汪泳昌，祝駿賢，李建松，陳 辰，紀利芹，洪孝友，劉曉莉，王亞坤，吳聰聰，余汶君，羅來福，陳海港，魏成清，朱新平，張俊杰，李 偉

1.新疆農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830052

2.中國水產(chǎn)科學研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點實驗室，廣東 廣州 510380

3.惠州市財興實業(yè)有限公司，廣東 惠州 516000

Dkkl1 (Dickkopf-like 1) 是Dickkopf (DKK) 基因家族中的一員，屬于分泌型糖蛋白，最初是在非洲爪蟾 (Xenopus laevis) 中被鑒定為胚胎頭部誘導劑和Wingless (Wnt) 拮抗劑[1]。已有研究證明Dkkl1 可以在脊椎動物的多種細胞類型中抑制Wnt 誘導的β-catenin 的穩(wěn)定性[2-3]。在小鼠 (Mus musculus) 中，Dkkl1 由單個基因編碼，其表達首先在2 細胞期和4 細胞期中檢測到[4]，在胚胎第15 天時，Dkkl1基因在發(fā)育中的骨骼和眼睛中表達，但在性腺原基中不表達。然而在成年小鼠中，Dkkl1基因的表達只限于睪丸，Dkkl1mRNA 在發(fā)育中的精母細胞中豐富表達，首先在發(fā)育中的頂體中表達，然后在成熟精子的頂體中積累[5]。不僅如此，Dkkl1 還是一種N-糖基化蛋白，在精母細胞成熟過程中參與精子合成[6]，它標志著發(fā)育中的精母細胞和精子細胞，通過靶向敲除Dkkl1基因，小鼠胚胎正常發(fā)育，形成可育后代[7]。但是，Dkkl1基因的缺失會導致精子體外受精能力嚴重受損，而這種作用在體內(nèi)受精中似乎得到了某種因素的補償。此外，Dkkl1基因還與人 (Homosapiens)的弱精子癥[8]和不育癥[9]密切相關(guān)。上述研究表明，Dkkl1基因在哺乳動物睪丸發(fā)育和精子發(fā)生過程中扮演著十分重要的角色，但是目前關(guān)于Dkkl1基因在龜鱉類動物中的研究還鮮有報道。

爬行綱在物種進化過程中具有特殊的進化位置，是第一批真正擺脫水環(huán)境依賴而登陸的脊椎動物，也是羊膜動物中最早的一種，既能進化為哺乳類，又能演化為鳥類，在動物學研究中占有舉足輕重的地位[10]。中華鱉 (Pelodiscussinensis) 隸屬于爬行綱、龜鱉目、鱉科、中華鱉屬，是我國淡水特種養(yǎng)殖中的重要品種，因其獨特的營養(yǎng)價值[11]和藥用價值[12]而深受市場青睞，直接經(jīng)濟價值超過百億。隨著年齡的增長，中華鱉睪丸發(fā)育呈現(xiàn)出不同的形態(tài)特征，大致可分為4 個時期：精原細胞期、精母細胞期、精子細胞期和精子期。1 冬齡雄性中華鱉精巢中的細胞分散，曲細精管內(nèi)主要由精原細胞組成；2 冬齡曲細精管中的生精上皮除了有精原細胞外，初級精母細胞也逐漸分化形成；3 冬齡精巢已具備各種類型的精細胞，曲細精管腔內(nèi)出現(xiàn)大量精子[13-14]。中華鱉的睪丸發(fā)育和精子發(fā)生受多基因的調(diào)控，例如：L i 等[15]發(fā)現(xiàn)中華鱉中Hmgb2基因的表達呈現(xiàn)睪丸特異性，主要存在于圓形精子細胞和精子中，證實其在中華鱉的精巢發(fā)育和精子生成過程中具有重要功能；Lei 等[16]發(fā)現(xiàn)Spats1是一個雄性表達特異的基因，其主要存在于中華鱉的初級精母細胞、次級精母細胞和精子中，與中華鱉的精子發(fā)生和釋放密切相關(guān)；Zhou 等[17]使用RNA 干擾技術(shù)成功敲除Amh基因，證明其在促進中華鱉的睪丸發(fā)育和精子發(fā)生方面具有必要和充分的作用。然而，除了關(guān)鍵基因之外，外源性激素也可以在一定程度上調(diào)控睪丸發(fā)育和精子發(fā)生[18-19]，且在不同發(fā)育時期發(fā)揮著不同的作用[20]。例如：意大利壁蜥 (Podarcis sicula) 在高濃度17β-雌二醇 (E2) 和低濃度甲基睪酮 (MT)中會阻滯精子發(fā)生[21]，而在低濃度E2和高濃度MT 中可誘導精子發(fā)生的恢復[22]。鋸蓋魚 (Centropomusundecimalis)在15 和30 mg·kg–1的MT 下可刺激睪丸的發(fā)育和生長并加速精子發(fā)生[23]；產(chǎn)后15～30 d 的大鼠暴露于E2下會延遲精子發(fā)生[24]。然而，近年有關(guān)Dkkl1基因的研究十分匱乏，且現(xiàn)有的研究還遠不足以闡明中華鱉精子發(fā)生的背后機制。因此本研究克隆了中華鱉Dkkl1基因的cDNA 序列，對其序列特征進行詳細分析，探索其在不同體組織和不同時期性腺中的表達模式，以及其對外源性激素 [E2和17α-甲基睪酮 (17α-MT)] 處理的響應，為深入探討Dkkl1基因在中華鱉睪丸發(fā)育和精子發(fā)生中的功能研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料的收集

