劉志彬

香河縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北廊坊 065400

0 引言

嗜血支原體（Mycoplasma wenyonii）是一種無(wú)細(xì)胞核、細(xì)胞壁和細(xì)胞器的原核生物，活動(dòng)能力較強(qiáng)，形態(tài)多樣，大多寄生于紅細(xì)胞表面、血漿和骨髓中。嗜血支原體自1928年首次在切除脾的鼠體中發(fā)現(xiàn)以來(lái)，已在牛、豬、犬、兔、羊、雞等多種動(dòng)物和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)[1]。該病原體早期稱附紅細(xì)胞體，歸為立克次氏體目，但根據(jù)電鏡觀察及16S rRNA基因序列分析結(jié)果，因與肺炎支原體密切相關(guān)，被劃為支原體屬[2，3]。奶牛嗜血支原體病是由牛嗜血支原體引起的以發(fā)熱、黃疸、貧血為主要癥狀的人獸共患病，可經(jīng)血液、消化道、蟲媒介等多種途徑傳播，四季流行，夏季多發(fā)。各年齡階段奶牛均可感染發(fā)病，出現(xiàn)體重下降，生長(zhǎng)阻滯，懷孕奶牛流產(chǎn)或胎衣不下，泌乳牛產(chǎn)奶量明顯減少的多樣化臨床癥狀。感染奶牛通常發(fā)病較慢，呈隱性感染，是潛在病原體的攜帶者和重要傳染源，往往被養(yǎng)殖者忽視。同時(shí)，由于長(zhǎng)期攜帶病原體，導(dǎo)致感染奶牛機(jī)體免疫力降低，容易造成其他病原微生物侵入而繼發(fā)或混合感染疾病。該病在奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)流行較廣，感染率可達(dá)86.2%[4]，嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益和健康發(fā)展。

準(zhǔn)確鑒定病原體對(duì)及時(shí)預(yù)防和治療該病具有重要作用。目前，實(shí)驗(yàn)室診斷該病方法較多，如鏡檢方法（包括直接血液涂片法、懸滴壓片法、姬姆薩染色法、瑞氏染色法）、血清學(xué)檢測(cè)方法、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法等?；鶎荧F醫(yī)臨床多采用鏡檢方法作為常規(guī)檢測(cè)手段，但容易出現(xiàn)誤診，準(zhǔn)確度不如PCR等分子生物技術(shù)高，要準(zhǔn)確檢測(cè)病原體需進(jìn)一步借助分子生物技術(shù)。因此，需尋求更接近PCR技術(shù)的常規(guī)檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床診斷，必要時(shí)進(jìn)一步采用PCR確診。河北省香河縣奶牛養(yǎng)殖有一定規(guī)模，但針對(duì)該病的流行情況缺乏系統(tǒng)、全面調(diào)查。為了解該病在本地區(qū)的感染態(tài)勢(shì)，本研究于2021年3月—2022年7月在香河縣采集9 家奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)2 562頭奶牛血樣，采用鏡檢和PCR結(jié)合方法進(jìn)行嗜血支原體病原學(xué)檢測(cè)，分析感染情況，為防治奶牛嗜血支原體病提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2021年3—4月在香河縣8 家奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)選取泌乳牛781 頭，每頭牛頸靜脈部位采集全血10 mL，裝入含3.8%檸檬酸鈉的離心管，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎弥苯油科?、血液懸滴壓片法、姬姆薩染色法、瑞氏染色法和PCR方法分別對(duì)781 份血樣檢測(cè)嗜血支原體，通過(guò)比對(duì)陽(yáng)性率，選擇與PCR方法陽(yáng)性率接近的鏡檢方法，同時(shí)對(duì)奶牛不同年齡階段、不同季節(jié)和垂直傳播的感染情況進(jìn)行調(diào)查。2021年5月，在6 家奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)根據(jù)不同年齡階段（犢牛、青年牛、泌乳牛）選取810 頭奶牛檢測(cè)嗜血支原體。2021年6月—2022年7月，在9 家奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)選取971 頭奶牛根據(jù)不同季節(jié)分類檢測(cè)嗜血支原體。同時(shí)，另選取30 頭病原體陽(yáng)性的妊娠奶牛，分別于產(chǎn)前7 d尾靜脈采血、產(chǎn)后新生犢牛臍靜脈采血，檢測(cè)垂直傳播的感染情況。

1.2 主要試劑

全血基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司；r Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、d NTP等PCR相關(guān)試劑購(gòu)自TaKaRa公司；瑞氏染色液、姬姆薩染色液等試劑購(gòu)自南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 引物

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的嗜血支原體 16S rRNA基因序列（登錄號(hào)：AY946266），利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)種特異性引物。上游引物F：5'-CGAACGAGTGGAACTTGTTCTGC-3'，下游引物R：5'-TAGTACCATCAAGGCGTGCTC-3'，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為415 bp。

