畢成名，盧智華，李艷紅*，齊 琦，秦曉婷，王英南，李洪梅，王 斌，白曉玲，伊德潤

1 蒙牛乳業(yè)（唐山）有限責任公司，河北唐山 064000

2 蒙牛乳業(yè)常溫事業(yè)部，內蒙古呼和浩特 011500

0 引言

牛奶含有豐富的維生素、蛋白質、脂肪等營養(yǎng)物質，具有極高的營養(yǎng)價值，是人類重要的營養(yǎng)物質來源之一[1]。近年來更為嚴峻的環(huán)境污染，飲水和土壤中重金屬元素含量不斷提高[2]，環(huán)境中的金屬元素在食物鏈中不斷積累，牛奶受重金屬元素污染的風險急劇增加。人們長期食用被重金屬元素污染的牛奶，在體內富集到一定的程度，對人體器官造成不可逆轉的傷害[3]。重金屬元素汞在人體體內不斷積累會損害人的神經系統(tǒng)，引起聽覺和語言功能障礙[4]；重金屬元素砷在體內積累較多時會造成人體的急、慢性中毒，還可能會造成體內多種酶和基因產生影響，進而影響體內代謝，增加患多種疾病的風險[5]。因此，開發(fā)一種大規(guī)模靈敏檢測牛奶中重金屬元素的方法特別重要[6]。

牛奶中檢測重金屬元素的方法有很多，包括中有比色法和試紙法、酶聯免疫吸附等技術[7]、電感耦合等離子體質譜法[8]、原子熒光法[9]等。其中原子熒光方法由于檢測靈敏度高，檢出限較低，標準曲線相關系數符合要求[10]，樣品前處理相對簡單等優(yōu)點被廣泛應用到多種樣品的檢測中[11]。目前原子熒光法樣品前處理主要有沸水浴法和微波消解法，沸水浴消解法由于加熱時間長，整個加熱過程不封閉，可能降低檢測準確性，對人體健康有一定危害[12]。微波消解法以微波作為熱源將樣品加熱到200 ℃以上，使用更少量的硝酸將樣品消解的更加充分[13]。同時減少了樣品中揮發(fā)性元素的損失，多數微波消解儀可同時消解大約40 個樣品，時間大概是50 min左右，消解的質量和效率滿足大批量檢測的要求[14]。所以目前微波消解-原子熒光法檢測重金屬元素被廣泛應用在食品檢測領域[15]。

本文以質控樣檢測結果和加標回收率為評價指標，優(yōu)化前處理和檢測過程中還原劑硫脲添加量、硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度、氨基磺酸和硝酸的添加量和微波消解溫度等實驗條件，建立適合大批量檢測牛奶中重金屬元素總砷、總汞的方法，并對方法進行驗證和應用，為保障食用無污染的、健康的牛奶提供強有力的保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛奶（產自內蒙古呼和浩特）；硝酸、過氧化氫、氨基磺酸、鹽酸、硫脲、氫氧化鈉、硼氫化鈉均為分析純 上海麥克林生化科技股份有限公司；砷汞標準液 國家標準物質中心。

AFS-933原子熒光北京吉天儀器有限公司；TOPEX+全能型微波化學工作平臺；移液器賽默飛世爾科技（中國）有限公司； ME204E電子分析天平，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；實驗用水按照GB/T6682規(guī)定的一級實驗用水。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

參考王曉蘭[16]的操作方法并進行優(yōu)化，稱取0.8 g液態(tài)牛奶試樣于消解管中，加入一定體積的硝酸，2 mL過氧化氫，震蕩混合均勻，放置于微波消解儀中消解，消解完畢后冷卻至室溫，消解管中緩慢加入一定量的氨基磺酸溶液中和硝酸，冷卻至室溫后用5%的鹽酸溶液轉移至25 mL的容量瓶中，加入2.5 mL硫脲溶液用5%的鹽酸定容，混勻，至少放置30 min后，再上機進行檢測。

