崔 怡 朱曉駿 尚 志 方 淼 唐亦非 高月求△

1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院 (上海, 201203) 2.上海中醫(yī)藥大學曙光臨床醫(yī)學院

慢性乙型肝炎(CHB)目前仍然是全球性公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計,全球有2.57億人為慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者,是肝硬化、肝細胞癌(HCC)和肝病相關(guān)死亡的主要危險因素,每年約88.7萬人死于HBV相關(guān)疾病[1-3]。中國是世界上HBV感染負擔最重的國家,1～59歲人群中HBV表面抗原(HBsAg)的總體攜帶率為7.18%,相當于有9 300萬HBV攜帶者[4],約60%肝硬化患者和75%肝癌患者是由HBV感染引起的[5,6]?，F(xiàn)有的抗病毒藥物雖能有效抑制病毒復制,但無法徹底清除肝細胞中的HBV cccDNA,很難達到臨床治愈[7,8]。中草藥及其活性成分以其獨特的優(yōu)勢在治療CHB方面發(fā)揮重要作用,具有廣闊的應用前景[9]。靈貓方是上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝病科治療CHB的有效驗方。前期研究發(fā)現(xiàn),靈貓方可有效改善CHB患者的臨床證候,提高患者的生化指標和抗病毒應答反應,增強免疫應答[10-13]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6N雄性小鼠,3周齡,30只,SPF級,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司[實驗動物生產(chǎn)許可證編號SCXK(浙)2019-0001,實驗動物使用許可證編號SYXK(滬)2017-0014,實驗動物合格證編號20211012Abzz0619000774]。本研究在北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司上海分公司SPF級飼養(yǎng)室進行動物飼養(yǎng)、造模與觀察。所有實驗均遵照國家相關(guān)實驗動物的使用、福利和倫理學要求等規(guī)定。

1.2 藥物與試劑 ①實驗藥物:靈貓方由仙靈脾、女貞子、黃芪、貓爪草各15 g,胡黃連、青皮各9 g組成。根據(jù)前期實驗基礎,以人鼠劑量9.1倍換算,按照11.83 g/kg劑量灌胃給藥。所用藥物均為中藥配方顆粒,由江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(生產(chǎn)批號:仙靈脾20056134、女貞子21066074、黃芪20116104、貓爪草19076164、胡黃連20092211、青皮21046274)。②試劑: PrcccDNA ShB2m、pCMV-Cre質(zhì)粒為本實驗室所有;大腸桿菌DH5α為本實驗室保存;無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(TIANGEN,貨號 DP117);IFNα試劑盒(GenXspan,貨號GXP557484);F4/80抗體(abcam,貨號 ab111101);DAB顯色液(邁新,貨號 DAB-2031);EDTA抗原修復液(邁新,MVS-0099);過氧化物酶阻斷劑(Biotechnologies,貨號SP KIT-A3)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列(5′to 3′)

1.3 實驗方法

1.3.1 HBV小鼠模型構(gòu)建及分組情況 PrcccDNA ShB2m及pCMV-Cre質(zhì)粒均用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒制備,質(zhì)粒制備方法如下:兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染大腸桿菌DH5α,從轉(zhuǎn)染的細菌平板中挑取生長良好的單菌落接種于LB液態(tài)培養(yǎng)基,37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜,其中轉(zhuǎn)染PrcccDNA ShB2m的細菌使用含50 μg/ml氨芐青霉素的培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染pCMV-Cre的細菌使用含50 μg/ml卡那霉素的培養(yǎng)基。菌液4℃離心,棄上清后依次加入溶液P1、P2、P3,QF緩沖液洗脫,異丙醇沉淀,100%乙醇清洗并溶于TE緩沖液,即可獲取無內(nèi)毒素的高濃度質(zhì)粒。采用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)建立HBV小鼠模型,將小鼠按照隨機數(shù)字表法分為3組,模型組和靈貓方組小鼠尾靜脈高壓水注射1.5 ml含6 μg PrcccDNA ShB2m及pCMV-Cre質(zhì)粒的生理鹽水,正常組小鼠注射等量生理鹽水。第3天采集小鼠眼眶靜脈血,Elisa檢測分析血清中HBsAg、HBeAg水平。靈貓方組小鼠按10 ml/kg劑量灌胃,2次/d;模型組和正常組小鼠以等體積飲用水灌胃,連續(xù)灌胃3 d。

