盧 穎

復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院,福建省廈門市 361015

腎細胞癌(Renal cell carcinoma,RCC)簡稱腎癌,是常見惡性腫瘤,占成人所有惡性腫瘤2%～3%,每年新增腎癌患者30萬例,死亡10萬例[1]。世界各地腎癌的發(fā)病率差異較大,亞洲地區(qū)發(fā)病率較低,但是近年來我國腎癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。由于腎細胞癌對放療、化療均不敏感,其治療效果較差,大約30%的患者在診斷時就發(fā)現(xiàn)了腫瘤轉(zhuǎn)移,還有30%在治療過程中出現(xiàn)了轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移性腎細胞癌5年生存率僅為2%,中位生存期為8個月[3-4]。有研究指出有代謝綜合征的腎癌患者,其腫瘤細胞的侵襲性往往更高[5]。谷氨酸的代謝是細胞代謝中的重要組成部分,已有研究證實谷氨酸信號通路參與腫瘤的發(fā)生、進展。Pollock PM等人于2003年第一次報道了代謝型谷氨酸受體-1(GRM1)與腫瘤潛在聯(lián)系[6]。Martino JJ等發(fā)現(xiàn)RCC中親代謝型谷氨酸受體-1(mglur1)的表達影響腫瘤細胞的生長[7]。筆者推測GRM1可能參與RCC的發(fā)生發(fā)展,因此本研究首先分析GRM1在RCC患者腫瘤組織中的表達情況,其次通過慢病毒轉(zhuǎn)染抑制RCC腫瘤細胞中GRM1的表達,觀察GRM1對RCC細胞增殖、遷移、侵襲等的影響,及其可能存在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 人腎細胞癌組織及癌旁組織標本來自我院,人腎透明細胞腺癌細胞(786-O)購自中科院上海生命科學研究院。DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清來自美國 Gibco 公司。GRM1、mTOR、GAPDH抗體購自Proteintech公司。LY404039和SC79購自Selleck公司。轉(zhuǎn)染試劑盒、實時熒光定量PCR試劑盒、CCK-8試劑盒、即用型SP免疫組化試劑盒、Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。Transwell小室及基質(zhì)膠購自美國Corning公司。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 在無菌超凈臺中,將786-O細胞接種在含10% FBS和DMEM的培養(yǎng)皿,37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞以4×105/ml密度接種于6孔板,當細胞密度融合到70%～80%時,根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行轉(zhuǎn)染,分為對照序列sh-NC和3組干擾序列shGRM1-1、shGRM1-2和shGRM1-3,并檢測轉(zhuǎn)染效率。sh-NC為非目標基因干擾序列,自身無功能,用以排除轉(zhuǎn)染過程本身對細胞的影響。3組干擾序列相同,重復(fù)實驗以減少誤差。

1.3 細胞分組 抑制GRM1影響786-O細胞生物行為的實驗分為對照組“786-O組”(即非干預(yù)狀態(tài)),沉默基因?qū)φ战M“786-O-shNC組”(即轉(zhuǎn)染對照序列sh-NC,為無功能性非目標基因干擾序列,下文簡稱“shNC組”),GRM1沉默基因組“786-O-shGRM1組”(即轉(zhuǎn)染干擾序列shGRM1后細胞不表達GRM1,下文簡稱“shGRM1組”)和GRM1抑制劑組“786-O+LY404039組”(即通過GRM1抑制劑LY404039抑制786-O細胞表達GRM1,下文簡稱“LY404039組”)。相關(guān)機制研究實驗分為“786-O-shGRM1組”(同前所述),使用AKT激活劑組“786-O-shGRM1+SC79組”(即AKT激活劑SC79作用于經(jīng)轉(zhuǎn)染后GRM1被沉默的細胞,下文簡稱shGRM1+SC79組)和“786-O+LY404039+SC79組”(即AKT激活劑SC79作用于GRM1被抑制劑LY404039所影響的細胞)。

1.4 免疫組化染色 組織經(jīng)固定、石蠟包埋、切片后,根據(jù)免疫組化試劑盒說明書步驟進行染色,DAB顯色,脫水,透明,中性樹膠封固。

1.5 RT-qPCR 腫瘤組織及各組細胞中的總RNA用Trizol試劑提取,且依實時熒光定量PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再進行qPCR。熒光定量計算循環(huán)數(shù)(Cycle threshold,CT),并繪制標準曲線,使用2-ΔΔCT方法進行定量計算。

