王國(guó)棟 聶興國(guó) 寇海龍 李 琦

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 1 急救醫(yī)學(xué)科 2 骨外科三病區(qū),河南省新鄉(xiāng)市 453000

脊髓損傷是一種嚴(yán)重的創(chuàng)傷性疾病,會(huì)導(dǎo)致脊髓受損部分以下的身體運(yùn)動(dòng)和感覺缺陷,伴隨著生理、生化和結(jié)構(gòu)異常。脊髓損傷嚴(yán)重危害生理系統(tǒng),如心血管和免疫系統(tǒng)[1]。病人的生活質(zhì)量往往會(huì)受到嚴(yán)重影響。脊髓損傷的全球總發(fā)病率約為750/100萬人[2]。在目前的治療方法中,甲基強(qiáng)的松龍是成年期脊髓損傷患者的常用治療方法,而這種治療方法因其療效和副作用有限而備受爭(zhēng)議[3-4]。因此,迫切需要開發(fā)有效的脊髓損傷治療方法并探索其潛在機(jī)制。

白藜蘆醇是一種廣泛用于治療腦卒中的輔助藥物。白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用,不僅可以改善腦缺血再灌注的預(yù)后,還可以影響腦損傷后的學(xué)習(xí)和記憶功能[5]。研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇對(duì)脊髓缺血損傷具有保護(hù)作用[6],可促進(jìn)脊髓損傷后功能恢復(fù)和軸突再生,改善組織學(xué)損傷[7],可有效預(yù)防脊髓損傷的繼發(fā)性損傷[8]。然而,其作用機(jī)制及治療靶點(diǎn)尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一個(gè)基于系統(tǒng)藥理學(xué)研究藥物與疾病之間相互作用的發(fā)展領(lǐng)域[9]。它可以提供治療該疾病的藥物機(jī)制的全貌。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中,藥物靶向網(wǎng)絡(luò)對(duì)理解藥物的作用機(jī)制起著非常重要的作用。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,對(duì)白藜蘆醇抗脊髓損傷的主要機(jī)制進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點(diǎn)的獲得 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)搜集及Swiss(http://www.swisstargetprediction.ch/)平臺(tái)預(yù)測(cè),獲得白藜蘆醇作用靶點(diǎn)。使用Gene card(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drug bank(https://www.drugbank.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)搜集脊髓損傷相關(guān)靶點(diǎn),并將所得靶點(diǎn)合并。使用韋恩圖(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)對(duì)二者取交集,所得的交集靶點(diǎn)即為白藜蘆醇抗脊髓損傷的作用靶點(diǎn)。

1.2 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點(diǎn)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)的構(gòu)建 將白藜蘆醇抗脊髓損傷的作用靶點(diǎn)輸入STRING網(wǎng)站(https://cn.string-db.org/),獲得蛋白質(zhì)相互作用的文件。將此文件導(dǎo)入cytoscape,即可得白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點(diǎn)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖中,各靶點(diǎn)蛋白的點(diǎn)度中心性(degree)等參數(shù)的大小篩選關(guān)鍵作用靶點(diǎn),其值越大說明在網(wǎng)絡(luò)中越重要[10]。

1.3 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點(diǎn)的GO與KEGG通路分析 將白藜蘆醇抗脊髓損傷的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/),網(wǎng)站對(duì)其進(jìn)行GO富集分析與KEGG通路分析。GO富集分析包括分子功能(MF)、生物過程(BP)和細(xì)胞組成(CC)三個(gè)部分。

1.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.4.1 動(dòng)物。雌性SD大鼠36只(8～12周齡),SPF級(jí),體重180～200g,購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)為SCXK(豫) 2017-0001]。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,溫度保持在(25±1)℃,每12h改變1次光/暗周期。大鼠隨機(jī)分為三組:假手術(shù)組、溶媒組和白藜蘆醇組。

1.4.2 脊髓損傷大鼠模型的建立。利用改進(jìn)的Allen技術(shù)建立脊髓損傷模型。大鼠使用10%水合氯醛(0.33ml/100g)麻醉,以俯臥姿勢(shì)固定。以T10棘突為手術(shù)區(qū)域中心,背部中間切口為3～4cm,T9～10棘突后脊髓明顯暴露,椎板被切除。脊髓損傷通過快速下落的鈍頭沖擊針(重10g,直徑2mm)從30mm的高度迅速誘發(fā)。成功沖擊的跡象包括脊髓組織水腫、出血、延遲性癱瘓和糞便失禁。假手術(shù)組麻醉后僅行椎板切除術(shù),無脊髓挫傷。在脊髓損傷后2h,通過腹腔注射將白藜蘆醇(50mg/kg)和等量蒸餾水分別給予白藜蘆醇組和溶媒組的大鼠,此后1次/d,持續(xù)給藥2周。每天進(jìn)行2次膀胱按摩,以幫助脊髓損傷后的大鼠排出尿液。

1.4.3 功能分析。在術(shù)前和脊髓損傷后1、3、7、14、21、28和35d根據(jù)Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)評(píng)定量表評(píng)估脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[11]。BBB評(píng)分范圍為0～21分。最低分為0分=完全癱瘓,最高分為21分=正常。平均得分用于反映各組運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的進(jìn)展。

