王 茜，王 燁，李玉梅，王楚盈，楊 波

（長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院·吉林 長春·130117）

1 引言

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪 （Astragalus complanatus R.Br）的干燥成熟種子，在我國具有悠久的用藥歷史, 始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，以蒺藜為名[1]。 屬藥食同源類藥材，其味甘，性溫，歸肝經(jīng)、腎經(jīng)[2]。 主要用于治療早泄、腰痛、腎虛、小便不盡、白濁帶下等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗腫瘤、降壓降脂、保肝、抗輻射等作用[3]。

目前，癌癥（腫瘤疾病）已成為嚴(yán)重威脅人類健康和生命的一大疾病[4]，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為機(jī)體正氣不足是癌癥發(fā)生發(fā)展的根本原因之一，腎為先天之本，腎虛則一身正氣虧虛[5]?，F(xiàn)代研究表明沙苑子有抗腫瘤作用，但其發(fā)揮抗腫瘤的活性成分和作用機(jī)制尚不明確。沙苑子是補(bǔ)陽藥的一種，近年來對其活性成分也有不少的研究，由于其成分復(fù)雜，故在作用機(jī)制方面還尚未完全清晰， 有待進(jìn)一步研究來促進(jìn)沙苑子的開發(fā)應(yīng)用。 近年來網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的快速發(fā)展，已成為中醫(yī)藥研究的熱門工具， 以網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為主題在知網(wǎng)上搜索，僅2021年就有2000 余篇。越來越多的中藥或復(fù)方制劑通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對“藥物-疾病-靶點(diǎn)-通路”等復(fù)雜生物信息網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的分析與研究，對作用機(jī)制進(jìn)行模擬分析、預(yù)測探討，系統(tǒng)的表征藥物對疾病的干預(yù)與影響，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進(jìn)行研究有利于揭示中藥的復(fù)雜作用機(jī)制[6]。 這種分析方法具有系統(tǒng)性和動態(tài)性的特點(diǎn)，與中藥防病治病的理論一致，為中藥現(xiàn)代化研究提供新的思路和方法[7]。因此，本研究致力于通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討沙苑子治療腫瘤疾病的作用機(jī)制，系統(tǒng)的闡述沙苑子標(biāo)志性成分作用與腫瘤疾病的作用機(jī)制，為深入開發(fā)利用中藥沙苑子提供理論依據(jù)。

2 方法與結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站和分析軟件

本篇文章使用的數(shù)據(jù)庫以及軟件如下：

2.2 沙苑子的活性成分及其作用靶點(diǎn)的篩選

使用傳統(tǒng)的中藥藥理平臺數(shù)據(jù)庫(TCMSP) (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)（中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺）[8]， 其數(shù)據(jù)庫包括500 味常用中藥，30069個中藥化合物。該數(shù)據(jù)庫自2012年面世以來，已引起學(xué)者們越來越多的重視，并被越來越多的醫(yī)藥研究工作者所使用。 TCMSP 能捕捉藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系，包括化學(xué)物質(zhì)、靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，以及相關(guān)的藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，涉及口服生物利用度、藥物相似度、腸上皮通透性、血腦屏障、水溶性等天然化合物的藥代動力學(xué)特性。因此，學(xué)者們可以根據(jù)自己的需要，利用具有相關(guān)性的藥物和吸收、 分布、 代謝、 排泄（ADME）等特征的復(fù)合物用于進(jìn)行更深層次的研究。以沙苑子為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，篩選條件為口服利用度OB%≥30%和藥物相似性DL≥0.18， 篩選出沙苑子的有效活性成分以及對應(yīng)靶點(diǎn)[9]。 使用Uniprot[10](https://www. uniprot. org/)數(shù)據(jù)庫中智人（英文選項）選項中的化合物數(shù)據(jù)庫與從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中篩選出的沙苑子有效化合物靶點(diǎn)進(jìn)行比對篩選，去除其化合物中非人源有效化合物靶點(diǎn)[11]，以獲取從TCMSP 得到的藥物靶點(diǎn)基因符號和相關(guān)信息。