1.6 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Western blot,WB) 裂解細胞提取總蛋白后將樣本等量上樣至SDS-PAGE凝膠,蛋白經(jīng)電泳分離后恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂乳粉封閉后加入一抗震蕩孵育過夜,用TBST漂洗后室溫震蕩孵育二抗,經(jīng)ECL試劑盒顯色后通過使用凝膠成像分析儀掃描計算灰度值。

1.7 CCK-8 將各組細胞分別接種于96孔板(1×105/孔),每組至少設(shè)置6個重復(fù)孔。37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育,每孔加入10μl CCK-8 (0.5g/L)溶液培養(yǎng)4 h,測定各孔細胞在波長450nm處的光密度(Optical density,OD)值。

1.8 流式細胞術(shù) 對數(shù)生長期細胞經(jīng)細胞篩過濾及PBS洗滌后,取1×105個細胞經(jīng)預(yù)冷75%乙醇4℃過夜處理后加入5μl PI染色液,避光混勻,流式細胞儀檢測周期變化。取2×105個細胞經(jīng)Binding buffer混懸后加入5μl FITC-AnnexinV和5μl PI,避光溫育,流式細胞儀檢測凋亡細胞的百分比。

1.9 Transwell染色 Transwell小室的上室接種細胞(1×105個/孔,無血清培養(yǎng)基),下室加入完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清),孵育48h后分別經(jīng)4%多聚甲醛固定和0.1%結(jié)晶紫染色后,拍照并計數(shù)統(tǒng)計以檢測細胞遷移能力。Martrigel基質(zhì)膠平鋪于Transwell上室后溫育。小室的上室接種細胞(1×105個/孔,無血清培養(yǎng)基),下室加入完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)。孵育48h,PBS清洗去除未穿膜的細胞,4%多聚甲醛固定和0.1%結(jié)晶紫染色后,拍照并計數(shù)統(tǒng)計以檢測細胞侵襲能力。

1.10 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計軟件SPSS22.0用于數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以(Mean±SD)表示,兩兩比較采用t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GRM1在RCC腫瘤組織中高表達 RT-qPCR檢測RCC組織中GRM1的表達水平(見圖1a),與癌旁組織比較,RCC患者的腫瘤組織中GRM1 mRNA表達水平顯著上升(P<0.05)。免疫組化染色檢測GRM1蛋白的表達水平(見圖1b),與癌旁組織比較,GRM1蛋白在RCC患者腫瘤組織中呈明顯陽性表達。這些結(jié)果表明GRM1在RCC腫瘤中高表達,提示GRM1與RCC的發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)系。

圖1 GRM1在RCC腫瘤組織中的表達情況

2.2 構(gòu)建GRM1沉默的RCC腫瘤細胞株 與對照786-O-shNC組比較,熒光顯微鏡觀察到786-shGRM1-1、786-shGRM1-2和786-shGRM1-3各轉(zhuǎn)染組的熒光強度均減弱(見圖2a),RT-qPCR檢測到各轉(zhuǎn)染組細胞中GRM1 mRNA水平均降低(均P<0.01,見圖2b),WB檢測各轉(zhuǎn)染組細胞中GRM1蛋白水平均降低(均P<0.01,見圖2c)。這些結(jié)果表明成功構(gòu)建786-O-shGRM1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。

2.3 抑制GRM1影響RCC腫瘤細胞的生物學行為 與對照786-O組比較,786-O-shGRM1組和786-O+LY404039組的細胞活力均下降(P<0.01,見圖3),細胞周期受阻斷(P<0.01,見圖4),且細胞凋亡比例增加(P<0.01,見圖5),細胞遷移和細胞侵襲均受抑制(P<0.01,見圖6～7)。這些結(jié)果說明抑制GRM1能夠抑制RCC腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲,促進RCC腫瘤細胞的凋亡。

圖2 shGRM1通過慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)786-O細胞系的干擾效率檢測

圖3 CCK-8檢測細胞的活力

圖4 流式細胞術(shù)檢測細胞的周期

圖5 流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡

圖6 Transwell檢測細胞的遷移

圖7 Transwell檢測細胞的侵襲

2.4 GRM1通過AKT/mTOR通路影響RCC腫瘤 細胞的生物學行為 為了探討GRM1的作用機制,本節(jié)使用AKT激活劑(SC79)對細胞進行處理,觀察各組細胞的生物學行為變化。與對照786-O-shGRM1組比較,使用AKT激活劑后,786-O-shGRM1+SC79組和786-O+LY404039+SC79組細胞活力均增強(P<0.01,見圖8),且細胞中mTOR表達量升高(P<0.01,見圖9),同時,G0/G1期的細胞比例降低(P<0.01,見圖10),且細胞凋亡比例降低(P<0.01,見圖11),細胞遷移增強(P<0.01,見圖12),細胞侵襲增強(P<0.01,見圖13),這些結(jié)果說明抑制GRM1可能通過AKT/mTOR途徑影響RCC腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡。

