饒 敏，孫智輝，馬占川，徐華麗，睢大筼，高普均

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，長春 130021；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春 130021）

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種易反復(fù)發(fā)作的非特異性腸病，具有病程長、治愈難度大、易致癌的特點， 被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治性疾病之一。目前治療主要包括非特異性抗炎和免疫抑制藥物[1]。 中藥可通過調(diào)節(jié)炎癥細胞因子、腸道菌群、免疫系統(tǒng)及保護腸黏膜來治療UC，相比西藥更安全，抗炎、調(diào)節(jié)免疫的效果更好[2]。

人參多糖（Ginseng polysaccharide，GPS）是五加科人參屬植物人參（Panax ginsengC.A. Mey.）成熟果實中最重要的活性組分之一， 主要成分為淀粉樣葡聚糖、RG-Ⅰ型果糖、HG 型果糖、AG 型果糖， 具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗糖尿病等活性[3]。佟彤等人通過環(huán)磷酰胺免疫抑制模型和刀豆蛋白A 肝炎模型，研究了人參多糖對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用， 結(jié)果表明，人參多糖在兩種模型中均能發(fā)揮良好的免疫調(diào)節(jié)作用[4]。劉春紅課題組考察了人參多糖的免疫調(diào)節(jié)作用，研究了植物乳桿菌C88 與人參多糖的聯(lián)合作用，借助酶聯(lián)免疫吸附實驗對小鼠血清中IL-2、TNF-α 等相關(guān)生化指標進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組表現(xiàn)出更明顯的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。槲皮素（quercetin，QT）又名槲黃素、櫟精，屬黃酮類化合物，主要以苷的形式存在。 現(xiàn)代藥理研究表明，槲皮素可顯著增強環(huán)磷酰胺造成的免疫低下小鼠的免疫功能，可使外周血白細胞計數(shù)、脾指數(shù)、T 淋巴細胞增殖率均升高，CD4 比例及CD4/CD8 比值升高，淋巴細胞凋亡比率降低[6]。 槲皮素可有效保護系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠的腎臟功能，并改善其免疫功能[7]。 那么，GPS 與QT 的免疫調(diào)節(jié)及抗炎活性是否對UC 具有協(xié)同治療作用呢？ 本文建立DSS 誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，觀察二者聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同作用，為其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物

Balb/c 小鼠，雄性，體重20～22g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限責(zé)任公司提供， 質(zhì)量合格證號：SCXK-（遼）2020-0001。

1.2 藥品及試劑

人參多糖由東北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供，批號：20200510，以雙蒸水配制成所需濃度；槲皮素由吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院提供，純度>98%，批號：20221025，以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）配制成所需濃度；柳氮磺吡啶由上海福達制藥有限公司提供， 批號：20221010，以0.5% CMC-Na 配制成所需濃度；MDA、SOD、CAT、GSH-Px、IL-6、IL -1β、IL -18、IFN -γ 及TNF-α 測試盒均由南京建成生物工程研究所提供，批號：20230315。

1.3 實驗方法

50 只雄性Balb/c 小鼠隨機分為對照（Con）組，模型（DSS）組，人參多糖（GPS）聯(lián)合槲皮素（QT）低、高劑量組及陽性藥柳氮磺吡啶（SASP）組，每組10 只。 除對照組外， 各組小鼠自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉（DSS） 造模，GPS+QT 低、 高劑量組分別先后灌胃GPS+QT 50+50、100+100 mg/kg，SASP 組灌胃SASP 500 mg/kg，Con 組與DSS 組灌胃等量0.5% CMC-Na，灌胃體積均為20 mL/kg，每天2 次，連續(xù)7 天。 于造模7 天后腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg 麻醉， 處死小鼠，取結(jié)腸組織HE 染色觀察結(jié)腸病理變化；ELISA試劑盒檢測結(jié)腸組織白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-18（IL-18）、干擾素-γ（IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量；生化試劑盒檢測結(jié)腸組織超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量。

1.4 統(tǒng)計處理與數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 對小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)的影響

結(jié)腸組織HE 染色結(jié)果顯示，Con 組隱窩結(jié)構(gòu)完整清晰，無炎癥細胞浸潤。 DSS 組結(jié)腸組織廣泛深度損傷，可見隱窩扭曲，炎癥細胞浸潤增加，部分出現(xiàn)結(jié)腸黏膜及黏膜下層侵蝕和潰瘍。GPS+QT 50+50 mg/kg劑量組炎癥細胞浸潤減少，部分隱窩結(jié)構(gòu)完整。 GPS+QT 100+100 mg/kg 劑量組和SASP 500 mg/kg 組小鼠結(jié)腸浸潤性炎癥細胞明顯減少，結(jié)腸炎嚴重程度顯著降低，結(jié)果見圖1。

