遲東澤，馬玉芯，郭 鑫

(1.吉林省藥品審核查驗(yàn)中心，長(zhǎng)春 130062；2.通化師范學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，通化 134002)

動(dòng)物藥是指動(dòng)物整體、器官、生理或病理產(chǎn)物等可供藥用的中藥材，是中藥材的主要來(lái)源之一[1]。動(dòng)物藥在我國(guó)應(yīng)用歷史悠久，歷代本草中都有記載，具有療效顯著、活性強(qiáng)、應(yīng)用廣泛的特點(diǎn)[2]?，F(xiàn)代研究表明，動(dòng)物藥與同體積、同重量的植物藥相比，大多數(shù)都具有極強(qiáng)的生物活性，尤其在治療頑癥、重病方面，更顯示出其獨(dú)特的生理活性。 由于臨床需求量增大，藥源緊缺，需求旺盛，價(jià)格昂貴，動(dòng)物藥材的質(zhì)量問(wèn)題，屢有報(bào)道，備受公眾關(guān)注[3]。 因此，藥用動(dòng)物以及動(dòng)物藥的品種鑒定與質(zhì)量評(píng)價(jià)工作急需現(xiàn)代技術(shù)的介入和支持。 隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，高效液相色譜、凝膠電泳、高效毛細(xì)管電泳、液相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)、DNA 分子鑒定技術(shù)等方法在動(dòng)物藥的鑒定中起到了重要作用[4]。本研究對(duì)動(dòng)物藥的質(zhì)量現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，并針對(duì)一些指紋圖譜技術(shù)和方法的應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 動(dòng)物藥質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀

動(dòng)物藥的主要成分多為多糖、蛋白質(zhì)、核苷等，研究難度較大，導(dǎo)致動(dòng)物藥在應(yīng)用中品種混亂，其各部分成分與藥材的功能主治難以相互對(duì)應(yīng)，質(zhì)量評(píng)價(jià)進(jìn)展緩慢[5]。 因此，亟待結(jié)合動(dòng)物藥特點(diǎn)，尋找出符合當(dāng)前動(dòng)物藥實(shí)際應(yīng)用的質(zhì)量檢測(cè)方法與指標(biāo)，這是解決動(dòng)物藥品質(zhì)評(píng)價(jià)問(wèn)題的關(guān)鍵[6]。

動(dòng)物藥雖然種類少于植物藥，但具有一定的藥用價(jià)值，其特效性強(qiáng)、發(fā)展快和前景好等優(yōu)勢(shì)，已受到人們廣泛的重視和關(guān)注[7]。隨著人們對(duì)動(dòng)物藥深入了解，其市場(chǎng)需求量不斷擴(kuò)大，但大部分動(dòng)物藥材并沒(méi)有明確的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法構(gòu)建完善的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系[8]。2015 版《中國(guó)藥典》一部收載動(dòng)物藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法包括液-質(zhì)聯(lián)用法鑒別阿膠、龜甲膠、鹿角膠；PCR 法鑒別烏梢蛇和蘄蛇；薄層色譜法檢測(cè)龜甲、穿山甲、鹿茸、水蛭等重金屬和有害元素，地龍等藥材中黃曲霉毒素檢查等。 2020 版《中國(guó)藥典》四部附錄收載48 種動(dòng)物藥材，僅有藥材來(lái)源，無(wú)具體質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制項(xiàng)目[9]。

2 動(dòng)物藥質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)方法

2.1 色譜法

2.1.1 薄層色譜法

動(dòng)物類藥材一般市場(chǎng)價(jià)格較高，通過(guò)簡(jiǎn)單的色譜方法，可鑒別藥材的真?zhèn)蝺?yōu)劣。 薄層色譜法是根據(jù)各成分對(duì)同一吸附劑吸附能力不同而將其成分分離出來(lái)的一種簡(jiǎn)單方法，可同時(shí)鑒別多種樣品，具有簡(jiǎn)單和快速等特點(diǎn)，是傳統(tǒng)的中藥材定性、定量的分析方法[10]。張建英等[11]采用薄層色譜鑒別法對(duì)珍珠層粉膠囊中氨基酸成分進(jìn)行研究，該方法斑點(diǎn)清晰、分離度好、專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，由此建立了珍珠層粉膠囊質(zhì)量控制的有效方法。 林爽等[12]采用薄層色譜（TLC）法建立指紋圖譜和含量測(cè)定方法，識(shí)別了16 個(gè)共有峰，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地龍血竭藥材質(zhì)量情況。

