趙梓棋，李艷紅，李 慧，盧智華，張紅梅，齊 琦，畢成名，王丹慧，王 斌，白曉玲，張河霞

蒙牛乳業(yè)有限公司，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特市 011500

0 引言

N-乙酰神經(jīng)氨酸是一種重要的α-酮酸，其特點(diǎn)是具有9個(gè)碳的母鏈[1]，分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。在自然界，N-乙酰神經(jīng)氨酸廣泛分布，大多以衍生物形式存在于眾多生物組織中。例如，唾液酸是N-乙酰神經(jīng)氨酸的一種形式，可以在脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛找到，主要分布在腦、乳、血液和神經(jīng)黏液蛋白中。此外，N-乙酰神經(jīng)氨酸也是組成細(xì)胞膜上糖蛋白和糖脂的關(guān)鍵成分[2]。

圖1 N-乙酰神經(jīng)氨酸的分子結(jié)構(gòu)

作為一種天然的大腦營養(yǎng)素，N-乙酰神經(jīng)氨酸積極參與多種生物學(xué)過程，包括體內(nèi)的抑菌、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒活動(dòng)，以及在細(xì)胞識(shí)別和認(rèn)知發(fā)育中的作用。因此，含有大量N-乙酰神經(jīng)氨酸的嬰幼兒產(chǎn)品在市場(chǎng)上具有明顯的優(yōu)勢(shì)。N-乙酰神經(jīng)氨酸不僅可促進(jìn)嬰兒大腦發(fā)育和認(rèn)知能力提升[3]，也有助于改善嬰幼兒的腸道環(huán)境，提高對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。因此，N-乙酰神經(jīng)氨酸在嬰幼兒成長過程中扮演著至關(guān)重要的角色[4]。

大部分動(dòng)物組織中的唾液酸的主要形態(tài)為N-乙酰神經(jīng)氨酸。在人體中，唾液酸特指N-乙酰神經(jīng)氨酸。人體內(nèi)的N-乙酰神經(jīng)氨酸主要來源于母乳，初乳中的含量最為豐富。N-乙酰神經(jīng)氨酸也存在于牛奶中。隨著國民生活水平的提升，人們對(duì)食品的營養(yǎng)價(jià)值更加重視[5]。牛奶營養(yǎng)價(jià)值極高，包含豐富的礦物質(zhì)和身體所需的微量元素，在預(yù)防各種慢性疾病、促進(jìn)人體各項(xiàng)功能發(fā)育等方面效果顯著。因此，將N-乙酰神經(jīng)氨酸通過現(xiàn)代化工藝引入乳制品，將是行業(yè)的未來發(fā)展趨勢(shì)。在此背景下，提升N-乙酰神經(jīng)氨酸的檢測(cè)技術(shù)至關(guān)重要。一種可靠、準(zhǔn)確的N-乙酰神經(jīng)氨酸檢測(cè)方法可以準(zhǔn)確確定食品的營養(yǎng)價(jià)值。目前已有檢測(cè)N-乙酰神經(jīng)氨酸含量的許多方法。如薄層色譜、硫代巴比妥酸和苯二酚比色等方法[6]，這些方法具有操作簡便、檢測(cè)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[7]，但受樣品中糖苷和不飽和脂肪酸的影響，方法穩(wěn)定性和抗干擾能力差[8]。隨著科技的進(jìn)步，傳感器法、高效液相色譜法、液-質(zhì)聯(lián)用法和氣-質(zhì)聯(lián)用法等新的檢測(cè)方法不斷應(yīng)用[9]。其中，高效液相色譜法因其快速、便捷、定量準(zhǔn)確且成本低等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用[10]。盡管有研究已經(jīng)利用高效液相色譜法測(cè)定奶粉中唾液酸的含量[11]，但該方法復(fù)雜度較高，操作不易，并且不適合大批量樣本的檢測(cè)[12，13]。

因此，本文的目標(biāo)是建立一種快速、操作簡單的檢測(cè)方法，以對(duì)唾液酸原樣、乳制品和乳清蛋白粉中添加的N-乙酰神經(jīng)氨酸進(jìn)行定量分析。此檢測(cè)方法的建立對(duì)于實(shí)現(xiàn)乳制品與N-乙酰神經(jīng)氨酸的有效融合具有積極意義，可豐富相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)研究，也為生物活性物質(zhì)的檢測(cè)提供了數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

