李小亮 倫瑞花

1 河南省焦作市第二人民醫(yī)院 454001; 2 焦作市婦幼保健院

腎上腺皮質癌(Adrenocortical carcinoma,ACC)是一種罕見的發(fā)生于腎上腺皮質的惡性腫瘤,侵襲性強并易發(fā)生轉移,患者的5年生存率僅有5%～10%[1]。目前,該腫瘤的治療方法有手術、放療、化療以及分子靶向治療[2]。其中,分子靶向治療作為一種新型方法在ACC的治療中顯現(xiàn)出了巨大的潛力。尋找新的治療靶點,探索其分子機制,在ACC的治療中具有重要意義。

Tob1(Transducer of ErbB2.1)是細胞異位基因ErbB2轉錄因子抗增殖蛋白家族成員,在乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌等多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制的作用[3-4]。最新在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)Tob1對細胞自噬有誘導作用[5]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)Tob1在腎上腺皮質癌患者中表達偏低,但其影響ACC的具體分子機制尚未明確。本研究擬探討Tob1在腎上腺皮質癌中對細胞自噬的作用,以明確Tob1對ACC腫瘤抑制作用的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人腎上腺皮質癌細胞株SW-13購于美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection,ATCC);胎牛血清、DMEM、F12培養(yǎng)基購于美國Gibco公司;載體pcDNA3.1購于美國Invitrogen公司;3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)購于美國Sigma公司;PCR引物購于上海生工生物工程有限公司;蛋白一抗和二抗購于美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和分組處理:SW-13細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中,置于37 °C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3d傳代一次,取對數(shù)生長期細胞進行分組培養(yǎng)?？蛰d質粒(pcDNA3.1)或Tob1過表達質粒(pcDNA3.1-Tob1)采用LipofectamineTM3000試劑轉染SW-13細胞。細胞分為3組:對照組(control),正常培養(yǎng)的SW-13細胞;空載質粒對照組(pcDNA3.1),SW-13細胞轉染空載質粒pcDNA3.1;pcDNA3.1-Tob1質粒轉染組(pcDNA3.1-Tob1),SW-13細胞轉染質粒pcDNA3.1-Tob1。后續(xù)自噬抑制劑處理組(pcDNA3.1-Tob1+3-MA),在pcDNA3.1-Tob1質粒轉染的SW-13細胞中加入5mmol/L的自噬抑制劑3-MA處理。

1.2.2 實時熒光定量PCR:采用TRIzol試劑提取各組SW-13細胞總RNA進行反轉錄合成模板cDNA。采用SYBR Green進行qRT-PCR。反應體系(20μl)為9μl SYBR Green Mix,2μl上游引物,2μl下游引物和dd H2O。反應條件為95℃ 10min;95℃ 15s,54℃ 10s,72℃ 30s,30個循環(huán);最后在72℃下延伸5min。引物信息如下:Tob1上游引物5’-CTTCAGGAGGTGTTCAC-3’,下游引物5’-AACCTTTACCACTGCCACTT-3’;GAPDH上游引物5’-AGCCACATCGCTGAGACA-3’,下游引物5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’。以GAPDH 為內參基因,用 2-ΔΔCt計算 Tob1 mRNA 表達量。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達:采用RIPA細胞蛋白裂解液裂解各組SW-13細胞,提取細胞總蛋白,使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。同等量蛋白經SDS-PAGE電泳后,進行電轉膜,隨后用5%脫脂奶粉室溫封閉2h。加入Tob1、LC3、Beclin-1、p62和GAPDH蛋白一抗在4℃孵育過夜,漂洗后加入二抗室溫孵育1h。滴加ECL化學發(fā)光液,凝膠成像分析系統(tǒng)成像,結果采用ImageJ圖像處理軟件分析,以GAPDH為內參,檢測目的蛋白相對表達水平。

1.2.4 LC3免疫熒光檢測:在各組SW-13細胞中加入多聚甲醛固定15min。加入5% 牛血清蛋白后室溫封閉1h,按說明加入稀釋的LC3蛋白一抗 4℃過夜,隨后加入二抗室溫孵育1h。最后在熒光顯微鏡下觀察并記錄細胞的熒光狀況。

1.2.5 CCK-8檢測細胞增殖:在各組SW-13細胞中加入將CCK-8試劑與細胞培養(yǎng)基以1∶10混合形成的培養(yǎng)液,37°C孵育4h,用酶標儀在490nm波長處測量吸光值(A值),計算細胞增殖率。

1.2.6 Tunel檢測細胞凋亡:在待測SW-13細胞加入4%多聚甲醛固定30min。隨后加入50μl Tunel反應混合液避光孵育1h,PBS漂洗后再加入50μl DAPI反應15min。最后置于熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗數(shù)據(jù)采用 Graphpad Prism 7.01統(tǒng)計軟件分析,結果以平均值±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析及Bonferroni檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 pcDNA3.1-Tob1轉染人腎上腺皮質癌細胞SW-13后Tob1表達顯著上調 采用Tob1過表達質粒轉染人腎上腺皮質癌SW-13細胞,qRT-PCR和western blot結果如圖1所示,與control組相比,Tob1的mRNA和蛋白表達在pcDNA3.1-Tob1組中上調,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 轉染pcDNA3.1-Tob1對SW-13細胞中Tob1表達的影響