1.4.4 白藜蘆醇對(duì)脊髓損傷大鼠AKT1、TNF、VEGFA mRNA表達(dá)的影響。使用Trizol試劑盒從組織中提取總RNA。使用Oligo(dT)12～18引物和Superscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶從2μg總RNA合成cDNA。SYBR Green熒光染料檢測(cè)AKT1、TNF、VEGFA和GAPDH mRNA表達(dá)。引物序列如下:AKT1,上游 5’-ACCTCTGAGACCGACACCAG-3’,下游 5’-AGGAGAACTGGGGAAAGTGC-3’;TNF,上游 5’-TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC-3’,下游 5’-CAGCCT TGTCCCTTGAAGAGAACC-3’;VEGFA,上游 5’-CCACGACAGAAGGGGAGCA-3’,下游 5’-GTGCTGGCTTTGGTGAGG-3’;GAPDH,上游5’-TATGACAACTCCCTCAAGAT-3’,下游5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’。兩步法擴(kuò)增條件為:95℃先預(yù)變性30s;隨后 95℃ 5s,60℃ 20s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)源性參照,應(yīng)用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4.5 免疫組化檢測(cè)脊髓組織中AKT1表達(dá)。大鼠麻醉、固定后,取出T9～10脊髓組織,石蠟包埋。切片脫蠟至水后,滴加3%過氧化氫,滅活內(nèi)源酶活性。5%山羊血清封閉1h后,滴加兔抗AKT1,4℃ 過夜。PBS沖洗后,滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,37℃孵育20min。觀察二氨基聯(lián)苯胺顯色約5min,使用PBS及時(shí)停止反應(yīng)。切片用蘇木精復(fù)染。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,并以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用單因素方差分析評(píng)估多組之間的差異。使用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)評(píng)估BBB評(píng)分。P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點(diǎn)的獲得 由圖1可見,白藜蘆醇作用靶點(diǎn)148個(gè),脊髓損傷相關(guān)靶點(diǎn)1 027個(gè),二者取交集,共獲得白藜蘆醇和脊髓損傷交集靶點(diǎn)即白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點(diǎn)48個(gè)。

圖1 白藜蘆醇與脊髓損傷相關(guān)靶點(diǎn)交集的韋恩圖

2.2 白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖 白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點(diǎn)蛋白相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)圖中度中心性的大小,共篩選出關(guān)鍵作用靶點(diǎn)8個(gè),即AKT1、TNF、IL-1B、VEGFA、IL-6、JUN、CASP3、HIF1A。排名前三的為AKT1、TNF、VEGFA。

圖2 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點(diǎn)蛋白的PPI圖

2.3 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點(diǎn)的GO富集分析結(jié)果 由圖3 GO富集分析結(jié)果可知,生物過程(BP)主要涉及活性氧代謝過程、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等;細(xì)胞組成(CC)主要涉及薄膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等;分子功能(MF)主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性等。

圖3 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點(diǎn)的GO富集分析圖

2.4 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點(diǎn)的KEGG通路分析結(jié)果 由圖4 KEGG通路分析結(jié)果可知,富集顯著的通路主要有:TNF 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路等。

圖4 白藜蘆醇抗脊髓損傷靶點(diǎn)的KEGG通路圖

2.5 白藜蘆醇對(duì)脊髓損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)功能改善作用 由圖5可知,溶媒組和白藜蘆醇組的BBB評(píng)分在受傷后第1天為0分。從第1～7天,溶媒組和白藜蘆醇組之間的BBB評(píng)分無顯著差異(P>0.05)。然而,在脊髓損傷后14、21、28和35d,白藜蘆醇組大鼠的BBB評(píng)分顯著高于溶媒組大鼠(P<0.05)。這些結(jié)果表明,脊髓損傷后白藜蘆醇的干預(yù)顯著改善了運(yùn)動(dòng)功能。

圖5 白藜蘆醇對(duì)脊髓損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)功能改善作用

2.6 白藜蘆醇對(duì)脊髓損傷大鼠 AKT1、TNF、VEGFA mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比,溶媒組TNF mRNA表達(dá)明顯升高(P< 0.01),AKT1、VEGFA mRNA表達(dá)也有所升高。與溶媒組相比,白藜蘆醇組TNF mRNA表達(dá)明顯降低(P< 0.01),AKT1、VEGFA mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01),見圖6。