UHT奶、唾液酸原樣、乳清蛋白粉；N-乙酰神經(jīng)氨酸（色譜純），上海安普實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；0.22 μm混合膜；甲醇（色譜純）、濃硫酸、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅，上海麥克林生化科技股份有限公司。除另有說明外，所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器，沃特世（Waters）科技有限公司；HC-3518高速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；ME204E電子分析天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；SB-4200DT超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；移液器，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；實(shí)驗(yàn)用水按照GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)實(shí)驗(yàn)用水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 mg/mL）：準(zhǔn)確稱取0.100 0 g（精確至0.000 1 g）N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，用一級(jí)水溶解，轉(zhuǎn)移至容量瓶中，加水定容至10 mL，該溶液不能長期保存，需現(xiàn)用現(xiàn)配。

0.005 mol/L 硫酸水溶液：準(zhǔn)確吸取0.267 mL硫酸注入少量一級(jí)水中，用一級(jí)水稀釋至1 L，用0.22 μm濾膜過濾，經(jīng)超聲脫氣10 min后備用。

0.005 mol/L 硫酸甲醇溶液：準(zhǔn)確吸取0.268 mL硫酸注入少量甲醇中，用甲醇稀釋至1 L，用0.22 μm濾膜過濾，經(jīng)超聲脫氣10 min后備用。

1.3.2 樣品的制備

（1）UHT奶試樣處理

準(zhǔn)確稱取0.200 0 g（精確到0.000 1 g）樣品于100 mL容量瓶中，加入約50 mL水，加1 mL的106 g/L亞鐵氰化鉀溶液，搖勻，加1 mL的92 g/L乙酸鋅溶液搖勻，加水定容，搖勻。取部分溶液9 000 r/min離心10 min，樣液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液待測(cè)定。

（2） 唾液酸原樣處理

準(zhǔn)確稱取0.200 0 g（精確到0.000 1 g）樣品于燒杯中，用少量水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加水定容，搖勻。取部分溶液9 000 r/min離心10 min，樣液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液待測(cè)定。

（3） 乳清蛋白粉試樣處理

準(zhǔn)確稱取0.200 0 g（精確到0.000 1 g）樣品于燒杯中，用少量水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，加1 mL的106 g/L亞鐵氰化鉀溶液搖勻，加1 mL的92 g/L乙酸鋅溶液搖勻，加水定容，搖勻。取部分溶液9 000 r/min離心10 min，樣液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液待測(cè)定。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），配有柱溫箱。流動(dòng)相A：0.005 mol/L 硫酸水溶液。流動(dòng)相B：0.005 mol/L 硫酸甲醇溶液，梯度洗脫，紫外檢測(cè)波長為210 nm，進(jìn)樣體積10 μL，優(yōu)化后的梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.5、1、1.5、2、3 mL于容量瓶中，加水定容至10 mL（濃度為0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）。取上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL進(jìn)樣。以N-乙酰神經(jīng)氨酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置固定條件，采用梯度洗脫法中使用0.005 mol/L的硫酸溶液和0.005 mol/L的硫酸甲醇溶液作為流動(dòng)相。以出峰保留時(shí)間為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別以柱溫（30、35、40、45 ℃）、流動(dòng)相流速（0.5、0.6、0.7、0.8 mL/min）、流動(dòng)相pH值（1.0、2.0、3.0、4.0）、流動(dòng)相比例（75∶25、80∶20、85∶15、90∶10）等四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.6.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)柱溫（A）、流動(dòng)相流速（B）、流動(dòng)相pH值（C）、流動(dòng)相比例（D）進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化高效液相色譜法檢測(cè)乳及乳制品中的唾液酸含量最佳實(shí)驗(yàn)條件，正交因素水平表見表2。

表2 正交因素水平表

1.7 色譜分析結(jié)果表述

試樣中N-乙酰神經(jīng)氨酸含量按公式（1）進(jìn)行計(jì)算：

式中：

X——試樣中N-乙酰神經(jīng)氨酸含量，單位g/100g；

C——進(jìn)樣樣液中 N-乙酰神經(jīng)氨酸含量，單位mg/mL；

V——樣品定容體積，單位mL；

m——樣品取樣量，單位g；

計(jì)算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

N-乙酰神經(jīng)氨酸具有紫外吸收能力，本實(shí)驗(yàn)在紫外檢測(cè)器210 nm處配合C18色譜柱對(duì)其進(jìn)行分析。影響N-乙酰神經(jīng)氨酸出峰的主要因素有流動(dòng)相pH值、流動(dòng)相比例、流動(dòng)相流速、柱溫[14]。因此我們通過尋找最佳的色譜條件流動(dòng)相pH值、流動(dòng)相比例、流動(dòng)相流速、柱溫，對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸的檢測(cè)工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 流動(dòng)相流速的選擇