本研究所用中華鱉采購自廣東省惠州市財興實業(yè)有限公司，選取1、2、3 冬齡健康中華鱉，麻醉后放血。取3 冬齡中華鱉的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、肌肉、卵巢和1、2、3 冬齡的精巢組織于無酶凍存管中，并將其迅速放入液氮中速凍，于-80 ℃超低溫冰箱保存，每種組織均取3 個生物重復。

1.2 總RNA 提取及cDNA 第一鏈合成

使用Trizol 法提取中華鱉各組織的總RNA，提取RNA 的濃度和質(zhì)量由NanoQTM核酸檢測儀和1% (w) 瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用HiScript?III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper) 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Vazyme，中國) 去除基因組DNA 污染，合成cDNA 第一鏈。

1.3 中華鱉Dkkl1 cDNA 的克隆

參考NCBI GenBank 公布的中華鱉Dkkl1基因序列信息 (XM_014572465) 設(shè)計引物Dkkl1-F/Dkkl1-R (表1)，以3 冬齡中華鱉精巢cDNA 為模板，將Dkkl1基因的開放閱讀框 (Open reading frame,ORF) 區(qū)域進行擴增，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產(chǎn)物進行檢測。目的片段使用Gel Extraction Kit (Omega，中國) 膠回收試劑盒進行回收，連接至pMD19-T (TaKaRa，中國) 載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞 (TaKaRa，中國) 中。最后，從轉(zhuǎn)化后的細胞中篩選出陽性克隆，并送至廣州天一輝遠基因科技有限公司進行測序。

1.4 Dkkl1 基因的生物信息學分析

使用ExPASy (https://web.expasy.org/translate/) 在線網(wǎng)站預測開放閱讀框[25]，采用DNAMAN 軟件進行氨基酸序列的翻譯和同源性比較[26]、ClustalW (BioEdit) 軟件進行氨基酸序列的多重比對[27-28]，通過ProtParam 分析Dkkl1 蛋白的理化性質(zhì)[29]和SOPMA 分析Dkkl1 蛋白二級結(jié)構(gòu)[30]，利用SWISS-MODLE 同源建模構(gòu)建Dkkl1 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)[31]。