2.1.2 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜技術(shù)(HPLC) 具有分離度高、重復(fù)性好、圖譜信息豐富等特點(diǎn)，可用于分析中藥有效成分的含量和構(gòu)建指紋圖譜的研究中，是《中國(guó)藥典》中應(yīng)用最廣泛的中藥檢測(cè)方法之一[13]。 HPLC 已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物藥材及其產(chǎn)品的質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制方面的研究[14]。 曹越等[15]建立10 批鹿茸的HPLC 指紋圖譜，利用計(jì)算機(jī)對(duì)鹿茸主成分進(jìn)行相似度比較，能夠?qū)Σ煌a(chǎn)地梅花鹿茸和馬鹿茸進(jìn)行識(shí)別。 蔡萍等[16]建立土鱉蟲超微粉體中游離氨基酸的HPLC 指紋圖譜，采用異硫氰酸苯酯(PITC) 柱前衍生， 梯度洗脫進(jìn)行色譜分離， 初步建立了土鱉蟲超微粉體中游離氨基酸的HPLC 指紋圖譜，標(biāo)定了24 個(gè)共有峰，該法分離效果好，靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單，可作為土鱉蟲超微粉體質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法。

2.1.3 氣相色譜法

氣相色譜法是利用氣體作為流動(dòng)相的色層分離分析方法。 氣化的試樣被載氣（流動(dòng)相）帶入色譜柱中， 柱中的固定相與試樣中各組份分子作用力不同，各組份從色譜柱中流出時(shí)間不同，組份彼此分離。 采用適當(dāng)?shù)蔫b別和記錄系統(tǒng)，制作標(biāo)出各組份流出色譜柱的時(shí)間和濃度的色譜圖[17]。 根據(jù)色譜圖中表明的出峰時(shí)間和順序，可對(duì)化合物進(jìn)行定性分析；根據(jù)峰的高低和面積大小，可對(duì)化合物進(jìn)行定量分析[18]。 具有效能高、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、分析速度快、應(yīng)用廣泛、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)， 適用于易揮發(fā)有機(jī)化合物的定性、定量分析。 對(duì)非揮發(fā)性的液體和固體物質(zhì)，可通過(guò)高溫裂解，氣化后進(jìn)行分析[19]。吳萍等[20]以此方法測(cè)定羚羊角塞注射液和未醇沉液中游離氨基酸的含量，為羚羊角進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

2.1.4 其他聯(lián)用技術(shù)

各種聯(lián)用色譜分析技術(shù)可對(duì)成分復(fù)雜的動(dòng)物藥進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和定性鑒別，適合于缺乏明確對(duì)照品的動(dòng)物藥鑒別和質(zhì)量控制的研究， 如二維液相色譜、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用以及新的高效通用檢測(cè)器如蒸發(fā)光散射檢測(cè)器等分析技術(shù)方法[21]。

2.2 光譜法

光譜分析技術(shù)在動(dòng)物藥的質(zhì)量評(píng)價(jià)中應(yīng)用廣泛，其中包括紅外光譜、紫外光譜、原子光譜、質(zhì)譜、核磁共振光譜以及X 射線衍射光譜等[22]。 金向群等[23]采用紅外光譜和紫外光譜分析蟾蜍耳后腺分泌物來(lái)區(qū)分和鑒別中華大蟾蜍和與其相似的華西大蟾蜍。 此外，紅外光譜也可對(duì)冬蟲夏草、北蟲草及其偽品等蟲體脂肪量的差異進(jìn)行比較鑒別[24]。 王麗娟等[25]用粉末X 射線衍射Fourier 譜法對(duì)鹿角、 麋鹿角及鹿角偽品牛腿骨進(jìn)行比較鑒別，結(jié)果動(dòng)物角類藥材含有大量無(wú)機(jī)成分， 利用X 射線衍射可以得到較為尖銳的X 射線衍射峰，根據(jù)其幾何拓?fù)鋱D形和特征標(biāo)記峰值的差異可對(duì)各角類藥材進(jìn)行鑒別比較。

