劉 丹 劉盛均 陳 楊 柯 琦 王安群 四川省綿陽(yáng)市中心醫(yī)院病理科 621000

惡性黑色素瘤是病理科日常工作中比較常見(jiàn)的一類腫瘤,需進(jìn)行免疫組化染色輔助診斷,但部分黑色素瘤中黑色素大量沉積,形成深淺不一的棕黃色、棕褐色或棕黑色的黑色素顆粒,與免疫組化染色常用的DNA顯色劑顏色非常接近,相互干擾,難以區(qū)分,影響判讀。這就需要用一些方法來(lái)去除這些干擾,傳統(tǒng)的脫色素方法是用強(qiáng)氧化劑高錳酸鉀/草酸法去除黑色素后再進(jìn)行免疫組化染色,此方法易造成組織脫片及破壞抗原,不被推薦。目前很多學(xué)者推薦免疫組織化學(xué)染色完成后,運(yùn)用不同的復(fù)染液將黑色素顆粒顯色為不同程度的綠色,可改善掉片現(xiàn)象及抗原性的丟失,但此方法不適用于含大量黑色素的組織,存在物理遮蔽影響抗原抗體結(jié)合,造成假陰性等問(wèn)題。據(jù)病理診斷的需要及染色技術(shù)的可操作性,筆者探索在EDTA(pH 9.0)抗原修復(fù)液中加入過(guò)氧化氫使過(guò)氧化氫濃度為0.75%,在修復(fù)的同時(shí)去除黑色素,此方法簡(jiǎn)便快捷經(jīng)濟(jì),獲得滿意效果,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2021年5例本院已確診的富含黑色素的惡性黑色素瘤存檔蠟塊,其中鼻咽部1例、足根部2例;眼瞼2例,另選取1例HE染色顯示含極少黑色素的惡性黑色素瘤存檔蠟塊作為對(duì)照。試劑:抗原修復(fù)液(EDTA,pH 9.0)、PBS磷酸鹽緩沖液、一抗HMB45、S-100、MelanA、Ki-67及免疫組化Maxvision試劑盒均購(gòu)自福州邁新公司;30%過(guò)氧化氫購(gòu)自成都市科隆化學(xué)品有限公司。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組兩組。對(duì)照組不做脫色素處理,實(shí)驗(yàn)組在EDTA(pH 9.0)抗原修復(fù)液中加入過(guò)氧化氫使過(guò)氧化氫濃度為0.75%,修復(fù)的同時(shí)去除黑色素處理。

1.2 方法 所有標(biāo)本均用10%中性緩沖福爾馬林固定,梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟浸泡后包埋制成蠟塊,選取5例黑色素瘤組織的腫瘤且富含黑色素部分與對(duì)照組織一同制成芯片組織,連續(xù)切片10張,編號(hào)1～10,厚3μm,多聚賴氨酸包被載玻片撈片,65℃烤片2h,脫蠟至水待用。對(duì)照組:取編號(hào)為1的切片常規(guī)步驟做HE染色,再取編號(hào)為2～5的切片常規(guī)Maxvision法行免疫組織化學(xué)染色,2～5號(hào)分別標(biāo)記HMB45、S-100、MelanA、Ki-67。免疫組化染色具體步驟如下:pH 9.0 EDTA高溫修復(fù)20min,3%H2O215min,一抗室溫45min,二抗室溫20min,DAB顯色室溫10min,流水沖洗,蘇木素對(duì)比染色后脫水透明封片。實(shí)驗(yàn)組:取編號(hào)為6～10的切片,放入沸騰的EDTA(pH 9.0)過(guò)氧化氫溶液中高溫修復(fù)20min,自然冷卻,蒸餾水洗,取出編號(hào)為6的切片常規(guī)步驟做HE染色,7～10號(hào)切片常規(guī)Maxvision法行免疫組織化學(xué)染色,7～10號(hào)切片分別標(biāo)記抗體HMB45、S-100、MelanA、Ki-67室溫45min,二抗室溫20min,DAB顯色室溫10min,流水沖洗,蘇木素對(duì)比染色后脫水透明封片。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 對(duì)照組未做脫色素處理組織HE染色,組織中可見(jiàn)大量棕黃色黑色素顆粒,影響診斷(見(jiàn)圖1)。實(shí)驗(yàn)組H2O2含量為0.75%EDTA(pH 9.0)過(guò)氧化氫溶液修復(fù)后HE染色黑色素去除干凈,組織結(jié)構(gòu)完整色彩亮麗,對(duì)比鮮明,核染色質(zhì)清晰(見(jiàn)圖2)。