圖1 對小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)學(xué)的影響（HE 染色）

2.2 對小鼠結(jié)腸組織炎癥相關(guān)細胞因子的影響

與Con 組比較，DSS 組結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ 及TNF-α 含量均明顯升高 （P＜0.01）；與DSS 組比較，GPS+QT 50+50、100+100 mg/kg 劑量組及SASP 500 mg/kg 組均能明顯降低結(jié)腸組織IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ 及TNF-α 含量 （P＜0.05 或P＜0.01），結(jié)果見表1。

表1 聯(lián)合用藥對小鼠結(jié)腸組織炎癥相關(guān)細胞因子的影響（±s，n=10）

與對照組比較##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

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2.3 對小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標的影響

與Con 組比較，DSS 組小鼠結(jié)腸組織SOD、CAT及GSH-px 活性均明顯降低，MDA 含量明顯增加（P＜0.01）；與DSS 組比較，GPS+QT 50+50、100+100 mg/kg劑量組及SASP 500 mg/kg 組小鼠結(jié)腸組織SOD、CAT及GSH-px 活性均明顯增加（P＜0.05 或P＜0.01），MDA含量明顯減少（P＜0.05 或P＜0.01），結(jié)果見表2。

表2 聯(lián)合用藥對小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標的影響（±s，n=10）

表2 聯(lián)合用藥對小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激相關(guān)指標的影響（±s，n=10）

與對照組比較##P＜0.01；與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01。

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3 討論

DSS 是誘導(dǎo)結(jié)腸炎的常用方法，腸道炎癥的嚴重程度可通過改變DSS 濃度和給藥頻率加以調(diào)整。C57BL/6 品系小鼠造模的DSS 劑量通常為1.5%至3.0%，BALB/c 品系小鼠造模的DSS 劑量通常為2.5%和5.0%[8]。 本文選擇通過小鼠自由飲用3%的DSS 水溶液制作UC 模型，時間長度為7 天[9]。 據(jù)報道，雄性鼠更容易發(fā)生無上皮化的潰瘍[10]，本文采用雄性鼠作為實驗動物。

與健康人相比，UC 患者腸黏膜有不同程度的潰瘍，炎癥細胞浸潤增加，固有層淺表部分有漿細胞、T淋巴細胞、B 淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞的浸潤，隱窩出現(xiàn)炎癥變化，隱窩膿腫數(shù)量增加。 隨著疾病進展，炎性細胞浸潤從固有層淺部擴散到結(jié)腸深層，隨后累及整個腸道組織，所有細胞浸潤趨勢增加[11]。 本實驗結(jié)果顯示，DSS 組小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)廣泛深度損傷，可見隱窩扭曲，炎癥細胞浸潤增加，部分出現(xiàn)結(jié)腸黏膜及黏膜下層侵蝕和潰瘍。 GPS與QT 聯(lián)合應(yīng)用可使結(jié)腸浸潤性炎癥細胞明顯減少，結(jié)腸炎嚴重程度顯著降低，表明可保護結(jié)腸組織的病理性損傷。

UC 造成結(jié)腸組織損傷的原因之一是過度激活的炎癥反應(yīng)。高表達的細胞因子介導(dǎo)了炎性細胞和非免疫細胞之間的病理性互相作用，促炎因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α 與抗炎因子之間的失衡是結(jié)腸炎致病原因之一[12]。 疾病狀態(tài)下，共生菌群衍生的脂多糖會導(dǎo)致中性粒細胞浸潤， 進一步產(chǎn)生大量的IL-1β，以依賴性方式誘導(dǎo)腸道單核吞噬細胞產(chǎn)生IL-6[13]，IL-6 在DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中升高最為顯著，對下游酶及其他通路有調(diào)節(jié)作用，IL-6 和TNF-α 會導(dǎo)致結(jié)腸炎進一步發(fā)展[14]。 臨床數(shù)據(jù)證明，腸道中IFNγ 水平增加對腸道有致病作用[15]。 IL-18 的釋放可以介導(dǎo)杯狀細胞損失以誘導(dǎo)結(jié)腸炎發(fā)展， 并干預(yù)T 細胞介導(dǎo)的結(jié)腸炎[16]。 本實驗結(jié)果顯示，DSS 組小鼠結(jié)腸組織IL-6、IL-1β、IL-18、IFN-γ 和TNF-α 含量顯著升高，GPS 與QT 聯(lián)合應(yīng)用可使結(jié)腸組織上述炎癥因子含量明顯降低，表明可通過調(diào)節(jié)炎癥細胞因子減少結(jié)腸組織的損傷。

UC 造成結(jié)腸組織損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，體內(nèi)抗氧化酶SOD、CAT 及GSH-Px 等在UC 發(fā)生發(fā)展中起重要作用[17]。 本實驗結(jié)果顯示，DSS 組小鼠結(jié)腸組織MDA 含量明顯上升，SOD、CAT 及GSH-Px 活性明顯下降，GPS 與QT 聯(lián)合應(yīng)用可使結(jié)腸組織MDA含量明顯下降，SOD、CAT 及GSH-Px 活性明顯上升，表明可通過對抗氧化應(yīng)激損傷保護結(jié)腸組織。