盧柏林,馬恩耀,2,周勁松,2,孫心恒,謝珊珊
(1.廣東漢潮中藥科技有限公司,廣東 廣州 510360;2.廣州采芝林藥業(yè)有限公司,廣東 廣州 510360)
益母草屬于唇形科植物,具有活血消腫、調(diào)經(jīng)利尿、清熱解毒等多種功效,常作為治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、惡露不盡、水腫尿少和瘡瘍腫毒等癥狀的主治藥物[1]。益母草中的主要化學(xué)成分包括生物堿類、環(huán)烯醚萜類、二萜類、苯丙醇苷類、黃酮類和香豆素類等,同時(shí)含有鐵、錳、鋅、鉛等多種微量元素。生物堿類中的益母草堿及鹽酸水蘇堿屬于益母草的重要活性成分[2-3],因此是益母草質(zhì)量控制重點(diǎn)關(guān)注的成分。
在2020 年版《中國(guó)藥典》中,首次在通則0512“高效液相色譜法”的高效液相色譜儀檢測(cè)器中補(bǔ)充了電霧式檢測(cè)器(Charged Aerosol Detector,CAD)。CAD 是基于霧化-氣溶膠的檢測(cè)器,其檢測(cè)原理是將液相洗脫液霧化蒸發(fā)后檢測(cè)溶質(zhì)顆粒的帶電粒子的信號(hào)流,具有靈敏度高、重復(fù)性好、不依賴于化學(xué)結(jié)構(gòu)信號(hào)響應(yīng)一致性、動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍寬、操作直觀簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn),適用于分析各種不揮發(fā)或半揮發(fā)性化合物[4]。中藥中含有大量糖類及苷類等紫外吸收弱的成分,因此電霧式檢測(cè)器在中藥分析研究中應(yīng)用越來越廣泛[5-8]。
蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(Evaporative Light Scattering Detector,ELSD)屬于通用型檢測(cè)器,是擴(kuò)充高效液相色譜檢測(cè)范圍的重要檢測(cè)器之一。因此,對(duì)于類似益母草中鹽酸水蘇堿等無紫外吸收成分的含量測(cè)定,現(xiàn)多采用高效液相色譜儀(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)搭配ELSD 檢測(cè)器的方法進(jìn)行檢測(cè)。但ELSD 檢測(cè)器本身存在線性范圍較窄、基線噪音偏大、影響因素較多等缺點(diǎn)。在《中國(guó)藥典》益母草項(xiàng)下鹽酸水蘇堿的測(cè)定方法中,供試品中鹽酸水蘇堿目標(biāo)峰前容易有干擾峰,分離度較差,需要在要求范圍內(nèi)更改流動(dòng)相比例或柱溫、流速等才能把目標(biāo)峰與干擾峰分離,從而達(dá)到準(zhǔn)確定量的效果,但相對(duì)會(huì)影響效率。因此,本次試驗(yàn)將用CAD 檢測(cè)器代替ELSD 檢測(cè)器對(duì)益母草中鹽酸水蘇堿進(jìn)行測(cè)定,以準(zhǔn)確定量和提高效率。
益母草,購(gòu)于市場(chǎng)。
鹽酸水蘇堿對(duì)照品(批號(hào):110712-201916),中國(guó)食品藥品檢定研究院;甲醇(色譜純),CNW;冰醋酸(AR)、乙醇(AR),天津市大茂化學(xué)試劑廠;水為超純水。
Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀(配備Corona Veo RS CAD 檢測(cè)器),Chromeleon 7.0 色譜工作站,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;水浴鍋,常州國(guó)宇。
1.3.1 色譜條件
色譜柱:Welch Ultimate XB-Diol(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇∶0.2%冰醋酸=80 ∶20;流速:1.0 mL·min-1;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。CAD 檢測(cè)器條件:霧化溫度為40 ℃,數(shù)據(jù)采集頻率為20 Hz,過濾常數(shù)為1.0 s。
1.3.2 對(duì)照溶液的制備
取鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量,在精密稱定后加入70%乙醇溶液配制成濃度為0.5 mg·mL-1的溶液。