圖1 未脫色素HE染色

圖2 EDTA過(guò)氧化氫溶液高溫修復(fù)脫色素后HE染色

2.2 IHC染色 對(duì)照組未脫色素常規(guī)Maxvision法免疫組化化學(xué)染色,內(nèi)源性濃密的黑色素顆粒與二氨基聯(lián)苯胺(Dia-minobenzidine,DAB)染色顯示的棕黃色相互混淆,無(wú)法判讀(見(jiàn)圖3);實(shí)驗(yàn)組H2O2含量為0.75%EDTA(pH 9.0)過(guò)氧化氫溶液修復(fù)后Maxvision法免疫組織化學(xué)染色,黑色素去除干凈,陽(yáng)性著色清晰,強(qiáng)度尚好,定位準(zhǔn)確(見(jiàn)圖4)。

圖3 未脫色素Hmb45免疫組織化學(xué)染色

圖4 EDTA過(guò)氧化氫高溫修復(fù)脫色素后Hmb45免疫組織化學(xué)染色

3 討論

黑色素瘤是來(lái)源于黑色素細(xì)胞的一種高度惡性的腫瘤,多發(fā)生于皮膚,也可見(jiàn)于黏膜和內(nèi)臟。免疫組織化學(xué)檢測(cè)常與組織病理檢查相結(jié)合用于輔助診斷和鑒別診斷,檢測(cè)指標(biāo)主要包括反映細(xì)胞增殖的相關(guān)指標(biāo)Ki-67、cyclin D1等,以及黑色素細(xì)胞的特征性標(biāo)志物如S-100蛋白、SOX-10、MelanA、HMB45等。

常規(guī)免疫組織化學(xué)通常采用DAB顯色,陽(yáng)性區(qū)域呈棕黃色顆粒與內(nèi)源性棕黃色或棕褐色黑色素顆粒顏色近似,相互干擾,難以區(qū)分,診斷困難,容易誤診。因此需要進(jìn)行脫色素處理。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)脫黑色素進(jìn)行了多種方法的探索,大致分為五類。第一類是在常規(guī)免疫組織化學(xué)染色DAB顯色后,運(yùn)用不同的染液復(fù)染將黑色素顆粒顯色為不同程度的綠色[1-3],可與棕褐色的陽(yáng)性顆粒區(qū)分,但無(wú)論使用哪種染液復(fù)染,都存在有過(guò)量黑色素在組織和細(xì)胞中堆積時(shí)物理遮蔽嚴(yán)重的現(xiàn)象,使得組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的形態(tài)不清,細(xì)胞的異型性和核分裂象觀察困難,并妨礙抗體與細(xì)胞中抗原結(jié)合,造成假陰性或染色減弱的現(xiàn)象,影響診斷,因此此方法不適合含大量黑色素組織。第二類是運(yùn)用羅氏免疫組化ultra View Universal AP Red Delection Kit(AP染色液)來(lái)標(biāo)記抗原,FR顯色使陽(yáng)性顆粒為玫紅色與組織原有的棕褐色色素顆粒形成對(duì)比[4],但FR顯色切片不可使用乙醇類脫水劑脫水,接觸乙醇類脫水劑可使標(biāo)記的紅色陽(yáng)性顆粒褪色,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗;也不能使用二甲苯進(jìn)行透明處理,影響切片的透明度和清晰度;并且FR顯色切片需使用水性封片劑封固,不利于切片的長(zhǎng)期保存;同時(shí)也存在細(xì)胞中堆積過(guò)量黑色素時(shí)會(huì)妨礙抗體與細(xì)胞中抗原結(jié)合,造成假陰性或染色減弱的問(wèn)題。第三類是在組織脫水前進(jìn)行脫黑色素處理獲得滿意結(jié)果[5],但該方法耗時(shí)太長(zhǎng)(36～40h),脫黑色素時(shí)間與黑色素含量成正比,脫色時(shí)間難以掌握,且對(duì)是否含有黑色素難以估計(jì)。第四類是運(yùn)用不同濃度的高錳酸鉀脫黑色素[6],也是目前最經(jīng)典常用的方法,但組織切片經(jīng)強(qiáng)氧化劑脫黑色素處理后進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)存在一定的問(wèn)題:(1)這種傳統(tǒng)的脫色素方法費(fèi)時(shí)長(zhǎng)(2～4h),脫色素的時(shí)間與色素含量成正比,且對(duì)是否含有色素難以估計(jì),脫色時(shí)間難以掌握;(2)草酸漂白時(shí)間不易控制,草酸漂白時(shí)要根據(jù)色素多少,隨時(shí)關(guān)注切片顏色變化,至組織不再脫色時(shí)應(yīng)立即水洗終止反應(yīng),若漂白時(shí)間過(guò)短,脫色不干凈,若漂白時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核淡然不著色,組織結(jié)構(gòu)不清,影響閱片;(3)需考慮抗原的敏感性和特異性存在的差異[7],切片長(zhǎng)時(shí)間浸泡在高錳酸鉀中會(huì)出現(xiàn)部分抗原丟失,抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)失去活性的情況,從而出現(xiàn)弱陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果;(4)易造成組織掉片,可能是由于強(qiáng)氧化劑作用于切片破壞了玻片上的涂膠多聚賴氨酸陽(yáng)離子基團(tuán)的結(jié)構(gòu),使載玻片黏附力下降導(dǎo)致的,從而無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的免疫組織化學(xué)染色。第五類是用H2O2脫黑色素,H2O2對(duì)大部分抗原均適用,室溫下對(duì)抗原性基本無(wú)影響。劉興華等[8]采用DAB顯色后再用10%H2O2浸染,37℃過(guò)夜,出片時(shí)間會(huì)延遲1d,且若機(jī)染時(shí)復(fù)染了蘇木素,蘇木素也會(huì)被H2O2氧化為無(wú)色,脫色素后需再次復(fù)染蘇木素,增加了操作步驟,稍顯煩瑣。陳永華等[9]采用PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制的1.8%H2O2溶液在70℃時(shí)經(jīng)70～130min,陳瓊榮等[10]采用3%H2O2加熱至40℃持續(xù)90min快速升溫至55℃持續(xù)25min,或3%H2O2過(guò)夜處理,取得較好效果,但仍需耗時(shí)2h左右,變換的溫度也不易控制。