1.2.2 試劑的配制

（1）混合標準系列溶液的配制

將100 0 μg/mL的砷和汞標準儲備液分別稀釋到10 μg/mL和1 μg/mL，分別吸取0.25 mL定容于25 mL容量瓶中作為標準中間液；分別吸取0.0 mL 、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL標準中間液于6 個容量瓶中，加一定體積的還原劑硫脲溶液，用5%的鹽酸定容至25 mL，混勻后靜置反應30 min后上機測定。

（2）試劑及儀器載流液的配制

氨基磺酸（100 g/L）：精確稱取10.0 g氨基磺酸，用一級水溶解并定容至100 mL。

硫脲溶液（50 g/L）：精確稱取5g硫脲用一級水溶解并定容至100 mL。

鹽酸（5%）：量取50 mL鹽酸用一級水定容至100 0 mL。

氫氧化鈉溶液（3 g/L）：精確稱取3.0 g氫氧化鈉，用一級水溶解并定容至100 0 mL。

硼氫化鈉溶液（10～20 g/L）：稱取10～20 g硼氫化鈉，用3 g/L的氫氧化鈉溶液定容至1 000 mL。

重鉻酸鉀的硝酸溶液（0.5 g/L）：稱取0.5 g重鉻酸鉀，用硝酸溶液（5+95）溶解并定容至1 000 mL，混勻備用。

（3） 測定儀器條件

砷光電倍增管負高壓240 V，砷燈電流60 mA；汞光電倍增管負高壓240 V，汞燈電流30 mA；原子化器高度：10 mm，氬氣流速：載氣300 mL/min，屏蔽氣：800 mL/min，采用標準曲線法的測量方式。

1.2.3 結果計算

試樣檢測后，總砷和總汞含量按照以下公式計算：

式中：

X：總砷或總汞含量（mg/kg）；

C1：待測溶液濃度（ng/mL）；

C0：空白溶液濃度（ng/mL）；

m：樣品質量（g）；

V：試樣消化液體積（mL）；

1.2.4 單因素與正交實驗設計

（1）單因素實驗設計設置固定的反應條件。硫脲的添加量為2.5 mL，氫氧化鈉濃度為3 g/L，硫脲的添加量為2.5 mL，硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度為15 g/mL，氨基磺酸的添加量為2.5 mL，硝酸的添加量為5 mL，微波消解最高溫度保持時間為20 min。以質控樣檢測結果和加標回收率為評價指標，分別以還原劑硫脲添加量（40、50、60、70、80 g/L），硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度（10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 g/L），氨基磺酸添加量（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL）,硝酸添加量(3、4、5、6、7 mL)，微波消解溫度（180、185、190、195、200℃）等五個因素進行單因素實驗。

（2）正交實驗設計

根據單因素實驗結果，選取硫脲的濃度（A）、硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度（B）、硝酸添加量（C）、微波消解溫度（D），進行四因素三水平正交實驗，優(yōu)化微波消解-原子熒光法測定牛奶中重金屬元素砷和汞的最佳條件，正交因素水平表見表1。

表1 正交因素水平表

1.2.5 方法驗證

采用繪制標準曲線方程計算相關系數是否符合要求；通過重現性實驗，將同一樣本平行進樣6 次，計算檢測數據的標準偏差；通過精密度實驗，將6 個樣本處于同一實驗條件進樣6 次，計算數據的相對標準偏差。

對按照該實驗條件檢測的質控樣本和加標回收率過去一個季度的數據進行分析，在偏差允許的情況下，通過計算加標回收率和質控樣本的檢測數據驗證檢測方法的準確性。

1.2.6 牛奶樣本檢測

按照該方法分析過去半年檢測的牛奶樣本，對整體數據進行分析，評價檢測方法的快捷性、簡便性和準確性。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 硫脲的濃度結果分析