1.3.3 供試品溶液的制備
將益母草磨成粉過三號(hào)篩,稱取粉末約1.0 g,在精密稱定后置于具塞錐形瓶中,在精密加入25 mL 的70%乙醇溶液后,稱定重量,水浴加熱回流2 h,放冷后再稱定重量,用70%乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量,搖勻后過濾,棄去初濾液,取續(xù)濾液,即得。
1.3.4 樣品的測(cè)定
取不同產(chǎn)地批次的益母草,按1.3.3 項(xiàng)下方法操作,按1.3.1色譜條件測(cè)定,同時(shí)也按照2020年版《中國(guó)藥典》一部中益母草項(xiàng)下的鹽酸水蘇堿測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定,并計(jì)算鹽酸水蘇堿的含量,將兩者結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。
2.1.1 檢測(cè)器的選擇
在《中國(guó)藥典》及多個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)中,益母草中鹽酸水蘇堿的測(cè)定方法多選擇高效液相色譜儀搭配蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。由于蒸發(fā)光散射檢測(cè)器本身的特殊性,往往在實(shí)際操作當(dāng)中需要提前開啟蒸發(fā)光穩(wěn)定較長(zhǎng)的時(shí)間,而且基線噪音的影響比較明顯。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇同為通用檢測(cè)器的電霧式檢測(cè)器代替蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)鹽酸水蘇堿進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定結(jié)果與HPLC-ELSD 法基本一致。
2.1.2 流動(dòng)相的選擇
在《中國(guó)藥典》中,益母草中鹽酸水蘇堿的測(cè)定方法為HPLC-ELSD,流動(dòng)相為乙腈-0.2%冰醋酸;當(dāng)把相同的流動(dòng)相用于HPLC-CAD 時(shí)發(fā)現(xiàn),能把供試品中的干擾峰分離,但分離度只能達(dá)到1.04 左右。本實(shí)驗(yàn)將流動(dòng)相改為甲醇-0.2%冰醋酸,供試品中的干擾峰會(huì)被提前洗脫,鹽酸水蘇堿目標(biāo)峰前后均沒有影響結(jié)果的干擾峰,并且檢測(cè)結(jié)果與HPLC-ELSD 基本一致[9-10]。這說明,以甲醇-0.2%冰醋酸為流動(dòng)相,利用電霧式檢測(cè)器檢測(cè)鹽酸水蘇堿效果較好。
按優(yōu)化后的1.3.1 色譜條件測(cè)定對(duì)照品溶液和供試品溶液,可看出供試品中其他成分對(duì)鹽酸水蘇堿目標(biāo)峰無干擾。鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液、益母草供試品溶液色譜圖見圖1。
圖1 益母草HPLC-CAD 色譜圖
2.3.1 線性和范圍
將1.3.2 對(duì)照溶液(實(shí)際濃度為0.501 mg·mL-1)依次進(jìn)樣1 μL、2 μL、3 μL、6 μL、8 μL 和10 μL 測(cè)定各成分的峰面積,以進(jìn)樣量(μg)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)(x),以峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)(y),進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明,鹽酸水蘇堿在0.50~5.01 μg 線性良好,回歸方程為y=5.631 2x-0.276 2,r=0.999 5。
2.3.2 精密度
精密吸取對(duì)照品溶液,進(jìn)樣6 μL,按1.3.1 色譜條件測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6 次,結(jié)果見表1。鹽酸水蘇堿峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative Standard Deviation,RSD)為0.33%,表明儀器精密度滿足要求。