經(jīng)閱讀大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),H2O2脫黑色素優(yōu)于高錳酸鉀及其他黑色素染色法,但費(fèi)時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題未得到解決。H2O2脫色素的能力與溫度和處理時(shí)間密切相關(guān),溫度越高時(shí)間越長(zhǎng)脫色素越徹底,但對(duì)組織結(jié)構(gòu)的破壞和抗原性的丟失也越嚴(yán)重,所以運(yùn)用H2O2法脫黑色素時(shí),處理好溫度時(shí)間組織結(jié)構(gòu)的完整性和抗原性的關(guān)系至關(guān)重要,既要保證色素去除干凈又要保證組織結(jié)構(gòu)完整和抗原性不丟失。筆者考慮在H2O2脫黑色素方法的基礎(chǔ)上,繼續(xù)降低H2O2濃度提高溫度驗(yàn)證是否能達(dá)到滿意的效果,經(jīng)反復(fù)試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)EDTA(pH 9.0)本身沒(méi)有脫色素的作用,但在EDTA(pH 9.0)修復(fù)液中加入H2O2使H2O2濃度為0.75%,富含黑色素組織切片在H2O2濃度為0.75%的EDTA(pH 9.0)過(guò)氧化氫溶液中修復(fù),修復(fù)的同時(shí)可完全去除黑色素,對(duì)組織結(jié)構(gòu)和抗原性沒(méi)有明顯影響,不影響組織修復(fù),后續(xù)免疫組化及HE染色得到滿意的效果。

在H2O2濃度為0.75%的EDTA(pH 9.0)過(guò)氧化氫溶液中修復(fù),高溫修復(fù)的同時(shí)去除黑色素的方法操作簡(jiǎn)單方便,黑色素脫色均勻徹底,無(wú)論黑色素含量多少都可適用;組織完整性、抗原性均保留完整,減少了弱陽(yáng)性和假陰性的出現(xiàn);無(wú)須額外花時(shí)間脫色素,大幅縮短操作時(shí)間,避免了脫色時(shí)間、漂白時(shí)間、變化溫度等不易控制因素的干擾;該方法還可省略3%H2O阻斷這一步驟,節(jié)約時(shí)間減少成本,并可與不需脫色素組織同步操作;染色結(jié)束后可用酒精脫水二甲苯透明保證了切片的透明度和清晰度。值得廣大病理工作者借鑒。值得注意的是過(guò)氧化氫加熱易分解為H2O和O2,0.75%H2O2濃度極低不會(huì)有爆炸風(fēng)險(xiǎn),但加熱過(guò)程中仍應(yīng)保持敞口加熱。本實(shí)驗(yàn)室富含黑色素的惡性黑色素瘤標(biāo)本量較少,后續(xù)還需大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。