張文靜，王雨辰，段 瑤，顧晶業(yè)，律廣富，皮子鳳，林 喆

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）屬于一種全身性骨代謝疾病，發(fā)病過程中，骨穩(wěn)態(tài)平衡遭到破壞，引致骨骼承重能力減弱，加大脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)[1]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一種重要的亞型，尤其發(fā)生于絕經(jīng)后婦女。其主要病因是由于卵巢功能下降和雌激素分泌減少而導(dǎo)致的骨組織結(jié)構(gòu)改變，增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。由于發(fā)病隱秘，未能得到充分的重視，嚴(yán)重降低了絕經(jīng)后女性的身體水平。據(jù)預(yù)測(cè)，由于骨質(zhì)疏松癥引發(fā)的骨折問題，醫(yī)療費(fèi)用在2050 年可能將高達(dá)1 630 億元[4]。

藤黃健骨丸[5]來源于國(guó)醫(yī)大師劉柏齡多年臨床經(jīng)驗(yàn)所制成的中藥復(fù)方制劑。全方配伍由7 味中藥材組成，熟地黃為君藥，臣藥用肉蓯蓉、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、鹿銜草，具有補(bǔ)腎陽、增強(qiáng)精血、滋養(yǎng)腎臟、祛除風(fēng)濕、增強(qiáng)筋骨等功能。加以雞血藤，能補(bǔ)血、活血，調(diào)通人體經(jīng)絡(luò)，增強(qiáng)筋骨。萊菔子，可以幫助調(diào)理氣血，使得所有的藥材能更好的發(fā)揮效用，這款中藥復(fù)方被廣泛用于治療各種骨科疾病。

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是骨組織中重要的生長(zhǎng)因子。研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2 在骨形成中發(fā)揮著重要作用[6-7]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2）BMP-2/Smad 通路是能夠維持骨穩(wěn)態(tài)的重要信號(hào)通路，當(dāng)Smad 信號(hào)被激活時(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，減少破骨細(xì)胞活性，從而減少骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[8-10]。但藤黃健骨丸通過BMP-2/Smad 信號(hào)通路治療骨質(zhì)疏松癥缺乏深入研究。

因此，本實(shí)驗(yàn)研究采用摘除大鼠雙側(cè)卵巢模型模擬臨床絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，考察藤黃健骨丸對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的影響，并基于BMP-2/Smad 信號(hào)通路探究其分子機(jī)制，為該藥的深入研究提供新依據(jù)，為臨床應(yīng)用提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥品與試劑 藤黃健骨丸（批號(hào)：2022100522039，長(zhǎng)春人民藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；仙靈骨葆膠囊[批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z20025337，國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂（貴州）制藥有限公司]；戊巴比妥鈉（批號(hào)：86-01-22，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠）；青霉素（批號(hào)：210202，獸藥字，華北制藥集團(tuán)動(dòng)物保健品有限責(zé)任公司）；無水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、二甲苯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、Von-Kossa 染液套裝（B1013，百仟度）、鹽酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、氨水（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、中性樹膠（10004160，武漢百仟度生物科技有限公司）、分化液（B1005-3，百仟度）、返藍(lán)液（B1005-4，百仟度）。RIPA 裂解緩沖液（P0013B，碧云天生物技術(shù)有限公司）；Smad1 抗體，BMP-2 抗體、Runx2 抗體、抗鼠抗體、抗兔抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1.5 月齡雌性SD 大鼠72 只，體質(zhì)量（200±10）g。所有大鼠均購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 屏障級(jí)動(dòng)物室內(nèi)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測(cè)定儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司），脫水機(jī)（JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司），包埋機(jī)（JB-P5，武漢俊杰電子有限公司），病理切片機(jī)（RM2016，上海徠卡儀器有限公司），正置光學(xué)顯微鏡（NIKON ECLIPSE C，尼康，日本），成像系統(tǒng)（NIKON DS-U3，尼康，日本），多功能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（uvitec，17200497，法國(guó)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)造模方法 除了假手術(shù)組，其余各組大鼠以0.5% 戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠被安置在手術(shù)臺(tái)上，使其四肢固定，接著進(jìn)行皮膚的預(yù)處理，對(duì)手術(shù)區(qū)的皮膚進(jìn)行消毒。在大鼠背部中線位置，作一1.5 ～2 cm 的縱形切口，可見到奶白色的組織以及粉紅色的“菜花狀”卵巢，隨后采用分離鉗進(jìn)行夾緊，進(jìn)行卵巢的結(jié)扎以及切除，然后逐層對(duì)皮膚進(jìn)行縫合并消毒。假手術(shù)組大鼠切除等同于卵巢重量的周圍脂肪。大鼠術(shù)后給予口服青霉素混懸液，術(shù)后注意保溫[11-12]。

2.2 動(dòng)物分組及給藥 將大鼠隨機(jī)分為6 組，每組12只。分別為假手術(shù)組（SHAM）、模型組（OVX）、仙靈骨葆膠囊組（XLGB）、藤黃健骨丸低劑量組（THJGW-L）、藤黃健骨丸中劑量組（THJGW-M）及藤黃健骨丸高劑量組（THJGW-H）。

