武魁，覃杰

（1.第二師24 團(tuán)農(nóng)發(fā)中心 新疆巴音郭楞 841200；2.第二師畜牧獸醫(yī)工作站 新疆鐵門關(guān) 841005）

肺炎是奶牛最常見和危害最嚴(yán)重的疾病之一，嚴(yán)重降低養(yǎng)殖戶積極性[1]。病原菌感染是引起奶牛肺炎的主要原因之一，目前治療奶牛肺炎主要依靠抗菌藥物，但隨著抗菌藥的長(zhǎng)期大量使用，病菌逐漸產(chǎn)生了耐藥性，對(duì)治療肺炎帶來較大的影響。中藥治療奶牛肺炎，具有無藥殘、無耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，但也存在療效不穩(wěn)定、療程長(zhǎng)等缺點(diǎn)。消毒液能有效殺滅環(huán)境細(xì)菌，對(duì)預(yù)防奶牛肺炎有重要的作用。本試驗(yàn)對(duì)從鐵門關(guān)地區(qū)奶牛肺炎分離鑒定出溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌和肺炎鏈球菌這3 種主要致病菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，找到高效抗菌藥和環(huán)境消毒藥，篩選高效中西藥，以期提高治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1）樣品采集。在鐵門關(guān)地區(qū)3 家規(guī)模奶牛場(chǎng)和6 家散養(yǎng)戶采集肺炎奶牛臟器（肝、肺、心、脾和腎）和鼻拭子（采集前不對(duì)肺炎牛進(jìn)行任何針對(duì)性治療和免疫），共50 份。

2）主要培養(yǎng)基和試劑。血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH 肉湯脂等，按常規(guī)方法配置[2]，藥敏紙片按照徐叔云方法制作[3]。

3）主要培養(yǎng)基：普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、脫纖維羊血。細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

4）藥物?？股兀侯^孢喹肟、氨芐西林、頭孢噻呋鈉、頭孢氨芐、慶大霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、四環(huán)素、泰拉霉素、磺胺嘧啶鈉、氟苯尼考；消毒液：氫氧化鈉、聚維酮碘、次氯酸鈉、苯扎溴銨、碘附；中藥注射液：板藍(lán)根注射液、魚腥草注射液、雙黃連注射液，小檗堿注射液[4]。復(fù)方中藥：購(gòu)置單味中藥，按照要求配成荊防敗毒散、款冬花散、清肺散、銀翹散、麻杏石甘湯、參附湯、養(yǎng)陰清肺湯[4]，采用水煎法熬成湯劑，含生藥1 g/mL 的濃度湯劑。以上藥物購(gòu)自巴州鑫鑫畜牧有限公司和庫(kù)爾勒久久動(dòng)物醫(yī)院。

1.2 方法

1）細(xì)菌分離鑒定。將采集的臟器、鼻拭子樣品按照常規(guī)劃線分離細(xì)菌的方法接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基上，于37 ℃細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征，挑取典型單個(gè)菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢。根據(jù)菌落形態(tài)特征、溶血與否、染色特性及菌體形態(tài)初步判定細(xì)菌類屬，參考各種細(xì)菌的生化特性，根據(jù)染色、鏡檢結(jié)果對(duì)分離的菌株有選擇地進(jìn)行生化試驗(yàn)[5-6]。

2）體外抑菌實(shí)驗(yàn)?？股夭捎肒-B 紙片法[3]。將病菌接種于羊血清營(yíng)養(yǎng)肉湯，37 ℃培養(yǎng)18 h，所得菌液用麥?zhǔn)蠞岱ㄟM(jìn)行比濁，用生理鹽水稀釋使其含菌量為1 億個(gè)/mL。吸取菌液0.1 mL 用滅菌L型玻璃棒均勻涂在加血清MH 瓊脂平板表面。然后貼上藥敏紙片。中藥采用瓊脂平板打孔法，在涂布好細(xì)菌的血清MH 瓊脂平板上，用直徑為6 mm 的無菌打孔器打孔，除去瓊脂，吸取含生藥1 g/mL的中藥加入孔中，以剛剛注滿為準(zhǔn)。每種藥物都做3 個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)24 h 后，游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑。消毒藥采用肉湯二倍稀釋法[3]，檢測(cè)最低抑菌濃度。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

抗生素采用按表1 的方法判斷結(jié)果[3]；中藥判定結(jié)果：即：抑菌直徑≥20 mm 為極敏，20 mm＞抑菌直徑≥15 mm 為高敏；15 mm＞抑菌直徑≥10 mm 為中敏，10 mm 以下為低敏。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果。

在血清瓊脂平板上淡灰白色、閃光的露珠狀小菌落。堿性亞甲藍(lán)染色鏡檢可見兩極濃染菌體。生化鑒定結(jié)果：分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖和半乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。發(fā)酵甘露醇、山梨醇和木糖。對(duì)乳糖、鼠李糖、楊昔、肌醇、菊糖、側(cè)金盞花醇不發(fā)酵。形成靛基質(zhì)，觸酶和氧化酶均為陽(yáng)性，甲基紅試驗(yàn)和VP 試驗(yàn)均為陰性。鑒定為多殺性巴氏桿菌。