1.5 組織表達分析

運用Primer 軟件設(shè)計實時熒光定量PCR (RT-qPCR) 所需引物Dkkl1-qF/Dkkl1-qR，同時選擇中華鱉的Ef1α基因作為內(nèi)參基因[32](表1)。以中華鱉不同組織的cDNA 作為模板，利用Applied Biosystems StepOnePlus Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems，新加坡)對其進行實時熒光定量PCR 分析。反應體系為20 μL，其中2×iTaq Universal SYBR Green (BIO-RAD，美國) 10 μL，引物Dkkl1-qF/Dkkl1-qR 各0.5 μL，cDNA 模板2 μL，雙蒸水 (ddH2O) 7 μL。半定量分析使用與RT-qPCR 相同的特異性引物 (Dkkl1-qF/Dkkl1-qR)，采用各組織的cDNA 作為模板進行普通PCR (RT-PCR) 擴增。擴增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠分離并進行拍照 (GenoSens2200，中國)。

1.6 成體雄性中華鱉外源性激素處理

選取體表無傷、活躍的3 冬齡雄性中華鱉33 只，其中30 只平均分為2 組 (E2處理組和17α-MT 處理組)，從腿部肌肉注射E2和17α-MT，質(zhì)量濃度為50 μg·μL-1，劑量為10 mg·kg-1[16]；另外3 只注射等劑量的溶劑作為空白對照組，分別于激素處理后第6、第12、第24、第48 小時和第7 天隨機采集3 只雄性性腺，置于液氮中進行總RNA 提取和實時熒光定量PCR 分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用2-ΔCt法于第6、第12、第24、第48 小時計算目的基因的相對表達量[15]，每個實驗至少獨立重復3 次，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤”表示。采用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析，P<0.05 表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 中華鱉Dkkl1 基因克隆結(jié)果及其編碼蛋白氨基酸序列分析

克隆獲得的中華鱉Dkkl1cDNA 序列長為823 bp，其中3' 非編碼區(qū) (UTR) 長67 bp，5' UTR 長90 bp，ORF 長666 bp，共編碼222 個氨基酸(圖1)。中華鱉Dkkl1 蛋白的相對分子質(zhì)量為24.924 77 kD，理論等電點為10.8，不穩(wěn)定系數(shù)為58.71，脂溶系數(shù)為84.91，總平均親水系數(shù)為-0.418，表明Dkkl1 蛋白是一種穩(wěn)定性較差、親水性較強的堿性蛋白質(zhì)。其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，其中α-螺旋占33.78%，β-折疊占5.86%，無規(guī)則卷曲占46.85%，延伸鏈占13.51%，三級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主。氨基酸序列同源性比對結(jié)果顯示：其與中華草龜(Chinemysreevesii)的相似性較高 (81%)，與棱皮龜 (Dermochelyscoriacea)的相似性較低(70%)，與綠海龜(Cheloniamydas)、三趾箱龜(Terrapene carolinatriunguis)、巴西紅耳龜(Trachemysscriptaelegans)、西部錦龜(Chinemyspictabellii) 的同源性分別為80%、79%、78%、78% (圖2)。

圖1 中華鱉 Dkkl1 基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide of P.sinensis Dkkl1 gene and its encoded protein sequence

圖2 中華鱉與其他物種的 Dkkl1 氨基酸序列同源相似性比對注：所有的氨基酸序列來自于NCBI 數(shù)據(jù)庫：巴西紅耳龜，XM_034791724.1；綠海龜，XM_037888484.1；三趾箱龜，XM_026659251.1；中華草龜，XM_039510142.1；西部錦龜，XM_024113109.1；棱皮龜，XM_038381465.2。黑色陰影為氨基酸序列比對相同的位點，灰色陰影為相近位點。Fig.2 Homologous comparison of Dkkl1 amino acid sequence of P.sinensis with other speciesNote: All amino acid sequences come from NCBI database: T.scripta elegans,XM_034791724.1; C.mydas,XM_037888484.1;T.carolinatriunguis,XM_026659251.1; C.reevesiis,XM_039510142.1; C.picta bellii,XM_024113109.1; D.coriacea,XM_038381465.2.The black and gray shadows represent the same and similar sites,respectively.

