(xiàn)出顯著上調(diào)的趨勢，這表明MtrAsbh也是某些天然產(chǎn)物合成基因的重要負調(diào)控子。以上結果表明MtrAsbh對多數(shù)天然產(chǎn)物生物合成基因具有正調(diào)控作用，同時還能負調(diào)控少數(shù)天然產(chǎn)物合成基因的表達，也就是說MtrAsbh對不同的天然產(chǎn)物合成基因表達表現(xiàn)出差異化調(diào)控作用。

圖6 mtrAsbh 缺失對冰城鏈霉菌基因組中其它天然產(chǎn)物合成基因表達的影響Fig.6 Effects of mtrAsbh deletion on expression of other natural product biosynthesis genes present in the genome of Streptomyces bingchenggensis

3 討論

鏈霉菌源天然產(chǎn)物農(nóng)藥因其高效，廣譜，低毒的特性在植物病蟲害綠色防控中具有非常重要的作用[14]。提高優(yōu)質(zhì)天然產(chǎn)物農(nóng)藥的產(chǎn)量是實現(xiàn)其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和應用過程中不可或缺的一個環(huán)節(jié)。然而，鏈霉菌中天然產(chǎn)物農(nóng)藥的產(chǎn)生受到細胞復雜轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡的嚴謹控制，往往產(chǎn)量較低[3,16]。因此，聚焦于尋找影響天然產(chǎn)物農(nóng)藥產(chǎn)生的新穎調(diào)控因子，解析其影響產(chǎn)物產(chǎn)生的機制，對于挖掘高產(chǎn)有效靶點和構建高產(chǎn)工程菌具有積極的推動作用[7]。在本研究中，基于文獻調(diào)研和試驗研究，我們鑒定了一個影響米爾貝霉素產(chǎn)生的重要調(diào)控因子——MtrAsbh。mtrAsbh敲除后，菌株徹底失去米爾貝霉素產(chǎn)生能力，而高表達mtrAsbh則可明顯促進米爾貝霉素的產(chǎn)生。進一步研究發(fā)現(xiàn)MtrAsbh可通過影響米爾貝霉素生物合成基因簇和前體合成相關基因的表達而調(diào)節(jié)米爾貝霉素的產(chǎn)生。此外，我們還發(fā)現(xiàn)MtrAsbh雖然是很多天然產(chǎn)物生物合成基因的正調(diào)控因子，其失活后，還有少數(shù)天然產(chǎn)物生物合成基因表達水平顯著上調(diào)。這些結果不僅為米爾貝霉素高產(chǎn)菌構建提供有效靶點，同時也為發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物提供操作靶標。

MtrA 首先是在結核分枝桿菌中被發(fā)現(xiàn)的，在DNA 復制和細胞分裂中發(fā)揮著關鍵作用[17]。后來有研究者發(fā)現(xiàn)MtrA 在放線菌中也是高度保守存在的，并在菌株發(fā)育分化和天然產(chǎn)物生物合成過程中發(fā)揮重要作用[9]。在委內(nèi)瑞拉鏈霉菌中，MtrA 不僅可以直接控制DNA 復制和細胞分裂相關基因的表達，還能夠直接結合在氯霉素生物合成基因簇中cmlN-cmlF啟動子區(qū)進而正調(diào)控氯霉素的產(chǎn)生。在天藍色鏈霉菌中，MtrA可以直接作用于actII-1、actII-4和redZ的啟動子區(qū)，進而直接調(diào)節(jié)放線紫紅素和十二烷基靈菌紅素的產(chǎn)生。以上報道說明MtrA 可能在鏈霉菌中具有普遍調(diào)節(jié)天然產(chǎn)物產(chǎn)生的功能。在本研究中，我們通過詳細研究表明MtrAsbh為米爾貝霉素產(chǎn)生的關鍵激活子，且mtrAsbh高表達可通過強化米爾貝霉素基因簇和前體合成相關基因的表達而促進米爾貝霉素產(chǎn)量的提高。因此，mtrAsbh可以作為米爾貝霉素增產(chǎn)的有效靶點，在未來菌株生產(chǎn)性能的系統(tǒng)改造過程中發(fā)揮重要作用。

鏈霉菌基因組中存在的大量隱性基因簇是天然產(chǎn)物的寶庫。如何激活這些隱性基因簇的表達是尋找新穎天然產(chǎn)物必須解決的問題之一。然而，這些隱性基因簇同樣受到細胞復雜轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡的嚴謹控制，導致表達水平較低甚至不表達。因此，破解這個復雜轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡，特別是尋找能夠廣泛控制隱性基因簇表達的調(diào)控因子，對于開發(fā)能夠促進隱性基因簇高表達的有效策略非常必要。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MtrAsbh不僅是米爾貝霉素和多個潛在天然產(chǎn)物生物合成核心基因的正調(diào)控子，敲除mtrAsbh還能夠上調(diào)基因組中其它一些隱性基因簇生物合成核心基因的表達，這表明MtrAsbh差異化影響了天然產(chǎn)物生物合成基因簇的表達，該發(fā)現(xiàn)為新型天然產(chǎn)物挖掘提供操作靶點。