在血清瓊脂平板上光滑、半透明的菌落，直徑1～2 mm。堿性美藍(lán)染色鏡檢可見兩極濃染菌體。發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，氧化酶陽(yáng)性。不發(fā)酵山梨糖、海藻糖、甘露糖、阿拉伯糖或葡萄糖苷。發(fā)酵甘露醇、山梨醇、木糖、麥芽糖及糊精。靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性。鑒定為溶血性曼氏桿菌。

在血清瓊脂平板形成小圓形、隆起、表面光滑、濕潤(rùn)的菌落。培養(yǎng)初期菌落隆起昰穹隆形，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，邊緣隆起成“臍狀”。膽汁溶解試驗(yàn)陽(yáng)性、Optochin 敏感試驗(yàn)陽(yáng)性。鑒定為肺炎鏈球菌。

溶血性曼氏桿菌檢出率最高32%，其次為肺炎鏈球菌24%，再次多殺性巴氏桿菌22%，見表2。

表2 細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果

2.2 抗菌藥試驗(yàn)結(jié)果

抗生素中對(duì)溶血性曼氏桿菌敏感的為頭孢喹肟、頭孢氨芐、達(dá)氟沙星、泰拉霉素、氟苯尼考；對(duì)多殺性巴氏桿菌敏感的為頭孢喹肟、達(dá)氟沙星、氟苯尼考、泰拉霉素；對(duì)肺炎鏈球菌敏感的為頭孢喹肟、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考、泰拉霉素；中藥注射液中小檗堿注射液對(duì)溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎鏈球菌極敏，雙黃連注射液對(duì)溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌中敏。復(fù)方中藥中清肺散對(duì)溶血性曼氏桿菌中敏，對(duì)其余兩種致病菌低敏，荊防敗毒散銀翹散對(duì)溶血性曼氏桿菌低敏麻杏石甘湯對(duì)多殺性巴氏桿菌低敏，其余無抑菌圈，具體結(jié)果見表3。

表3 各種藥物對(duì)三種主要致病菌的抑菌效果（單位mm）

2.3 消毒藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果

消毒液中MIC 最低是氫氧化鈉，其次為碘附，聚維酮碘、次氯酸鈉、苯扎溴銨相對(duì)較高，具體見表4。

表4 消毒液的最低抑菌濃度（MIC）

3 討論

肺炎病因復(fù)雜，但主要有兩個(gè)方面：①病原性肺炎由病毒、細(xì)菌或寄生蟲引起；②是非病原性肺炎由營(yíng)養(yǎng)因素及飼養(yǎng)管理引起。本實(shí)驗(yàn)對(duì)肺炎進(jìn)行分離鑒定發(fā)現(xiàn)溶血性曼氏桿菌檢出率最高32%，其次為肺炎鏈球菌24%，再次多殺性巴氏桿菌22%，并且多為混合感染，說明奶牛感染這3 種病原菌嚴(yán)重。本試驗(yàn)中有2 份樣品未檢測(cè)到任何病原，可能為非病原性肺炎。

3 種主要病原菌對(duì)頭孢喹肟、頭孢氨芐、氟苯尼考、泰拉霉素敏感，對(duì)磺胺嘧啶鈉和四環(huán)素已經(jīng)完全耐藥，對(duì)其它藥物也有不同程度的耐藥?？梢妼?duì)常用的抗生素已產(chǎn)生不同程度耐藥性，對(duì)不常用的產(chǎn)生耐藥性的少。可能是養(yǎng)殖場(chǎng)由于長(zhǎng)期大劑量的使用某些抗生素，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。選擇頭孢喹肟、頭孢氨芐、氟苯尼考、泰拉霉素這4 種抗生素對(duì)治療奶牛肺炎可能有較好的效果。

在幾種常用的中藥注射液中小檗堿具有較好的抑菌效果，其它單味中藥抑菌效果較差。在復(fù)方中藥中，所選擇的復(fù)方都是治療奶牛肺炎的經(jīng)典藥物，其中清肺散對(duì)3 種病菌有一定的效果，銀翹散對(duì)溶血性曼氏桿菌有一定效果麻杏石甘湯對(duì)多殺性巴氏桿菌有一定效果，其它復(fù)方體外抑菌效果都較差，這可能中藥主要通過增加機(jī)體的免疫力來抑菌、殺菌，不直接殺菌有關(guān)。選擇小檗堿、清肺散、銀翹散、麻杏石甘湯治療奶牛肺炎可能有較好的效果。

根據(jù)效果在消毒液中氫氧化鈉對(duì)主要病原菌的抑菌效果都好，其余幾種藥浴液出現(xiàn)不同程度的低敏現(xiàn)象。說明某些細(xì)菌已產(chǎn)生耐藥性。這就要求低敏消毒液使用濃度要高于規(guī)定的使用濃度，否則沒有殺菌效果或?qū)δ撤N細(xì)菌殺菌效果差。消毒液選用氫氧化鈉可能有較好的效果?！?/p>