2.3 腫瘤疾病靶點(diǎn)的獲取

以tumour 為關(guān)鍵詞，分別在Genecards[12]（https://www.genecards.org/），OMIM，Disgenent（DisGeNET - a database of gene-disease associations）以上三個數(shù)據(jù)庫來檢索獲得所研究的相關(guān)腫瘤疾病靶點(diǎn)。 Genecards這個數(shù)據(jù)庫是一個免費(fèi)搜索的綜合性網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)資料庫，提供所有注釋和預(yù)測的人類基因信息。 Genecards自動整合來自約150 個以基因?yàn)橹行牡臄?shù)據(jù)庫資源，包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、遺傳學(xué)、臨床和功能等多方面的信息。 Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）[13]（https://omim.org/）中文意思是指“在線《人類孟德爾遺傳》”和“網(wǎng)上《人類孟德爾遺傳》”。 發(fā)布的這些年來一直在不斷地更新著所有Human 的遺傳基因和遺傳紊亂的數(shù)據(jù)庫，主要著眼于遺傳性的基因疾病，包括文本信息、相關(guān)參考信息、基因序列和相關(guān)其他數(shù)據(jù)庫。 Disgenent 整合了公共數(shù)據(jù)庫、GWAS 目錄、動物模型和科學(xué)文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)。同時這個數(shù)據(jù)庫的收據(jù)還采用了統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行注釋。除此之外，還提供了一些初始指數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)，用來幫助研究人員確定表型與基因型關(guān)系的等級高低，同時也可以通過Cytoscape 應(yīng)用程序、web 接口、幾種編程語言和腳本來訪問這些重要信息。 Disgenent 是一個具有多功能的平臺，可用于不同的研究目的，包括特定的人類疾病的分子基礎(chǔ)及其并發(fā)癥的研究，致病基因特性分析，輔助構(gòu)建藥物治療作用及藥物不良反應(yīng)假說，疾病候選基因的驗(yàn)證及文本挖掘方法的評價性能。

2.4 藥物與疾病共同靶點(diǎn)的篩選與蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將從三個疾病數(shù)據(jù)庫中篩選得到的相關(guān)的腫瘤靶點(diǎn)與TCMSP 中獲得的藥物靶點(diǎn)來進(jìn)行比對，在STRING 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建， 這個數(shù)據(jù)庫是一個可以用來檢索已經(jīng)存在且被發(fā)現(xiàn)的目前蛋白和預(yù)測蛋白之間相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫。除了可以對這些蛋白生成一目了然的PPI 圖，還可以提供所傳輸?shù)挠嘘P(guān)蛋白的解析，向數(shù)據(jù)庫中導(dǎo)入上述所得沙苑子治療腫瘤疾病的有關(guān)靶點(diǎn)，以獲取這些蛋白質(zhì)的相互作用有關(guān)內(nèi)容信息。 STRING 數(shù)據(jù)庫設(shè)置后可以評判打分，一般是根據(jù)每一個輸入的蛋白質(zhì)相互作用信息來進(jìn)行，所評判的分值越高，則表明此蛋白質(zhì)的相互作用置信度也就越高。為保證這個數(shù)據(jù)庫所輸出數(shù)據(jù)的可信度， 這個研究選取打分值高于高置信度的數(shù)據(jù)，由此標(biāo)準(zhǔn)來構(gòu)建由導(dǎo)入基因表所表達(dá)產(chǎn)物組成的PPI網(wǎng)絡(luò)， 并采用Cytoscape3.70 軟件來進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析和可視化處理。

2.5 KEGG 通路富集分析

將2.4 項下得到的沙苑子中有效成分治療腫瘤疾病的基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape[15]平臺進(jìn)行富集分析，選擇物種為“H. sapiens”，在分析出的前50 條通路里篩選腫瘤相關(guān)通路，并將篩選出的通路靶點(diǎn)進(jìn)行整理。此時得到沙苑子治療腫瘤疾病的相關(guān)通路及對應(yīng)的靶點(diǎn)， 作為數(shù)據(jù)文件。 將得到的相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape3.7.0 軟件得到疾病通路-靶點(diǎn)圖。 將上述得到的相關(guān)通路的富集名、 富集倍數(shù)、P 值和基因數(shù)整理好，應(yīng)用于微生信網(wǎng)站的富集氣泡圖，即得到沙苑子治療腫瘤疾病的核心靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析圖。