2.2 中華鱉Dkkl1 基因的組織表達

RT-qPCR 結(jié)果顯示，中華鱉Dkkl1mRNA 在3 冬齡成體精巢中極顯著性高表達 (P<0.001)，而在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、肌肉和卵巢中幾乎不表達 (圖3-a)。RTPCR 結(jié)果顯示，該基因僅在3 冬齡中華鱉成體精巢組織中檢測到目的條帶，而在其他體組織中均未檢測到 (圖3-b)。

圖3 中華鱉 Dkkl1 基因在 3 冬齡成體組織中的表達情況注：***.P<0.001；M.DL2000 Marker。Fig.3 Expression of Dkkl1 gene in tissues of 3-winter-age adult P.sinensisNote: ***.P<0.001; M.DL2000 Marker.

2.3 中華鱉不同發(fā)育時期精巢中Dkkl1 基因的表達變化

通過RT-qPCR 檢測中華鱉Dkkl1基因在不同發(fā)育時期精巢中的表達變化。結(jié)果顯示，隨著中華鱉年齡的增長，其精巢中Dkkl1基因的表達量逐漸上升，并在3 冬齡時達到頂峰。此外，Dkkl1基因在2 冬齡和3 冬齡精巢中的表達量極顯著高于1 冬齡 (P<0.001)，而2 冬齡和3 冬齡精巢之間的表達差異不顯著 (P>0.05) (圖4)。

圖4 中華鱉 Dkkl1 基因在不同發(fā)育時期精巢中的表達情況注：**.P<0.01表示差異極顯著。Fig.4 Expression of P.sinensis Dkkl1 gene in different developmental periods of testisNote: **.P<0.01 represents very significant difference.

2.4 E2 和17α-MT 處理對中華鱉精巢Dkkl1 基因表達的影響

對雄性中華鱉進行E2和17α-MT 激素處理后，其精巢中Dkkl1基因的表達量顯著降低 (P<0.05)。E2處理后，精巢中Dkkl1基因的表達量持續(xù)下降，至第48 小時幾乎為0，但是在7 d 后得到部分恢復；17α-MT 處理后，精巢中Dkkl1基因的表達量同樣受到顯著性抑制 (P<0.05)，在第48 小時達到最低值，但在第7 天顯著上升 (P<0.05) (圖5)。

圖5 中華鱉精巢中 Dkkl1 基因?qū)?17β-雌二醇和17α-甲基睪酮處理后的表達響應注：不同小寫字母表示組間存在顯著性差異(P<0.05)。Fig.5 Expression response of Dkkl1 gene in testis of P.sinensis to E2 and 17α-MT treatmentNote: Different lowercase letters represent significant differences between groups (P<0.05).

3 討論

本實驗通過克隆得到中華鱉Dkkl1基因的cDNA 序列，序列長823 bp，共編碼222 個氨基酸，氨基酸序列比對和NJ 進化樹結(jié)果表明其與爬行類親緣關(guān)系最近。RTqPCR 和RT-PCR 結(jié)果顯示Dkkl1mRNA 在精巢組織中高表達且極顯著高于卵巢等其他組織 (P<0.001)，表明Dkkl1基因表達在中華鱉中具有性別二態(tài)性和組織特異性。這與在小鼠和人類中發(fā)現(xiàn)的兩性差異表達模式類似。Dkkl1基因的組織分布研究表明，Dkkl1mRNA 僅在睪丸中表達豐富，而在附睪和其他組織中幾乎不表達。此外，人類基因芯片結(jié)果顯示Dkkl1基因在成年男性睪丸中的雜交信號強度是胎兒睪丸的405.56 倍，對人體多個組織的RTPCR 分析表明，Dkkl1mRNA 僅在睪丸中表達，Western blot 分析也表明Dkkl1基因主要在人睪丸中表達[5]。綜上所述，推測Dkkl1基因在中華鱉睪丸形成或功能維持上可能具有重要的調(diào)控作用。