1.3.2 標本留取 第3天灌胃結(jié)束后禁食12 h,用2%戊巴比妥鈉3 ml/kg腹腔注射麻醉,經(jīng)眼眶靜脈叢采血,3 000 r/min離心15 min后吸取血清,-80℃低溫保存。打開腹腔,從門靜脈灌注生理鹽水沖洗肝臟,在同一肝葉位置切取一小塊組織,置入10%中性多聚甲醛中固定;另切取一小塊肝組織分裝于離心管中-80℃低溫保存;剩余肝組織研磨,4℃、400 g離心15 min后棄上清,沉淀用Percoll混勻,850 g梯度離心25 min,設置提速加速度為9、減速加速度為0,沉淀加入2 ml紅細胞裂解液室溫放置3～5 min,4℃、400 g離心7 min后棄上清,即可得到肝臟免疫細胞,-80℃低溫保存。

1.3.3 檢測指標與方法 (1)Elisa檢測血清HBsAg、HBeAg、IFNα水平:血清HBsAg、HBeAg水平委托上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院檢驗科檢測。IFNα水平按照Elisa檢測試劑盒說明書操作,取出血清并稀釋,標準品孔加入50 μl不同濃度(2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)的標準品,設置待測樣本孔及空白孔,除空白孔外其余各孔加入酶試劑,封板溫育后重復洗滌5次,顯色,加入終止液后測定各孔的吸光度(OD值)。(2)IHC檢測肝組織F4/80蛋白表達:石蠟切片脫蠟,PBS洗3次加入EDTA抗原修復液,微波高火2 min、低火15 min修復抗原,自然冷卻至室溫后PBS洗3次,滴加3%過氧化氫以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性,PBS洗3次后10% BSA封閉60 min,滴加F4/80一抗(1∶500)4℃孵育過夜, PBS洗3次,滴加二抗(1∶200)室溫孵育60 min,PBS洗3次,DAB顯色,蘇木精染核,自來水沖洗,梯度乙醇脫水,樹脂封片,顯微鏡下觀察,采用Image J 軟件統(tǒng)計F4/80積分吸光度(IA)。(3)實時熒光定量PCR檢測肝組織TNFα、IL-1β、IL6 mRNA表達:稱取50 mg肝組織,加入500 μl RLS裂解液,全自動研磨儀勻漿90 s,RNA快速提取試劑盒提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA,實時熒光定量PCR檢測TNFα、IL-1β、IL-6、β-actin mRNA,采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。(4)蛋白質(zhì)組學檢測:肝免疫細胞加入蛋白裂解液500 μl,冰上裂解30 min,4℃、12 000 r/min離心10 min,取上清,BCA法測定蛋白濃度;二硫蘇糖醇56℃還原30 min,碘代乙酰胺室溫避光孵育15 min,37℃酶解過夜;Strata X C18(Phenomenex)除鹽,TEAB溶解,乙腈標記,室溫孵育2 h,重復除鹽后真空冷凍干燥;高pH反向HPLC分級處理60 min,真空冷凍干燥;液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析,Maxquant檢索質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 靈貓方對實驗小鼠血清HBsAg、HBeAg滴度和IFNα水平的影響 與模型組比較,靈貓方干預3 d后,靈貓方組小鼠血清HBsAg、HBeAg滴度明顯下降(P<0.05,P<0.01),IFNα水平顯著上升(P<0.01)。見圖1,圖2。

圖2 靈貓方對實驗小鼠血清IFNα水平的影響 (*P<0.01)

2.2 靈貓方對實驗小鼠肝組織F4/80蛋白表達的影響 與正常組比較,模型組小鼠肝組織F4/80蛋白表達量明顯升高(P<0.01);與模型組比較,靈貓方組小鼠肝組織F4/80蛋白表達量明顯降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 靈貓方對實驗小鼠肝組織F4/80蛋白表達的影響 (*P<0.01)