流動(dòng)相的流速是影響N-乙酰神經(jīng)氨酸保留時(shí)間的重要因素。當(dāng)流速增大時(shí)，流動(dòng)相洗脫能力增強(qiáng)，保留時(shí)間變小，峰形較窄，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短，同一時(shí)間處理樣品效率高[15]；當(dāng)流動(dòng)相流速減小時(shí)，流動(dòng)相洗脫能力降低，保留時(shí)間增加，峰形更寬，同一時(shí)間處理樣品效率降低[16]。本文主要研究樣品在流動(dòng)相流速為0.5 mL/min、0.6 mL/min、0.7 mL/min、0.8 mL/min時(shí)對(duì)保留時(shí)間的影響。如圖2所示，樣品中N-乙酰神經(jīng)氨酸檢測(cè)出峰完整，無包峰，雜峰較少。流動(dòng)相流速改變時(shí)，樣品峰形變化差異較小，保留時(shí)間變化差異較大，當(dāng)流動(dòng)相流速為0.5 mL/min、0.6 mL/min、0.7 mL/min、0.8 mL/min時(shí)，保留時(shí)間分別為6.23 min、5.69 min、5.58min、5.03 min。流動(dòng)相流速較低時(shí)樣品分析時(shí)間較長，分析效率較低，流動(dòng)相流速較大時(shí)，液相系統(tǒng)壓力較大，對(duì)管路和色譜柱損傷較大，綜合考慮選擇流速為0.6 mL/min進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 流動(dòng)相不同流速下樣品色譜峰圖

2.1.2 柱溫的選擇

高效液相色譜法檢測(cè)法時(shí)，柱子溫度對(duì)保留時(shí)間和色譜峰形有一定影響，通過檢測(cè)樣品中物質(zhì)與固定相的結(jié)合-分離差異產(chǎn)生分離作用，溫度對(duì)物質(zhì)的結(jié)合-分離過程產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響保留時(shí)間和色譜峰形[17]。因此本文對(duì)色譜柱的溫度進(jìn)行優(yōu)化，以保留時(shí)間和色譜峰形為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別在柱子溫度為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃時(shí)進(jìn)樣。當(dāng)柱子溫度較高時(shí)，物質(zhì)的結(jié)合-分離過程加快，但是樣品的保留時(shí)間不穩(wěn)定，會(huì)加大分析的復(fù)雜程度，物質(zhì)的分辨率降低[18]；如果柱子溫度較低，會(huì)延長分離過程，分辨率增高，低溫下流動(dòng)相的粘度相對(duì)較高，較長的保留時(shí)間會(huì)增加蠕動(dòng)泵和色譜柱的損傷[19]。如圖3所示，分別在色譜柱溫30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃下檢測(cè)，色譜峰峰形基本相似，無前傾、拖尾；色譜柱溫為30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃時(shí)，保留時(shí)間分別為6.20 min、5.93 min、5.68 min、5.28 min。樣品中唾液酸色譜峰均能夠達(dá)到很好的分離，樣品中其它雜質(zhì)峰對(duì)主峰測(cè)定無干擾[20]。隨著色譜柱溫度的增加，保留時(shí)間縮短。所以在柱溫為45 ℃時(shí)保留時(shí)間最小，但柱溫較高時(shí)分離-結(jié)合的不穩(wěn)定性加大；溫度較低時(shí)洗脫效率較低，時(shí)間更長，增大色譜柱的損傷[21]。綜合考慮溫度的影響和分離效果以及效率的情況下，選擇柱溫為40 ℃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同色譜柱溫下樣品色譜峰圖