2.6 GO 富集分析

如2.4 項下所陳述， 將得到的基因靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺進(jìn)行GO 富集分析。GO 富集分析包括GO 分子功能 （Molecular Functions）、GO 細(xì)胞組成（Cellular Components）、GO 生物學(xué)過程（Biological Process）。 GO Biological Processes 富集分析可以描述基因產(chǎn)物可能行使的分子功能；GO Cellular Components 富集分析可以描述基因產(chǎn)物所處的細(xì)胞環(huán)境；GO Molecular Functions 富集分析作用是描述基因產(chǎn)物所參與的生物學(xué)過程。 按%InGO 排序分別取三種GO 富集分析的前10 名，整合處理。 將上述得到的三種GO 富集分析的GO term、分類、富集分?jǐn)?shù)整理好，應(yīng)用于微生信網(wǎng)站的BP CC MF 三合一圖，得到沙苑子治療腫瘤疾病的BP CC MF 三合一圖。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 沙苑子有效靶點(diǎn)篩選

使用TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)（藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫中藥系統(tǒng)分析平臺），可以得到沙苑子中所含的有效成分為358 種，再通過該中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺以口服利用度OB%≥30%且藥物相似性DL≥0.18 為條件， 篩選出沙苑子有效活性化合物以及對應(yīng)靶點(diǎn)， 得到活性成分10 個： 芒柄花素（formononetin）、 槲皮素 （quercetin）、 山奈酚（Kaempferol）、楊酶酮（Myricanone）、毛蕊異黃酮（Calycosin）、β-谷甾醇 （beta-sitosterol）、 芳香素（Laricitrin）、a-D-吡喃葡萄糖苷（a-D-glucopyranoside）等，詳見表1。 通過Uniport 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查找，去重，共得到276 個靶點(diǎn)蛋白。

表1 沙苑子有效成分及分子名稱

3.2 沙苑子治療腫瘤疾病靶點(diǎn)的收集

以tumour 為關(guān)鍵詞， 分別在Genecards（https://www.genecards.org/）， 人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（Online Mendelian Inheritance in Man）（OMIM）（https://omim.org/），Disgenent（https://www.disgenet.org/browser/1/ 1/0/894/） 三個數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索獲取相關(guān)腫瘤的疾病靶點(diǎn)。 在Genecards 中獲得腫瘤疾病靶點(diǎn)10859 個，取評分0.70 以上的2743 個；OMIM 數(shù)據(jù)庫中獲得345 個；Disgenent 數(shù)據(jù)庫中獲得968 個靶點(diǎn)，與藥物做交集得到126 個重復(fù)靶點(diǎn)，詳見表2。

表2 沙苑子與腫瘤的126 個交集靶點(diǎn)

3.3 沙苑子-有效成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將表2 得到的10 個藥物有效成分，126 個作用靶點(diǎn)以Excel 文件格式分別定義數(shù)據(jù)和相關(guān)文件，導(dǎo)入Cytoscape 軟件中繪制沙苑子-有效成分-靶點(diǎn)-腫瘤疾病網(wǎng)絡(luò)圖。 其中SYZ 代表沙苑子，和疾病有8 種有效成分含有共同靶點(diǎn)，詳見圖1。 由圖1 可知，中藥沙苑子治療腫瘤疾病的關(guān)鍵成分有a-D-glucopyranoside（a-D-吡喃葡萄糖苷）、山奈酚（Kaempferol）、毛蕊異黃酮 （Calycosin）、 槲皮素（quercetin）、 楊酶酮（Myricanone）、Laricitrin（芳香素）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、芒柄花素（formononetin）。