同時，本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著中華鱉年齡的增長，其精巢中Dkkl1基因的表達量逐漸上升，并在3 冬齡時達到頂峰，Dkkl1基因在中華鱉成體睪丸中的表達與其睪丸發(fā)育和精子發(fā)生的過程大致吻合。1 冬齡中華鱉的睪丸主要由精原細胞組成；2 冬齡時逐漸分化為初級精母細胞和次級精母細胞，并且在生精管中觀察到少量精子；3 冬齡時已經(jīng)完全性成熟，睪丸中產(chǎn)生大量成熟精子[33]。Dkkl1基因這種特殊的表達模式與睪丸發(fā)育成熟程度呈正相關(guān)，并且很可能參與了精子發(fā)生過程。因此，在生產(chǎn)實踐中通過Dkkl1基因的相對表達量可預估中華鱉睪丸的發(fā)育成熟程度，這可為選育高繁殖力和優(yōu)秀的雄性親本提供新的生物指標。

精子發(fā)生是雌激素與雄激素共同調(diào)節(jié)的結(jié)果[34]。E2是一種天然的雌激素[35]，17α-MT 是一種具有雄激素效應的內(nèi)分泌干擾物[36]，這兩種物質(zhì)已被廣泛用于與睪丸發(fā)育和精子發(fā)生有關(guān)的功能研究[37-38]。本實驗通過向雄性中華鱉注射外源性激素E2和17α-MT 后，發(fā)現(xiàn)兩者均可顯著抑制Dkkl1基因的表達。相比于17α-MT，E2對Dkkl1基因的抑制作用更強，在注射12 h 后，其表達量幾乎為零。有研究表明，外源性雌激素可通過影響雌激素受體途徑誘導精子發(fā)生障礙，并對精子的質(zhì)量和受精潛力產(chǎn)生負面影響[39]，低劑量的E2可延遲精子產(chǎn)生，而高劑量的E2則會完全抑制精子產(chǎn)生[40]。Dkkl1基因在精子發(fā)生過程中被定位在成熟的精子或精子的頂體中[4]，同時還發(fā)現(xiàn)Dkkl1基因在小鼠胎盤發(fā)育和精子發(fā)生過程中表達，并且具有促進精子穿透透明帶的能力，將其敲除后，小鼠體外受精能力顯著降低[6]。因此，外源性激素E2處理可能是抑制Dkkl1基因表達的關(guān)鍵因素。雌、雄激素通過不同的受體途經(jīng)影響精子發(fā)生，而雄激素大多是通過雄激素特異性受體AR 介導的[41]。本實驗中，通過注射外源性激素17α-MT 導致Dkkl1基因的表達受到顯著抑制。Dakhova 等[42]發(fā)現(xiàn)Dkkl1基因是睪酮產(chǎn)生的負調(diào)控因子，敲除Dkkl1基因?qū)е骂惞檀忌擅富駽yp11a和Cyp17表達量增加，使睪酮的合成局部上調(diào)。而注射外源性激素17α-MT 會導致生物體內(nèi)睪酮水平瞬間升高[43]，從而可能抑制中華鱉Dkkl1基因的轉(zhuǎn)錄，以響應體內(nèi)睪酮水平的升高。

4 結(jié)論

本實驗通過克隆得到中華鱉Dkkl1基因的cDNA 片段，對其進行生物學信息分析，發(fā)現(xiàn)中華鱉在進化關(guān)系上與爬行類動物相近。運用RT-PCR 和RT-qPCR 對Dkkl1基因在雌、雄中華鱉各組織和精巢不同發(fā)育時期的表達差異進行了分析，確定Dkkl1基因在3 冬齡成體精巢中顯著高表達，并且隨著年齡的增長其表達量逐漸升高。通過注射外源性激素E2和17α-MT，發(fā)現(xiàn)其可顯著抑制Dkkl1基因在精巢中的表達。由以上結(jié)果可以推論，Dkkl1基因在中華鱉睪丸發(fā)育和成熟過程中起著重要作用，可能與精子發(fā)生密切相關(guān)，且可受外源性激素調(diào)控，這為今后龜鱉類動物睪丸發(fā)育及精子發(fā)生機制的研究拓展了新思路。