硫脲是具有強還原作用的還原劑，可以將消解后樣品中的五價砷還原為三價砷[17]。由圖1可知，硫脲在40～70 g/L濃度下，采用微波消解-原子熒光法檢測重金屬元素，總汞的加標回收率變化不顯著（P＞0.05），總汞回收率為93.4%～97.1%，硫脲對汞的加標回收率幾乎沒影響。在牛奶樣品中總砷加標回收率顯著升高（P＜0.05），砷回收率從76.1%升高到109.3%，當硫脲濃度較低時不能全部還原五價砷；濃度升高時，砷被還原的更多，加標回收率顯著升高（P＜0.05），在50 g/L時砷的加標回收率升高到97.2%；當濃度繼續(xù)增加時，砷的回收率超過100%，表明硫脲的濃度對砷加標回收率影響較大；綜合考慮節(jié)約試劑和實驗效果，回收率接近100%，選擇硫脲濃度為50 g/L進行實驗。

圖1 硫脲濃度對砷和汞加標回收率的影響

2.1.2 硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度結果分析

硼氫化鉀-氫氧化鉀是強還原劑，使三價砷和汞還原生成砷化氫和原子態(tài)汞，由氬氣運載到石英原子化器中，通過特質的砷和汞空心陰極燈的發(fā)射光激發(fā)下產生原子熒光，與標準系列比較計算[18]。由圖2可知，硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度在10～20 g/L的條件下，砷和汞的加標回收率呈先上升再下降的趨勢，當濃度較低時，三價砷和汞未能全部轉化為砷化氫和原子態(tài)汞，導致檢測值較低，當還原劑濃度繼續(xù)升高時，砷和汞的加標回收率顯著升高（P＜0.05）；濃度為15.0 g/L時，砷的回收率為96.1%，汞的回收率為99.6%，當還原劑的濃度繼續(xù)升高時，砷和汞的加標回收率呈現下降趨勢，可能是還原劑濃度較高，在上機器檢測時反應特別劇烈，使反應后的溶液有少部分噴出，進而使三價砷和原子態(tài)汞產生的原子熒光較低，導致回收率降低[19]。表明硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度對砷和汞的加標回收率影響較大，綜合分析檢測時反應的劇烈程度和回收率的大小，反應劇烈容易造成機器堵塞，增加設備維護成本，選擇硼氫化鉀-氫氧化鉀濃度為15.0 g/L進行實驗。

圖2 硼氫化鉀-氫氧化鉀濃度對砷和汞加標回收率的影響

2.1.3 氨基磺酸添加量結果分析

氨基磺酸主要中和前期加入的硝酸溶液，去除硝酸根離子、亞硝酸根離子和揮發(fā)性氮氧化物產生二氧化氮和氮氣，防止硝酸與硫脲反應生成氫氣，進而消耗原子態(tài)汞生成汞化氫，同時避免五價砷不能充分被還原為三價砷[20]。由圖3可知，在氨基磺酸添加量在1.5～3.5 mL時，總砷和總汞的加標回收率先顯著上升（P＜0.05），在氨基磺酸添加量在2.5 mL時，總砷的加標回收率達到95.6%，總汞的加標回收達到99.4%，氨基磺酸添加量繼續(xù)增大，總砷和總汞的加標回收率變化不顯著（P＞0.05），可能是因為氨基磺酸添加量為2.5 mL時正好中和硝酸，避免了硝酸與硫脲反應，對砷和汞的加標回收率產生影響[21]。表明氨基磺酸添加量為2.5 mL時中和硝酸效果較好，繼續(xù)增大添加量對回收率影響不顯著（P＞0.05），所以在后續(xù)正交實驗對該因素不再進行深入研究，選擇氨基磺酸添加量為2.5 mL進行后續(xù)實驗。