1.4 鏡檢方法

參考楊紅英[4]等報(bào)道的方法對(duì)血液樣本分別采用血液懸滴壓片法、直接涂片法、姬姆薩染色法、瑞氏染色法進(jìn)行嗜血支原體鏡檢，并觀察結(jié)果。陰陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：每份血液樣本在4×100 倍光鏡下觀察20 個(gè)視野，紅細(xì)胞中可見(jiàn)1 個(gè)嗜血支原體者，判為陽(yáng)性，未觀察到嗜血支原體者，判為陰性。

感染強(qiáng)度判定標(biāo)準(zhǔn)：每份血樣記數(shù)100 個(gè)紅細(xì)胞，紅細(xì)胞感染率≤25%者為“＋”；25%＜紅細(xì)胞感染率≤50%者為“＋＋”；50%＜紅細(xì)胞感染率≤75%者為“＋＋＋”；75%＜紅細(xì)胞感染率≤100%者為“＋＋＋＋”[5]。

1.5 PCR 檢測(cè)

取血液樣本以3 500 r/min離心5 min，收集上清液，按照全血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA，以DNA為模板，利用P1/P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。50 μL擴(kuò)增體系25 μL：d NTP 5 μL，MgCL2 3 μL，r Taq DNA聚合酶1.25 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，加無(wú)菌水至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，運(yùn)行共32 個(gè)循環(huán)，最后，72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察目的片段。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)不同檢測(cè)方法結(jié)果進(jìn)行方差檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同方法檢測(cè)奶牛嗜血支原體陽(yáng)性率的結(jié)果比較

采用4 種不同方法對(duì)7 8 1 頭奶牛血樣進(jìn)行嗜血支原體檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表1），懸滴壓片法、姬姆薩染色法、瑞氏染色法獲得血樣陽(yáng)性率均高于PCR法，但各組之間差異不顯著（P＞0.05）。直接涂片法顯著高于其他檢測(cè)方法（P＜0.05）。

表1 不同方法檢測(cè)奶牛嗜血支原體陽(yáng)性率的結(jié)果比較

2.2 不同年齡階段的奶牛嗜血支原體陽(yáng)性率和發(fā)病率比較

懸滴壓片法和PCR法檢測(cè)泌乳牛感染的陽(yáng)性率和發(fā)病率均顯著高于犢牛和青年牛（P＜0.05）。不同年齡階段的PCR感染陽(yáng)性率和發(fā)病率依次為：泌乳牛＞犢牛＞青年牛（表2）。

表2 不同年齡階段的奶牛嗜血支原體陽(yáng)性率和發(fā)病率比較

2.3 不同季節(jié)的奶牛嗜血支原體陽(yáng)性率和發(fā)病率比較

夏季奶牛嗜血支原體陽(yáng)性率最高（表3），P C R 檢測(cè)陽(yáng)性率6 0.8 5%，與其他季節(jié)差異顯著（P＜0.05）；秋季顯著高于春季和冬季（P＜0.05）。

表3 不同季節(jié)的奶牛嗜血支原體陽(yáng)性率和發(fā)病率比較

2.4 奶牛嗜血支原體的垂直傳播情況

選擇無(wú)任何臨床癥狀的陽(yáng)性妊娠奶牛所產(chǎn)的30 頭新生犢牛，采用血液懸滴壓片法檢測(cè)嗜血支原體陽(yáng)性率為83.33%，PCR法陽(yáng)性率73.33%，妊娠奶牛、新生犢牛發(fā)病率分別13.33%、10.00%（表4），兩者無(wú)顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果表明嗜血支原體可由妊娠奶牛垂直傳播給犢牛。

表4 奶牛嗜血支原體的垂直傳播情況

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)奶牛養(yǎng)殖規(guī)?；潭戎鸩教岣?，飼養(yǎng)管理走向精細(xì)化，但一些奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的飼養(yǎng)管理技術(shù)和疫病防治手段還無(wú)法徹底遏制嗜血支原體病的傳染，尤其是大量散養(yǎng)模式生產(chǎn)進(jìn)一步增加了防控難度。此外，從該病流行特點(diǎn)看，感染奶牛多無(wú)臨床表現(xiàn)，發(fā)病率不高，而嗜血支原體陽(yáng)性率仍較高，流行廣泛，且病原體可經(jīng)母體垂直傳播，這給該病凈化防控帶來(lái)很大困難。因此，在嗜血支原體感染奶牛早期，采取科學(xué)有效的診斷方法發(fā)現(xiàn)并及時(shí)確診，對(duì)了解奶牛感染水平和實(shí)施疫病凈化措施尤為重要。