表1 鹽酸水蘇堿精密度測(cè)定結(jié)果表
2.3.3 重復(fù)性
精密稱取同一批益母草粉末(過三號(hào)篩)6 份(每份約1 g),按1.3.3 項(xiàng)下方法操作,制成供試品溶液,按1.3.1 色譜條件測(cè)定,結(jié)果見表2。樣品鹽酸水蘇堿含量的RSD 是0.69%,表明本法重復(fù)性良好。
表2 鹽酸水蘇堿重復(fù)性測(cè)定結(jié)果表
2.3.4 準(zhǔn)確性
精密稱取已知含量的同一批益母草粉末(過三號(hào)篩)6 份(每份約1 g),每份加入鹽酸水蘇堿4.008 mg,按1.3.3 項(xiàng)下方法操作,按1.3.1 色譜條件測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表3。鹽酸水蘇堿的平均回收率是100.28%,RSD 為1.43%,表明本法準(zhǔn)確性良好。
表3 鹽酸水蘇堿準(zhǔn)確性測(cè)定結(jié)果表
2.3.5 穩(wěn)定性
對(duì)同一供試品溶液,分別于0 h、3 h、6 h、12 h、18 h 和24 h 的6 個(gè)時(shí)間點(diǎn),按1.3.1 色譜條件測(cè)定,測(cè)定結(jié)果見表4。鹽酸水蘇堿峰面積的RSD 為0.58%,可表明益母草供試品溶液中鹽酸水蘇堿成分能在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。
表4 穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表
對(duì)6 批次益母草樣品中鹽酸水蘇堿含量進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表5。結(jié)果顯示,各批益母草的CAD 法結(jié)果與ESLD 法結(jié)果的相對(duì)平均偏差為0%~1.08%,表明采用CAD 法結(jié)果與ESLD 法結(jié)果基本一致。另對(duì)6 批次的CAD 法與ELSD 法2 組結(jié)果使用SPSS 22 進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),結(jié)果顯示Levene 統(tǒng)計(jì)量為1.509,顯著性P值為0.247 >0.05,故方差齊性;兩組間獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量t=-0.276,P值為0.065 >0.01,表明CAD 法結(jié)果與ESLD 法結(jié)果不存在差異。
表5 含量測(cè)定結(jié)果表
近年來,電霧式檢測(cè)器作為一種新型通用型檢測(cè)器在中藥分析領(lǐng)域表現(xiàn)出了廣泛的適用性,尤其適用于皂苷、糖類和生物堿類等無紫外吸收或弱紫外吸收成分的分析與檢測(cè)[11]。雖然電霧式檢測(cè)器與紫外檢測(cè)器、蒸發(fā)光檢測(cè)器等檢測(cè)器相比具有較大的優(yōu)勢(shì),但其缺點(diǎn)也同樣明顯,如待測(cè)物需先經(jīng)干燥,故難以檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì);該監(jiān)測(cè)器基于氣溶膠方法獲得的濃度和峰面積均為非線性關(guān)系,在實(shí)際計(jì)算中不如紫外檢測(cè)器簡(jiǎn)單方便,在識(shí)別某個(gè)峰或進(jìn)行峰純度分析時(shí)也不能像質(zhì)譜探測(cè)器能深度探索[12]。但在實(shí)際使用當(dāng)中可以看出,電霧式檢測(cè)器已逐漸成為目前檢測(cè)器分析中的重要補(bǔ)充,對(duì)提高準(zhǔn)確度、擴(kuò)大檢測(cè)范圍起到重要的作用。本文采用高效液相色譜儀搭配電霧式檢測(cè)器法檢測(cè)益母草中鹽酸水蘇堿含量,具有方法重復(fù)性良好、準(zhǔn)確度較高、靈敏度較高、操作簡(jiǎn)單便捷等優(yōu)點(diǎn),可用于對(duì)益母草的質(zhì)量控制。接下來,可繼續(xù)探究本方法對(duì)于其他物質(zhì)的適用性,并因?yàn)橥ㄓ眯詸z測(cè)器的特性,可以將其延伸至對(duì)多種類型的化合物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。