2.3 靈貓方對實驗小鼠肝組織TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響 與正常組比較,模型組小鼠肝組織TNFα、IL-1β、IL-6mRNA表達明顯升高(P<0.01,P<0.001);與模型組比較,靈貓方組小鼠肝組織TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA 表達明顯降低(P<0.01)。見圖4。

圖4 靈貓方對實驗小鼠肝組織TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響 (*P<0.01)

圖6 實驗小鼠肝臟免疫細胞差異蛋白KEGG通路富集分析

圖7 實驗小鼠肝臟免疫細胞差異蛋白表達定量分析

2.4 靈貓方對實驗小鼠肝臟免疫細胞蛋白質(zhì)組的影響 對模型組及靈貓方組小鼠肝臟免疫細胞質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行生物信息學分析,GO分析顯示,差異蛋白顯著富集于代謝相關(guān)功能,包括脂代謝;KEGG通路富集分析顯示,差異蛋白顯著富集于PPAR通路;差異蛋白表達定量分析顯示,與模型組比較,靈貓方組免疫細胞的代謝能力下降,天然免疫應答上升。見圖5～7。

3 討論

靈貓方以仙靈脾、女貞子為君,溫而不悍,補而不膩,并補腎之陰陽[14];貓爪草、胡黃連為臣,清化肝經(jīng)濕熱疫毒;黃芪為佐,補益后天脾氣,助君藥培養(yǎng)先天,并使補而不滯;青皮為使,引諸藥入足厥陰之經(jīng)。前期研究表明,靈貓方可促進pHBV1.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞的Ⅰ、Ⅲ型干擾素(IFN)表達,增強固有免疫功能[9];靈貓方可提高CHB患者外周血NK細胞數(shù)量及其胞內(nèi)外TLR3的表達水平,調(diào)節(jié)機體免疫功能[12]。

CHB免疫發(fā)病機制十分復雜,至今尚未完全闡明[15,16]。脂質(zhì)代謝已被證明在抗病毒反應中發(fā)揮重要作用[17],代謝過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是早期Ⅰ型IFN反應的關(guān)鍵特征,IFN-α的生成與巨噬細胞參與膽固醇合成的基因下調(diào)有關(guān)[18]。本研究結(jié)果提示,靈貓方促進HBV感染小鼠IFNα分泌,降低HBsAg、HBeAg滴度;蛋白組學分析顯示,靈貓方可抑制免疫細胞代謝,提高天然免疫應答。據(jù)此推測,靈貓方可能通過抑制免疫細胞脂質(zhì)代謝,促進IFNα分泌,從而降低HBV相關(guān)血清標志物的表達。

巨噬細胞脂依賴脂肪酸氧化途徑獲取能量,通過激活活性氧和NLRP3炎癥小體分泌IL-1β等促炎因子[19]。PPAR主要分布在肝臟、腸道及心臟組織,誘導線粒體脂肪酸氧化的限速酶CPT-1表達,增強線粒體對脂肪酸的利用和氧化[20],同時,PPAR在抑制炎癥因子生成方面亦發(fā)揮著重要作用[21]。本研究結(jié)果提示,靈貓方可降低HBV感染小鼠肝組織F4/80蛋白表達,抑制TNFα、IL-1β、IL-6等促炎因子的釋放;蛋白組學分析顯示,差異蛋白顯著富集于PPAR通路。據(jù)此推測,靈貓方可能通過作用于PPAR信號通路,降低巨噬細胞表達,抑制促炎因子的釋放。

綜上,靈貓方可能通過作用于PPAR信號通路,參與免疫細胞脂質(zhì)代謝重編程,進而增強HBV相關(guān)免疫應答,同時抑制促炎因子的釋放。本研究為靈貓方調(diào)控HBV相關(guān)免疫機制提供了一定的實驗依據(jù),為該方今后應用于CHB的臨床治療提供科學證據(jù),具體的藥理機制有待于進一步探究。