圖1 沙苑子有效成分－靶點(diǎn)－疾病網(wǎng)絡(luò)圖

3.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)篩選與分析

將3.2 項下經(jīng)去重后所得到的藥物與疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入到String 數(shù)據(jù)庫來創(chuàng)建PPI 的網(wǎng)絡(luò)通識圖，把所得網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行處理，詳見圖2。根據(jù)Degree 值篩選出前18 個關(guān)鍵靶點(diǎn)，詳見表3， 分別為過氧化物酶體增生激活受體（PPARG）TP53、白細(xì)胞介素-6（IL6）、腫瘤壞死因子（TNF）、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（PTGS2）、缺氧誘導(dǎo)因子-1A（HIF1A）、CASP3、蛋白激酶（AKT1）、重組人白介素8（CXCL8）、MYC、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、白細(xì)胞介素-1B（IL1B）、表皮細(xì)胞生長因子（EGF）、ESR1、人表皮生長因子受體 （EGFR）、 血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）。

圖2 治療腫瘤疾病的靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)

3.5 KEGG 通路富集分析

KEGG 富集到188 條信號通路， 其主要參與IL-17 信號通路、 糖尿病并發(fā)癥中的toll 樣受體信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路、AGE-RAGE 信號通路、NFkappa B 信號通路、c 型凝集素受體信號通路、腫瘤壞死因子信號通路，詳見圖3、表4。

圖3 沙苑子治療腫瘤疾病的作用靶點(diǎn)KEGG 通路富集分析

表4 10 條通路的KEGG 富集分析信息

3.6 GO 富集分析

應(yīng)用Metascape 數(shù)據(jù)平臺對沙苑子的124 個潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 基因富集分析。根據(jù)%InGO 篩選排名前10 位進(jìn)行BP CC MF 三合一，多類型氣泡圖可視化處理。共得到生物學(xué)過程(biological process，BP)146 條功能條目，主要包括細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控，細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)，對營養(yǎng)水平層次的反應(yīng)。細(xì)胞組成主要包括：膜微區(qū)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物。 分子功能(molecular function，MF)共62 個，主要包括轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。 選取這三種GO 分析過程排名前5 的列表，詳見表5。 運(yùn)用Cytoscape3.7.0 軟件進(jìn)行拓?fù)浞治觯瑯?gòu)建通路-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，詳見圖4。 用微生信數(shù)據(jù)可視化網(wǎng)站（www.bioinformatics.com.cn/）制作GO、KEGG 富集氣泡圖以及三合一柱狀圖。通過富集因子數(shù)值大小來分析沙苑子治療腫瘤疾病的可能有效成分以及作用機(jī)制。

圖4 沙苑子有效成分治療腫瘤疾病的作用靶點(diǎn)GO 富集分析BP CC MF 三合一圖

表5 3 個過程中排名前5 的GO 富集分析信息

GO 功能富集分析多類型氣泡圖，詳見圖5。 GO功能富集分析多類型氣泡圖中，count 代表主要活性成分富集在該通路下的靶點(diǎn)數(shù)目。 圓點(diǎn)越大,富集越多,P 值越小,表明該生物功能的富集顯著性越可靠,顏色越紅。通過氣泡圖表明中藥沙苑子可以通過調(diào)控多種生物過程治療腫瘤疾病。

圖5 沙苑子有效成分治療腫瘤疾病的作用靶點(diǎn)GO 富集分析多類型氣泡圖

4 小結(jié)與討論

4.1 目前來說，腫瘤在人類的漫長發(fā)展中不知不覺的成為危害人類生命安全健康的最嚴(yán)重的疾病之一，預(yù)計到2030年全球腫瘤導(dǎo)致死亡的病例將高達(dá)3000多萬人，我們國家的腫瘤發(fā)病率也在逐年上升。 中醫(yī)藥在抗腫瘤方面的作用越來越占優(yōu)勢， 研究顯示，沙苑子是補(bǔ)益肝腎的代表性藥物之一，主要成分有黃酮類、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、微量元素等成份。近年來，對沙苑子的藥理作用研究報道很多， 但在作用機(jī)制方面很少，尤其抗腫瘤方面的作用機(jī)制尚不明確，所以此方面的研究具有重要意義。