圖6 白藜蘆醇對(duì)脊髓損傷大鼠 AKT1、TNF、VEGFA mRNA表達(dá)的影響

2.7 免疫組織化學(xué)分析結(jié)果 AKT陽性細(xì)胞棕黃色,假手術(shù)組陽性細(xì)胞較少見。與假手術(shù)組相比,溶媒組AKT1陽性表達(dá)增加,而白藜蘆醇組AKT1表達(dá)明顯強(qiáng)于溶媒組,見圖7。

a b

3 討論

脊髓損傷(SCI)是由創(chuàng)傷引起的脊髓神經(jīng)功能損傷,通常會(huì)導(dǎo)致受傷節(jié)段以下的肢體嚴(yán)重功能障礙。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有明確的抗脊髓損傷的作用[5-8],但作用機(jī)制尚不明確。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)白藜蘆醇抗脊髓損傷的作用機(jī)制進(jìn)行分析。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是利用生物信息學(xué)和藥理學(xué)揭示藥物與疾病的相互作用。本研究共獲得白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點(diǎn)48個(gè),篩選出關(guān)鍵作用靶點(diǎn)8個(gè),即AKT1、TNF、VEGFA、IL-1B、IL-6、JUN、CASP3、HIF1A。KEGG通路分析,富集顯著的通路主要有:TNF 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路及MAPK信號(hào)通路等。表明白藜蘆醇主要通過上述靶點(diǎn)和通路發(fā)揮對(duì)脊髓損傷的治療作用。另外本研究根據(jù)白藜蘆醇抗脊髓損傷作用靶點(diǎn)蛋白相互作用的PPI網(wǎng)絡(luò)圖中度中心性的大小,共篩選出關(guān)鍵作用靶點(diǎn)8個(gè),其中排名前三的是AKT1、TNF和VEGFA。

研究表明,脊髓損傷后,活化的膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生多種炎癥因子,如腫瘤壞死因子(TNF-α)等。據(jù)報(bào)道,脊髓損傷后24h內(nèi),炎癥因子水平顯著增加,并且在脊髓損傷后的繼發(fā)性損傷中起關(guān)鍵作用,導(dǎo)致脊髓脫髓鞘和神經(jīng)元死亡[12]。TNF-α是淋巴T細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子,在炎癥和細(xì)胞凋亡等多種過程中發(fā)揮重要作用[13]。炎癥因子的產(chǎn)生會(huì)誘導(dǎo)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活,包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)。而下調(diào)各種炎癥介質(zhì)(包括TNF-α、IL-1β和IL-6)表達(dá)可減少潛在的炎癥損傷[14]。另外,Brunet A等[15]發(fā)現(xiàn)AKT或 PI3K/Akt通路與神經(jīng)元的存活密切相關(guān)。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及神經(jīng)生長(zhǎng)因子等可以通過激活A(yù)KT而介導(dǎo)或促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的存活[16]。Noshita N等[17]發(fā)現(xiàn)在缺血性腦損傷或創(chuàng)傷性腦損傷后,神經(jīng)元中的AKT活性顯著增強(qiáng),與此同時(shí)神經(jīng)元的凋亡明顯減少,說明AKT的激活起神經(jīng)保護(hù)作用。胡凌云等[18]發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后抑制AKT的表達(dá)可阻止脊髓損傷后自發(fā)性運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。Li E等[19]發(fā)現(xiàn)激活A(yù)KT1可減少脊髓水腫,促進(jìn)脊髓修復(fù),恢復(fù)大鼠脊髓損傷后的行為功能。所以脊髓損傷后,激活的蛋白信號(hào)AKT可能是參與脊髓損傷后神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)的重要環(huán)節(jié)。VEGF是一種內(nèi)皮特異性生長(zhǎng)因子,在血管生成中起著重要作用。研究證明,在神經(jīng)系統(tǒng)中,VEGF對(duì)神經(jīng)具有保護(hù)作用,促進(jìn)神經(jīng)再生并刺激神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活[20]。VEGF信號(hào)通路的激活誘導(dǎo)VEGF蛋白表達(dá)增加,可以改善局部缺氧微循環(huán)環(huán)境,減少脊髓損傷繼發(fā)損傷,并促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能的改善。劉曉陽等[21]發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后鞘內(nèi)注射VEGF對(duì)大鼠脊髓損傷引起的神經(jīng)纖維和神經(jīng)元的變性有保護(hù)作用并可恢復(fù)損傷神經(jīng)的部分功能。

隨后,筆者復(fù)制了脊髓損傷大鼠模型,對(duì)排名前三的關(guān)鍵作用靶點(diǎn):AKT1、TNF和VEGFA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果表明,與溶媒組相比,白藜蘆醇對(duì)脊髓損傷后大鼠運(yùn)動(dòng)功能具有明顯改善作用,并明顯降低TNF mRNA表達(dá)(P<0.01),升高AKT1、VEGF mRNA表達(dá)(P<0.01)。表明白藜蘆醇通過這些重要靶點(diǎn)發(fā)揮抗脊髓損傷作用。后續(xù)還需要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)和臨床驗(yàn)證來證實(shí)本研究的發(fā)現(xiàn)。

總之,本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析闡明了白藜蘆醇對(duì)脊髓損傷的藥理作用。共有48個(gè)靶基因,其中AKT1、TNF、VEGFA是白藜蘆醇抗脊髓損傷的關(guān)鍵靶蛋白。GO和KEGG功能富集表明,白藜蘆醇靶向蛋白主要富集于TNF 信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等。這表明白藜蘆醇主要通過上述靶點(diǎn)和通路發(fā)揮對(duì)脊髓損傷的治療作用。本研究可為脊髓損傷中白藜蘆醇的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。