圖8 CCK-8檢測細胞的活力

圖9 WB檢測細胞mTOR蛋白的表達

圖10 流式細胞術(shù)檢測細胞的周期

圖11 流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡

圖12 Transwell檢測細胞的遷移

圖13 Transwell檢測細胞的侵襲

3 討論

RCC發(fā)病率上升與肥胖、高血壓、吸煙、暴露等危險因素相關(guān)[8]。外科手術(shù)治療仍是目前RCC的最終治療方法,但是術(shù)后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移率高,且對放化療不敏感[9-10]。對于晚期腎癌,分子靶向藥物的治療效果較好,已成為晚期腎癌的一線治療藥物[11]。但是靶向藥物耐藥仍是一個比較常見及棘手的問題,所以研究RCC的發(fā)病機制,探討新的治療方法具有重要意義。

有學者提出RCC擁有一個獨立的代謝系統(tǒng),其可能是一種代謝性疾病[12-13]。谷氨酸的代謝屬于細胞代謝中的重要組成部分,谷氨酸受體家族已經(jīng)被證實在腫瘤細胞分化、腫瘤進展、診斷及治療中具有一定的價值。其中,代謝型谷氨酸受體-1(GRM1)失調(diào)會增加黑色素瘤的發(fā)生,GRM1可能是乳腺癌抗血管生成的治療靶點,GRM1與結(jié)節(jié)硬化癥患者室管膜下巨細胞瘤的發(fā)生有關(guān)[6,14-15]。Kalariti N等人也通過PCR技術(shù)證明GRM1相關(guān)mRNA在骨肉瘤細胞中過度表達[16]。也有文獻報道GRM1在前列腺癌細胞株P(guān)C-3和LNCaP過度表達[17]。本研究通過對13例臨床RCC腫瘤標本進行檢測,結(jié)果顯示GRM1在RCC腫瘤中高表達,提示GRM1可能與RCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)聯(lián)。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號通路是細胞內(nèi)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。PI3K/AKT信號通路在腎癌中適度突變,但高度活化?；罨腁KT可以使大量的底物磷酸化,從而參與細胞病理及生理功能的各個方面,包括細胞生長、代謝及腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移[18-19]。在腎癌中PI3K/AKT信號通路與VHL/HIF信號通路在大型信號網(wǎng)絡(luò)中廣泛交叉,促進了腎癌的發(fā)生發(fā)展。首先由于VHL丟失導(dǎo)致HIF上調(diào),促進了多種生長因子的表達[20]。這些生長因子又反過來激活PI3K/AKT信號通路,從而激活mTOR然后促進HIF的表達,從而形成正循環(huán)[21]。已有文獻報道GRM1通過PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)了黑色素瘤的生長及發(fā)展,并且在此文獻中使用利魯唑(GRM1信號傳導(dǎo)抑制劑)的黑色素瘤細胞中血管生長標記物及PI3K/AKT的下調(diào)[22]。本研究通過siRNA技術(shù)抑制GRM1在腎細胞癌細胞中的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制GRM1表達后能夠顯著抑制腫瘤細胞的增殖,阻斷細胞周期的G0/G1期,增強細胞凋亡,抑制細胞遷移和侵襲。使用GRM1抑制劑LY404039處理腫瘤細胞,與基因沉默GRM1具有一致的效果。GRM1敲除細胞后,使用AKT激活劑SC79能夠逆轉(zhuǎn)GRM1受抑制而產(chǎn)生的一系列生物學行為,提示抑制GRM1影響腎細胞癌細胞生物學行為可能通過AKT介導(dǎo)。進一步對AKT下游蛋白mTOR進行檢測發(fā)現(xiàn)抑制GRM1后mTOR的表達顯著降低,AKT激活劑處理能夠有效逆轉(zhuǎn)mTOR的低表達。

綜上所述,本研究明確了GRM1在腎細胞癌中高表達,通過抑制GRM1能夠抑制腎細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲,促進腫瘤細胞的凋亡,且AKT/mTOR參與了該過程。當然,本研究僅對786-O細胞進行了生物學行為研究,后續(xù)還需在其他人腎癌細胞系中進行驗證,并行動物實驗以更深刻地理解GRM1在腎癌發(fā)生、發(fā)展的過程中所起到的作用。