目前，常規(guī)的奶牛嗜血支原體病原學(xué)診斷方法主要為血液鏡檢方法和PCR法[6]。血液鏡檢方法是診斷附紅細(xì)胞體病常用方法之一，但存在許多不足，容易造成誤診[7]。本研究采用4 種不同檢測(cè)方法對(duì)781 頭奶牛血樣進(jìn)嗜血支原體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)直接涂片法、血液懸滴壓片法、姬姆薩染色法、瑞氏染色法獲得血樣陽(yáng)性率均高于PCR法，這與周作勇等[8]報(bào)道一致。分析原因主要有：一是直接涂片法和血液懸滴壓片法都容易導(dǎo)致紅細(xì)胞變形而被誤判為陽(yáng)性血樣，出現(xiàn)假陽(yáng)性樣本，造成感染率高于實(shí)際數(shù)量。瑞氏染色法和姬姆薩染色法也都可能存在染色液顆粒沉著于紅細(xì)胞表面而被誤判為嗜血支原體。二是奶?？赡芡瑫r(shí)感染嗜血支原體和其他形態(tài)相似于嗜血支原體的血液寄生蟲（如無(wú)形體），鏡檢時(shí)很難區(qū)別[8]。作為現(xiàn)代分子生物技術(shù)的PCR法具有靈敏性高、特異性、準(zhǔn)確性可靠的特點(diǎn)[9]，適合群體性檢測(cè)，可作為實(shí)驗(yàn)室確診手段之一。本研究結(jié)果顯示，血液懸滴壓片法最接近PCR法的檢測(cè)結(jié)果，臨床上可采用該法作為早期診斷，必要時(shí)結(jié)合PCR法確診，有助于提高感染率準(zhǔn)確性。

奶牛感染嗜血支原體不分年齡階段，但年齡差異影響陽(yáng)性率高低。黃占欣等[5]報(bào)道，邯鄲地區(qū)奶牛附紅細(xì)胞體感染率和發(fā)病率中，犢牛感染率最高為62.3%、發(fā)病率為9.2%，其次是泌乳牛感染率為52.6%、發(fā)病率為1.9%，而青年牛感染率和發(fā)病率相對(duì)較低，分別為48.2%和0.0%。本研究結(jié)果顯示，不同年齡階段PCR感染陽(yáng)性率和發(fā)病率依次為：泌乳牛＞犢牛＞青年牛，其中泌乳牛與犢牛、青年牛具有顯著差異。上述研究結(jié)果可能與自然飼養(yǎng)環(huán)境、奶牛感染強(qiáng)度、檢測(cè)方法等因素有關(guān)。

季節(jié)性也是影響奶牛感染嗜血支原體的重要因素，雖然該病發(fā)生無(wú)明顯季節(jié)性，但吸血節(jié)肢動(dòng)物（螨、蜱、虱、蚊、蚤、螫蠅、蠓等）是動(dòng)物嗜血支原體傳播擴(kuò)散的主要媒介，若在夏秋季節(jié)，即吸血節(jié)肢動(dòng)物的孳生時(shí)期，在應(yīng)激因素影響下可能引起地方性流行[10]。本研究結(jié)果顯示，夏季是該病感染的高發(fā)期，顯著高于其他季節(jié)（P＜0.05），其次為秋季。雖然夏季發(fā)病率最高，但與其他季節(jié)無(wú)差異顯著性（P＞0.05）。夏季氣溫高，多雨潮濕，圈舍環(huán)境易滋生蜱、螨等吸血節(jié)肢動(dòng)物，奶牛感染嗜血支原體與體外寄生蟲密切相關(guān)。因此，建議在每年夏季來(lái)臨前、夏季感染高峰期間和初秋3 個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)集中進(jìn)行藥物防治和衛(wèi)生消毒。本研究發(fā)現(xiàn)感染嗜血支原體的奶牛陽(yáng)性率高，而發(fā)病率相對(duì)偏低，表明嗜血支原體致病力較弱，這與彭海生等[11]研究一致。

垂直傳播是奶牛嗜血支原體感染途徑之一。本研究中30 頭妊娠母牛均感染嗜血支原體，發(fā)病率13.33%，經(jīng)過(guò)分娩，30 頭新生犢牛血液懸滴壓片法的檢測(cè)陽(yáng)性率為83.33%、PCR法的陽(yáng)性率為73.33%，表明無(wú)論發(fā)病或隱性感染，妊娠奶牛都可通過(guò)垂直傳播感染新生犢牛。這與李玉文等[12]、李子平等[13]和閆振貴等[14]報(bào)道一致。

4 小結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)的血液鏡檢方法中，血液懸滴壓片法準(zhǔn)確度最接近PCR法，可用于奶牛嗜血支原體的臨床確診。采用這兩種方法檢測(cè)香河縣奶牛感染嗜血支原體情況，結(jié)果顯示奶牛感染率偏高而發(fā)病率低，夏季多發(fā)，泌乳牛感染率和發(fā)病率顯著高于犢牛和青年牛。建議根據(jù)該病流行特點(diǎn)，加強(qiáng)疫病凈化，減少傳播風(fēng)險(xiǎn)。