2.1.3 流動(dòng)相比例的選擇

流動(dòng)相所用溶劑和比例的變化影響流動(dòng)相的極性，對(duì)溶劑的洗脫能力和強(qiáng)度產(chǎn)生影響[22]，進(jìn)而影響物質(zhì)的保留時(shí)間和響應(yīng)值[23]。本文采用0.005 mol/L硫酸水溶液和0.005 mol/L硫酸甲醇溶液為流動(dòng)相，以保留時(shí)間和峰形為指標(biāo)對(duì)流動(dòng)相的比例進(jìn)行優(yōu)化，硫酸水溶液和硫酸甲醇溶液的體積比分別為90∶10、85∶15、80∶20、75∶25（V/V）對(duì)色譜峰分離的影響。如圖4所示，不同流動(dòng)相比例對(duì)保留時(shí)間和峰形有較大的影響，隨著有機(jī)相比例的增加，洗脫能力和洗脫效率提高，保留時(shí)間逐漸縮小，色譜峰形變化不明顯。水相：有機(jī)相比例為90∶10（V/V）時(shí)流動(dòng)相洗脫能力降低，保留時(shí)間最大為6.58 min。保證減少儀器設(shè)備損傷和節(jié)約藥品以及分離效果的基礎(chǔ)上，綜合考慮選擇流動(dòng)相水相：有機(jī)相比例為85∶15（V/V）時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 流動(dòng)相中水相pH值的選擇

流動(dòng)相的pH值對(duì)色譜峰的峰形產(chǎn)生較大影響，本文通過加入硫酸來調(diào)整流動(dòng)相的pH值，抑制其解離速度，改變極性可解離化合物的容量因子，提高分離選擇性和色譜峰的對(duì)稱性，研究pH值對(duì)峰形和保留時(shí)間的影響[24]。本文采用硫酸調(diào)整水相pH值為1.0、2.0、3.0、4.0進(jìn)行分析。如圖5所示，所有樣品出峰完整，雜峰較少，不影響N-乙酰神經(jīng)氨酸色譜峰的分析計(jì)算。流動(dòng)相pH值為1和4時(shí)保留時(shí)間相差0.1分鐘，pH值差異對(duì)保留時(shí)間有影響，pH值為1時(shí)色譜峰形有一定的前延、不對(duì)稱，并且pH值較低時(shí)，對(duì)C18色譜柱損傷較大，不利于長期大量檢測(cè)。說明改變pH值對(duì)保留時(shí)間和峰形有一定影響。表明在流動(dòng)相水相：有機(jī)相比例為85∶15（V/V）的體系中，pH值相差較小時(shí)對(duì)N-乙酰神經(jīng)氨酸與流動(dòng)相的分離與結(jié)合影響較小。綜合考慮到經(jīng)濟(jì)型和分離效果，選擇pH值為2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖5 不同流動(dòng)相pH 值下樣品色譜峰圖

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示，影響唾液酸保留時(shí)間的因素主次順序?yàn)椋篈、B、D、C，實(shí)驗(yàn)組A3B3C2D1的保留時(shí)間最短為5.42 min，A2B1C2D3的保留時(shí)間最長為5.79 min。理論保存時(shí)間最短組合為A3B3C1D1，最長組合為A1B1C3D3。以實(shí)驗(yàn)效率較快和儀器損傷較低的角度考慮，選擇保留時(shí)間長短適中的實(shí)驗(yàn)組為A2B2C3D1，理論組為A2B2C2D2，理論組合實(shí)驗(yàn)組條件不同，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

通過正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，對(duì)A2B2C2D2進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，重復(fù)三次。唾液酸保留時(shí)間為5.69 min，與實(shí)驗(yàn)組5保留時(shí)間幾乎相同，結(jié)合樣品前處理和實(shí)驗(yàn)5流動(dòng)相pH值為1，對(duì)色譜柱損傷較大，選擇理論組合A2B2C2D2為最佳實(shí)驗(yàn)條件。所以檢測(cè)唾液酸含量的最佳實(shí)驗(yàn)條件為：柱溫為40 ℃、流速為0.6 mL/min、流動(dòng)相pH值為2.0、流動(dòng)相比例為85∶15。

2.3 N-乙酰神經(jīng)氨酸色譜法分析方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限分析

分別準(zhǔn)確量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.5、1、1.5、2、3 mL于容量瓶中，加水定容至10 mL（濃度為0、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 mg/mL）。取上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL進(jìn)樣檢測(cè)。以N-乙酰神經(jīng)氨酸濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表4。相關(guān)系數(shù)為0.998 944，標(biāo)準(zhǔn)方程線性范圍為0～3.0 mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程結(jié)果滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析要求。如圖6所示，N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為5.69 min，色譜峰圖出峰完整，峰形對(duì)稱，無拖尾，雜峰較少[25]。表明此方法檢測(cè)3種樣品中的N-乙酰神經(jīng)氨酸含量結(jié)果較為準(zhǔn)確。