圖3 氨基磺酸添加量對砷和汞加標回收率的影響

2.1.4 硝酸添加量結果分析

硝酸是強氧化劑可以消解大多數無機樣品和容易消解的有機樣品，是最常用的消解試劑[22]，通常與雙氧水配合使用，提高消解效率。由圖4可知，當硝酸的添加量在3～5 mL范圍時，隨著硝酸添加量不斷增加，樣品消解越充分，砷和汞的加標回收率顯著升高（P＜0.05）。當硝酸添加量為5 mL時，砷的加標回收率為97.6%，汞的加標回收率為99.8%，回收率接近100%，表明樣品消解的充分。當硝酸的添加量繼續(xù)增大時，砷和汞的加標回收率變化不顯著（P＞0.05）。綜合考慮到消解效果和過量硝酸對實驗的影響，選擇硝酸添加量為5 mL。

圖4 硝酸添加量對砷和汞加標回收率的影響

2.1.5 微波消解溫度結果分析

微波消解是應用比較廣泛的一種消解方式，消解溫度可達200 ℃，消解效率比較高。由圖5所示，微波消解溫度在180～195 ℃范圍內，隨著消解溫度的不斷升高，樣品消解更加充分，汞的加標回收率顯著升高（P＜0.05），在消解溫度為195 ℃時，砷的加標回收率為99.1 %，汞的加標回收率為99.8 %。隨著消解溫度繼續(xù)增加，砷和汞的加標回收率變化不顯著（P＞0.05），表明微波消解溫度在195 ℃時樣品消解充分，不用再提高消解溫度。綜合考慮消解溫度提高后，消解管的壓力增加較大，耗能增加[23]，所以選擇消解溫度為195 ℃繼續(xù)實驗。

圖5 微波消解溫度對砷和汞加標回收率的影響

2.2 正交實驗結果分析

2.2.1 正交實驗設計與結果分析

正交實驗設計與結果如表2所示，影響總砷加標回收率因素主次順序為：C、A、B、D，實驗組A1B2C2D2的回收率最高為99.3%，理論最優(yōu)組合是A2B2C2D2。影響總汞加標回收率因素主次順序為B、C、A、D，實驗組A2B2C3D1的回收率最高為98.7%，理論最優(yōu)組合為A2B2C2D2。總砷和總汞加標回收率實驗組最優(yōu)組和理論最優(yōu)組回收率不同，需要進行驗證性實驗。

表2 正交實驗設計與結果

表3 標準曲線方程、線性范圍、相關系數、檢出限及定量限的實驗結果

2.2.2 驗證性實驗結果分析

通過正交實驗結果分析，對A2B2C2D2進行驗證性實驗，重復三次?？偵榧訕嘶厥章蕿?9.8%±0.8%，比實驗組A1B2C2D2的回收率更加接近100%，以A2B2C2D2為最佳實驗條件?？偣訕嘶厥章蕿?9.6%±1.1%，回收率比實驗組A2B2C3D1更加接近100%，以A2B2C2D2為最佳實驗條件。所以檢測砷和汞加標回收率的最佳實驗條件為：硫脲的濃度為50 g/L、硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度為15 g/L、硝酸添加量為5 mL、微波消解溫度為195 ℃。

2.3 方法驗證實驗結果分析

2.3.1 標準曲線方程結果分析

采用標準曲線的方法進行方法驗證，砷和汞的標準曲線為分別配置濃度為0、2、4、6、8、10 ng/mL的砷標準梯度溶液和濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ng/mL的汞標準梯度溶液，按照最優(yōu)實驗條件進行檢測。砷的標準曲線方程為Y=80.71X-9.43，相關系數為0.999 7，線性范圍是0～10 ng/mL，檢出限和定量限分別為0.01 mg/kg、0.04 mg/kg。汞的標準曲線方程為Y=929.74X-7.55，相關系數為0.999 2，線性范圍是0～1 ng/mL，檢出限和定量限分別為0.003 mg/kg、0.01 mg/kg。經分析砷和汞的標注曲線方程滿足后續(xù)實驗相關要求。