2.2 pcDNA3.1-Tob1轉染影響人腎上腺皮質癌細胞SW-13中自噬蛋白的表達 如圖2所示,與對照組相比,pcDNA3.1-Tob1組中LC3-Ⅰ蛋白表達顯著下降,LC3-Ⅱ蛋白表達顯著提升,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時pcDNA3.1-Tob1質粒的轉染顯著下調SW-13細胞中p62的表達,上調Beclin1的蛋白表達(P<0.05)。

圖2 轉染pcDNA3.1-Tob1對SW-13細胞中自噬蛋白表達的影響

2.3 pcDNA3.1-Tob1轉染促進人腎上腺皮質癌細胞SW-13自噬 LC3免疫熒光檢測SW-13細胞自噬水平,結果如圖3所示,control組中綠色熒光斑點較少,而在pcDNA3.1-Tob1組中能觀看到明顯的綠色熒光斑點聚集,表明pcDNA3.1-Tob1質粒的轉染顯著上調了SW-13細胞自噬水平。

圖3 轉染pcDNA3.1-Tob1對SW-13細胞自噬的影響

2.4 Tob1通過促進自噬抑制人腎上腺皮質癌細胞SW-13增殖 采用自噬抑制劑3-MA處理pcDNA3.1-Tob1轉染的SW-13細胞。如圖4所示,pcDNA3.1-Tob1質粒的轉染顯著抑制SW-13細胞增殖。同時與pcDNA3.1-Tob1組相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA組細胞增殖明顯提升(P<0.05)。

圖4 3-MA對pcDNA3.1-Tob1轉染的SW-13細胞增殖的影響

2.5 Tob1通過促進自噬提升人腎上腺皮質癌細胞SW-13凋亡 如圖5所示,pcDNA3.1-Tob1質粒的轉染顯著提升SW-13細胞凋亡。與pcDNA3.1-Tob1組相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA組細胞凋亡下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖5 3-MA對pcDNA3.1-Tob1轉染的SW-13細胞凋亡的影響

3 討論

腎上腺皮質癌作為一種內分泌型惡性腫瘤,進展快,病死率高[6]。探索腎上腺皮質癌發(fā)生發(fā)展的分子機制、研發(fā)新型治療方式是該疾病的防治工作重點。隨著對腫瘤生物學行為認識的不斷深入,細胞死亡在包括腎上腺皮質癌在內多種癌癥中的作用越來越受到研究者重視[7-8]。細胞自噬是程序性細胞死亡的一種,通過溶酶體吞噬細胞器、蛋白質等造成細胞死亡,該過程廣泛存在于多種疾病的病理進程中,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用[9-10]。已有研究顯示,在腎上腺皮質癌中低表達的抑癌基因Tob1在胃癌中能激活細胞自噬[5]。據(jù)此,筆者通過轉染含有Tob1的表達載體pcDNA3.1-Tob1至人腎上腺皮質癌細胞SW-13,探討Tob1在SW-13細胞中對自噬的作用以及對人腎上腺皮質癌細胞的影響。

本研究首先對轉染了pcDNA3.1-Tob1的SW-13細胞中的Tob1表達進行測定,結果表明與正常SW-13相比,轉染pcDNA3.1-Tob1質粒的細胞中Tob1的mRNA和蛋白表達均顯著提升,表明該質粒能在SW-13細胞中有效過表達Tob1。LC3是檢測自噬活性的標志性蛋白。自噬過程中胞質內的Ⅰ型LC3蛋白在經過泛素樣加工修飾后,結合磷脂酰乙醇胺形成脂溶性的Ⅱ型LC3蛋白,進而參與自噬泡膜的延伸,并促進自噬體的成熟[11]。銜接蛋白p62可與LC3相互結合,轉染至自噬體后降解,與自噬的活性呈負相關[12]。Beclin 1是自噬調節(jié)的關鍵因子之一,可招募自噬相關蛋白促進自噬前體形成[13]。本研究結果顯示,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1在Tob1過表達的SW-13細胞中顯著上調,p62蛋白表達顯著下調。進一步通過免疫熒光法檢測得出Tob1過表達顯著提升SW-13細胞的自噬水平,與在胃癌中結果一致。

3-MA是一種經典的自噬抑制劑,能夠通過抑制Class PI3K-Ⅲ,阻止自噬體的形成,進而抑制細胞內自噬的發(fā)生[14]。為了研究Tob1對自噬的促進作用對人腎上腺皮質癌細胞的影響,筆者在Tob1過表達的SW-13細胞中加入自噬抑制劑3-MA處理。本研究結果顯示,Tob1的過表達顯著抑制了SW-13的細胞增殖,促進細胞凋亡,與筆者前期在人腎上腺皮質癌細胞H295R中的結果相一致。同時與pcDNA3.1-Tob1質粒轉染組相比,3-MA的加入提升了SW-13細胞增殖,抑制細胞凋亡,表明Tob1在SW-13細胞中發(fā)揮的抑癌基因作用是通過激活自噬產生的。

綜上所述,Tob1可通過激活細胞自噬抑制人腎上腺皮質癌細胞SW-13的細胞增殖,并促進其凋亡,為Tob1作為分子靶標應用于人腎上腺皮質癌的治療提供了理論依據(jù)和實驗基礎。