表4 N-乙酰神經(jīng)氨酸線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖6 N-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰圖

2.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取液態(tài)奶樣品加標(biāo)量為25 g/100 g、50 g/100 g、100 g/100 g和唾液酸原樣以及乳清蛋白粉加標(biāo)量為50 g/100 g的樣品分別重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定N-乙酰神經(jīng)氨酸含量，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。精密度結(jié)果如表5所示，液態(tài)奶樣品中N-乙酰神經(jīng)氨酸檢測(cè)精密度為0.54%～2.59%，表明此方法檢測(cè)樣品中N-乙酰神經(jīng)氨酸精密度良好。

表5 N-乙酰神經(jīng)氨酸的精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取3種樣品分別經(jīng)前處理后過濾到6個(gè)進(jìn)樣瓶，進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)3種樣品中N-乙酰神經(jīng)氨酸含量并計(jì)算相對(duì)應(yīng)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算結(jié)果如表6所示，3種樣品的RSD值分別為0.44%、0.27%、0.95%，表明該方法檢測(cè)3種樣品中N-乙酰神經(jīng)氨酸重現(xiàn)性較好，滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析要求。

表6 樣品中N-乙酰神經(jīng)氨酸重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 回收率實(shí)驗(yàn)

采用加標(biāo)回收法，分別取UHT奶、唾液酸原樣、乳清蛋白粉向樣品中分別加入定量的N-乙酰神經(jīng)氨酸進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本平行3次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各樣本的回收率和不同樣本的平均回收率以及標(biāo)準(zhǔn)偏差。如表7所示，液態(tài)奶和乳清蛋白粉中沒有檢測(cè)出，唾液酸原樣中檢測(cè)乙酰神經(jīng)氨酸平均含量為108.3 g/100 g，加標(biāo)法檢測(cè)回收率，液態(tài)奶回收率在99.20%～101.60%，唾液酸原樣在99.80%～103.94%，乳清蛋白粉在100.40%～103.66%，平均回收率分別為100.82%、102.12%、102.48%，回收率均符合實(shí)驗(yàn)要求；RSD分別為1.08%、1.59%、1.51%，表明此方法檢測(cè)3種樣品中的N-乙酰神經(jīng)氨酸含量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

表7 N-乙酰神經(jīng)氨酸的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

在本研究中，成功地建立了一種基于高效液相色譜-紫外檢測(cè)器的方法，用于測(cè)定唾液酸原樣、乳制品和乳清蛋白粉中添加的的N-乙酰神經(jīng)氨酸含量。所設(shè)計(jì)的前處理步驟通過使用亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液有效地沉淀了乳制品中的蛋白質(zhì)，從而克服了乳制品中其他物質(zhì)的干擾。經(jīng)過在8 000 rpm/min的條件下離心10分鐘，再通過0.22 μm濾膜過濾，樣本即可進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)根據(jù)保留時(shí)間和色譜峰形作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)流動(dòng)相流速、比例、pH值和色譜柱溫度進(jìn)行了優(yōu)化發(fā)現(xiàn)選用C18色譜柱、210 nm的紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長、40 ℃的色譜柱溫度、pH值為2的流動(dòng)相、0.6 mL/min的流速，以及85∶15的流動(dòng)相水相與有機(jī)相比例，并使用梯度洗脫可得出最優(yōu)結(jié)果。此外，還對(duì)此檢測(cè)方法的精密度、重復(fù)性和回收率進(jìn)行了評(píng)估。本研究所建立的方法具有良好的重復(fù)性、精密度高、回收率符合、檢測(cè)時(shí)間短、檢測(cè)過程簡單便捷等優(yōu)點(diǎn)。適用于唾液酸原樣、乳制品、乳清蛋白粉中進(jìn)行N-乙酰神經(jīng)氨酸含量的測(cè)定，此方法的成功開發(fā)為含N-乙酰神經(jīng)氨酸乳制品的開發(fā)提供有力支持，對(duì)乳制品行業(yè)的多元化發(fā)展具有重要意義。