2.3.2 重現性實驗結果分析

取牛奶樣品分別經前處理后進行檢測。樣品中砷和汞的含量并計算相對應的平均值和RSD。結果如表4所示，樣品中砷和汞的加標回收率平均值和RSD值分別為99.39%、0.11%，98.81%、0.18%。砷質控樣本濃度為0.145 mg/kg，檢測結果平均值為0.147 mg/kg，RSD為3.8，表明采用該方法檢測砷質控樣數據符合要求；汞質控樣本濃度為0.044 6 mg/kg，檢測結果平均值為0.043 8 mg/kg，RSD為4.29，表明采用該方法檢測汞質控樣數據符合要求。通過檢測加標回收和質控樣本數據均符合要求，表明該方法可以用于檢測牛奶中砷和汞。

表4 重金屬元素質控和加標回收率樣本的重現性實驗結果

2.3.3 精密度實驗結果分析

采用同樣的方法分別進行6次實驗，計算數據的平均值和RSD。結果如表5所示，樣品中砷的加標回收率、質控檢測平均值和RSD值分別為99.35%、0.59，0.205 mg/kg、3.28。砷采用的質控樣本濃度為0.197 mg/kg，質控樣檢測值符合準確性要求，表明可以使用該方法檢測牛奶中重金屬砷。汞采用的質控樣本濃度為0.057 3 mg/kg，采用此方法質控樣檢測值為0.056 8 mg/kg，標注偏差符合實驗要求，表明可以采用此方法同時檢測牛奶中重金屬元素砷和汞。

表5 重金屬元素質控和加標回收率樣本精密度的實驗結果

2.3.4 加標回收率和質控樣本實驗結果分析

采用此方法對樣品檢測過程中，每周做一次加標回收率和質控樣本檢測判斷該方法的準確性，對最近一個季度的數據進行分析。如表6所示，砷和汞分別做了12次加標回收率檢測，平均值分別為98.84%、99.23%，RSD分別為1.91、1.01，回收率和RSD均符合數據分析要求。砷和汞進行了兩個濃度的質控樣本檢測各12次，砷的質控樣本濃度分別為0.145 mg/kg、0.197 mg/kg，采用此方法的檢測平均值分別為0.146 mg/kg、0.204 mg/kg，RSD分別為3.80、3.71，經過檢測質控樣本說明此方法檢測結果準確可靠。汞的質控樣本濃度分別為0.044 6 mg/kg、0.057 3 mg/kg，檢測值為0.044 5 mg/kg、0.056 5 mg/kg，RSD分別為2.79、3.05，砷檢測值偏差符合質控要求，表明可以應用此方法檢測牛奶樣本中的重金屬元素砷和汞。

表7 牛奶砷汞檢測結果

2.4 牛奶樣本檢測結果分析

采用此方法檢測牛奶中重金屬元素砷和汞，對過去6個月的檢測數據進行分析。如圖6所示，6個月共檢測樣品5 098個，砷檢測值超過檢出限的有34個，第四個月份時檢出最多為9 個，檢出率為1.07%，最低的為3月檢出2 個，檢出率為0.23%。汞共檢出26個，3月的檢出率最高為1.04%，4月的檢出率最低為0.12%。通過本實驗采用的6個月份實驗數據進行分析，表明這些批次牛奶重金屬元素砷和汞檢出率較低，奶源受污染的概率較低。此檢測方法的優(yōu)化為嚴格控制市場奶源重金屬污染貢獻力量。

圖6 砷和汞標準曲線方程擬合結果（A）砷、（B）汞

3 結論

通過對原劑硫脲的濃度、硼氫化鉀-氫氧化鉀的濃度，氨基磺酸的添加量,硝酸的添加量、微波消解溫度等前處理和上機條件做單因素和正交實驗優(yōu)化，成功建立了同時快速準確檢測牛奶中重金屬元素砷和汞的檢測方法。在一定的質量濃度范圍內，標準曲線方程相關系數大于0.999，質控和回收率檢測結果精密度、準確度符合要求，方法檢出限和定量想滿足日常檢測要求。為加大牛奶中重金屬元素砷和汞的監(jiān)管奠定基礎，為一線重金屬相關檢驗人員提供方法參考。