2.3 高效毛細(xì)管電泳指紋圖譜技術(shù)

高效毛細(xì)管電泳法是近幾年興起的一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)[26]。 毛細(xì)管電泳實(shí)際上包含電泳、色譜及其交叉內(nèi)容，它使分析化學(xué)得以從微升水平進(jìn)入納升水平，并使單細(xì)胞分析乃至單分子分析成為可能，高效毛細(xì)管電泳法可用于長(zhǎng)期困擾我們的生物大分子如蛋白質(zhì)的分離分析[27]。 苑廣信等[28]通過(guò)毛細(xì)管電泳的鹿鞭D(zhuǎn)NA 指紋鑒定方法得出結(jié)論， 梅花鹿鞭指紋圖譜中有9 個(gè)共有峰， 馬鹿鞭指紋圖譜中有21 個(gè)共有峰，與馴鹿鞭、赤鹿鞭有明顯差異，而且，其相似度均小于0.7，說(shuō)明該方法客觀、準(zhǔn)確、方便，可有效區(qū)分梅花鹿鞭、馬鹿鞭及其偽品。

2.4 生物指紋圖譜技術(shù)

中藥生物指紋圖譜包括作DNA 分子遺傳標(biāo)記的中藥材DNA 指紋圖譜，以及將色譜分離與分子生物醫(yī)學(xué)二者的成果緊密結(jié)合的分子生物色譜指紋圖譜[29]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，DNA 分子技術(shù)已經(jīng)越來(lái)越多的用于中藥材品種鑒別的研究[30]。 史磊[31]通過(guò)生物指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn)，采用同一種引物對(duì)產(chǎn)地的全蝎樣品進(jìn)行RAPD 擴(kuò)增， 可以得到多條共同條帶，表明其遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)基本類似。 但山東省內(nèi)不同產(chǎn)地全蝎樣品擴(kuò)增后所得的條帶具有一定的特異性，表明不同產(chǎn)地全蝎DNA 有所變異，RAPD 分子標(biāo)記作為一種有效的鑒別方法，可以從物種的遺傳本質(zhì)出發(fā)，揭示其親緣關(guān)系和遺傳背景，對(duì)全蝎養(yǎng)殖、品種開發(fā)具有重要意義。

3 動(dòng)物藥指紋圖譜評(píng)價(jià)方法

在對(duì)動(dòng)物藥指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，只要好好把握指紋圖譜整體性和模糊性這兩大特征，建立直觀而又全面、合理而又簡(jiǎn)易、精確而又方便的色譜指紋圖譜計(jì)算機(jī)處理方法，就可能對(duì)動(dòng)物藥指紋圖譜的質(zhì)量進(jìn)行合理評(píng)價(jià)[32]。

3.1 直觀分析比較法

將待測(cè)樣品的圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行直接比較，可以鑒定判別藥材真?zhèn)?。但這種方法缺乏量化的數(shù)據(jù)和統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)， 不利于指紋圖譜的推廣應(yīng)用及規(guī)范化，因其缺點(diǎn)太多近年來(lái)已經(jīng)很少使用[33]。

3.2 化學(xué)識(shí)別評(píng)價(jià)模式

3.2.1 聚類分析

聚類分析是用相似度來(lái)衡量樣品之間的親疏程度，并以此來(lái)實(shí)現(xiàn)分類。對(duì)于不同批次的藥材樣品，其色譜指紋圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)快速辨識(shí)處理，可依據(jù)樣品批與批之間的相似度，確定藥材樣品批次間的穩(wěn)定性。色譜指紋圖譜常用模糊聚類分析， 它是依據(jù)樣品的特征、親疏關(guān)系程度和相似性，通過(guò)建立模糊相似關(guān)系對(duì)樣品進(jìn)行分類的方法，能反映樣品整體的、主要的特性[34]。 李勇[35]采用聚類分析方法發(fā)現(xiàn)成都、大連、黑龍江、南京、北京這5 個(gè)產(chǎn)地的水蛭藥材聚集緊密，質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，能夠聚成一類。