4.2 本研究經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩選得到沙苑子有效成分8 個，腫瘤疾病的對應(yīng)靶點(diǎn)共276 個，映射后得到沙苑子有效成分用于腫瘤疾病的潛在靶點(diǎn)126 個。中藥沙苑子治療腫瘤疾病的關(guān)鍵成分有槲皮素（quercetin）、山奈酚（Kaempferol）、楊酶酮（Myricanone）、芒柄花素（formononetin）、毛蕊異黃酮（Calycosin）、β-谷甾醇（betasitosterol）、a-D-吡喃葡萄糖苷 （a-D-glucopyranoside）、芳香素（Laricitrin）。 槲皮素是一類具有多種生物活性的黃酮醇類化合物，能殺死自由基，防止機(jī)體脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)， 能夠直接抑制腫瘤生長，同時， 也可能通過抑制STAT3 信號通路來抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖[14,15]。山奈酚屬于黃酮類化合物，沙苑子黃酮可以明顯抑制血管瘤的生成，誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞的凋亡[16]。芒柄花黃素可能通過調(diào)節(jié)CyclinD1 使細(xì)胞周期停滯及減少Bcl-2 蛋白以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響人體腫瘤細(xì)胞的生長與增殖[17]。 楊酶酮是從楊梅的樹皮中提取的一種黃酮醇類化合物，具有強(qiáng)抗氧化作用，避免機(jī)體產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物妨礙創(chuàng)傷修復(fù)形成腫瘤細(xì)胞[18]。

4.3 本研究發(fā)現(xiàn)沙苑子治療腫瘤疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)有蛋白激酶、TP53、腫瘤壞死因子、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2、血管內(nèi)皮生長因子、白細(xì)胞介素-6、CASP3、EGFR、CXCL8、MYC、EGF、ESR1。TP53 又是一種抑癌有關(guān)基因，這個基因能夠編碼一種分子量為53kDa 的蛋白質(zhì)。 MYC 基因包括N-MYC、C-MYC、R-MYC、L-MYC 共4 種。C-MYC 是最常見的活化原癌基因之一， 參與調(diào)控的癌癥占人類所患癌癥的五分之一左右，受C-MYC 原癌基因影響致死的癌癥患者每年可達(dá)幾十萬。 MYC 是一種作用廣泛的轉(zhuǎn)錄因子，它通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和增殖，包括靶基因的轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增。 MYC 調(diào)控細(xì)胞生長和增殖，因此也可以控制腫瘤的生長，表皮生長因子測定可用于診斷各種腫瘤和潰瘍病[19]。 許多腫瘤中有EGF 及其受體的異常表達(dá)，且與腫瘤轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后有密切關(guān)系，如胃癌、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等。

4.4 KEGG 富集分析結(jié)果顯示，沙苑子有效成分治療腫瘤細(xì)胞的主要通路是信號通路AGE-RAGE、IL-17信號通路、TNF 受體信號通路等10 個通路。 IL-17 能有效地介導(dǎo)組織的炎癥反應(yīng)， 有研究表明通過抑制IL-17 信號通路可能直接影響細(xì)胞的活化、 增殖，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生。 GO 富集分析顯示沙苑子治療腫瘤疾病的生物學(xué)過程 （biological process，BP）與146 條功能條目相關(guān)， 主要包括細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控，細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)，應(yīng)對營養(yǎng)，對營養(yǎng)水平的反應(yīng)，膜筏。 與細(xì)胞組成相關(guān)主要包括膜微區(qū)，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物，質(zhì)膜蛋白復(fù)合物，囊腔。與分子功能相關(guān)共62 個，主要包括激酶綁定，DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，蛋白激酶結(jié)合等。

4.5 綜上所述，由本文可知沙苑子有效成分可能通過山奈酚、芒柄花素、槲皮素、β-谷甾醇等有效成分，作用于IL6、TNF、VEGFA 、AKT1 等靶點(diǎn)，涉及IL-17 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、TNF 受體信號通路等通路來實(shí)現(xiàn)治療腫瘤疾病的目的[20]。 本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法確認(rèn)沙苑子多個有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、通路對腫瘤疾病發(fā)揮治療作用[21-24]。為后續(xù)沙苑子的研究提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)， 可能對闡明沙苑子抗腫瘤的機(jī)制和識別潛在靶點(diǎn)提供幫助，未來需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。但是基于理論技術(shù)方面和數(shù)據(jù)庫信息的限制，本研究存在一定的局限性，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。