3.2.2 主成分分析

主成分分析法是一種應(yīng)用廣泛的多元統(tǒng)計(jì)方法，用于簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)， 快速實(shí)現(xiàn)模式或關(guān)系的可視化識(shí)別。在中藥材指紋圖譜研究中，一般先選定個(gè)別已知化學(xué)成分的相對(duì)峰面積作為特征值，采用主成分分析求出指標(biāo)的相關(guān)矩陣特征值[36]。 孫偉杰等[37]通過(guò)主成分分析方法鑒別并區(qū)分4 種鹿茸飲片，以所測(cè)定的6 種成分的含量為變量進(jìn)行主成分分析，由分析結(jié)果可知前2 個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為92.9%， 其中第1 主成分貢獻(xiàn)率為81.1%，第2 主成分貢獻(xiàn)率為11.2%。 由初始因子載荷矩陣可知，前2 個(gè)成分已基本反映出4 種鹿茸飲片的主要特征。

3.3 相似度評(píng)價(jià)方法

相似度評(píng)價(jià)方法最常用的為相關(guān)系數(shù)法和夾角余弦法。 這兩種方法有良好的穩(wěn)健性和敏感性，即對(duì)圖譜的細(xì)微改變能夠反應(yīng)為數(shù)值變化以及對(duì)儀器誤差能有效克服[38]。 相關(guān)系數(shù)法是以指紋圖譜兩組向量的相關(guān)系數(shù)來(lái)反映樣品間相似性的一種方法， 適用于同屬不同種的藥材分析，可以鑒別樣品的真?zhèn)蝺?yōu)劣[39]。夾角余弦法是以兩組向量的夾角余弦大小來(lái)反映兩種樣品之間相似性的方法，能夠較好地評(píng)價(jià)指紋圖譜間的相似性[40]。 黃玉明等[41]采用相似度評(píng)價(jià)法將相似度數(shù)值0.85 當(dāng)作區(qū)分蛤蟆油藥材是否合格的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)11 批優(yōu)質(zhì)蛤蟆油藥材的相似度在0.866～0.972區(qū)間內(nèi)， 而4 批劣質(zhì)蛤蟆油藥材的相似度在0.560～0.802 區(qū)間內(nèi)，為蛤蟆油的深度開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

4 展望

動(dòng)物藥作為祖國(guó)醫(yī)藥寶庫(kù)中重要的組成部分，在中醫(yī)臨床上有著廣泛的應(yīng)用，隨著藥理作用方面的開發(fā)研究越來(lái)越受到重視。 由于動(dòng)物藥具有療效好、活性強(qiáng)、應(yīng)用廣、潛力大的特點(diǎn)，越來(lái)越引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注和重視。動(dòng)物藥指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的研究和建立必將成為動(dòng)物藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要發(fā)展趨勢(shì)之一，成為動(dòng)物藥鑒定的重要平臺(tái)。動(dòng)物藥指紋圖譜正處于初步建立的階段， 其發(fā)展的高級(jí)階段是功能指紋圖譜，需在中藥譜效學(xué)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開展研究，采用生物信息學(xué)方法把指紋圖譜和生物活性、藥效等相關(guān)的化合物群對(duì)應(yīng)的聯(lián)系起來(lái)，最終建立指紋圖譜的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)。 隨著科技的進(jìn)步，動(dòng)物藥的質(zhì)量控制水平也得到了質(zhì)的提升，但是進(jìn)行研究的品種還很少，對(duì)其含有的活性成分、藥理作用等還沒(méi)有取得突破性進(jìn)展。 在加強(qiáng)動(dòng)物藥材基礎(chǔ)研究的同時(shí)，還需利用現(xiàn)代生物化學(xué)分析技術(shù)大力開展其質(zhì)量控制研究，改變動(dòng)物中藥標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)植物中藥嚴(yán)重落后的局面。