從造模手術(shù)后第3 天開始，按照人與大鼠表面積換算藥物等效劑量，藤黃健骨丸粉末進(jìn)行用水溶解制成混懸液灌胃，低、中、高劑量組給藥劑量分別為0.15 g/kg/d、0.3 g /kg/d、0.6 g /kg/d；假手術(shù)組和模型組大鼠以等體積生理鹽水灌胃；仙靈骨葆膠囊和藤黃健骨丸均為復(fù)方中藥，因其在臨床上已經(jīng)被廣泛用于治療骨質(zhì)疏松癥，且治療有效、安全[13-15]。陽性組采用其水溶液灌胃給藥，給藥劑量為0.10 g/kg/d。每日灌胃1 次，連續(xù)8 周。每周稱量記錄1 次大鼠體質(zhì)量。

2.3 取材 8 周后，麻醉安樂死處理，在無菌的環(huán)境中提取大鼠的子宮和腎臟，并量取其重量。切割大鼠雙側(cè)的股骨并剝離肌肉，之后測(cè)量大鼠右側(cè)股骨的骨骼強(qiáng)度。對(duì)大鼠左側(cè)股骨，用4%多聚甲醛固定24 h以上，常規(guī)石蠟包埋切片，進(jìn)行病理染色分析。

2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot） 取大約80 mg的大鼠骨髓組織，經(jīng)液氮冷凍后進(jìn)行研磨處理。按照骨組織蛋白提取試劑盒的使用指南，提取蛋白，并運(yùn)用BCA 方法測(cè)量蛋白質(zhì)的含量。蛋白上樣量為20 μg，進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜1 h 后，用奶粉封閉2 h。封閉結(jié)束后使用TBST緩沖液進(jìn)行3 次洗膜。加入GAPDH（1:5 000），BMP-2（1:2 000），Smad1（1:2 000），Runx2（1:1 000）一抗，4℃孵育過夜，加入二抗（1:3 000）室溫孵育3 h，再用TBST 緩沖液清洗3 次。顯色，以GAPDH 作為內(nèi)參，使用Image-J 軟件對(duì)所有電泳條帶的灰度值進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，并將所有的結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。利用單因素方差分析組內(nèi)數(shù)據(jù)差異。確定統(tǒng)計(jì)顯著性的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為P＜0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠模型體質(zhì)量變化 大鼠術(shù)后的體質(zhì)量變化，如圖1。對(duì)大鼠進(jìn)行去卵巢手術(shù)后，大鼠體質(zhì)量明顯降低，藤黃健骨丸給藥后，體質(zhì)量恢復(fù)至正常。

圖1 各組大鼠8 周體質(zhì)量變化

3.2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠子宮及腎臟指標(biāo) 測(cè)定大鼠的子宮和左右腎重量，結(jié)果見表1。在對(duì)比假手術(shù)組的情況下，模型組的大鼠子宮和腎臟重量顯然減少（P＜0.05），具有顯著性差異；相較于模型組，藤黃健骨丸高劑量組和仙靈骨葆膠囊組都能有效的增強(qiáng)大鼠的腎臟重量，同時(shí)對(duì)子宮重量也展現(xiàn)出提升的趨勢(shì)，然而它們和模型組之間的差別并不顯著（P＞0.05）。

表1 藤黃健骨丸對(duì)模型大鼠子宮和腎臟重量的影響（± s，n = 12） g

表1 藤黃健骨丸對(duì)模型大鼠子宮和腎臟重量的影響（± s，n = 12） g

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 子宮 右腎SHAM 1.15±0.06△ 1.00±0.08△OVX 0.74±0.06## 0.89±0.07##THJGW-L 0.76±0.04 0.96±0.11 THJGW-M 0.87±0.03△ 0.96±0.09 THJGW-H 0.92±0.05△ 0.97±0.12##XLGB 1.04±0.03△ 0.97±0.10##

3.3 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨強(qiáng)度值 將大鼠右側(cè)股骨放入小動(dòng)物骨骼強(qiáng)度測(cè)定儀，依據(jù)骨頭被壓斷的最高負(fù)荷壓力來測(cè)試骨骼的強(qiáng)度，具體的測(cè)量結(jié)果如圖2所示。

圖2 各組大鼠右側(cè)股骨骨強(qiáng)度值

3.4 VonKossa 染色 VonKossa 鈣鹽染色染色結(jié)果可以看出（如圖3），假手術(shù)組可見鈣離子大量沉積，骨組織結(jié)構(gòu)完整，骨小梁排列規(guī)律，結(jié)構(gòu)緊密；模型組，可見大量脂肪細(xì)胞，鈣離子沉淀減少，骨髓細(xì)胞數(shù)量大量減少；藤黃健骨丸治療后骨結(jié)構(gòu)有所改善，骨細(xì)胞增多，鈣離子沉積增多，骨細(xì)胞增多，脂肪細(xì)胞減少。

圖3 各組大鼠左側(cè)股骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)（VonKossa 染色，×200，黑色箭頭-鈣離子沉積；紅色箭頭-脂肪細(xì)胞；黃色箭頭-骨細(xì)胞）

3.5 Western Blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組Runx2、BMP-2 及Smad1 蛋白表達(dá)顯著降（△P＜0.05，△△P＜0.01），表明去卵巢手術(shù)可以顯著降低骨組織中Runx2、BMP-2 及Smad1 的蛋白含量；與模型組比較，藤黃健骨丸高劑量組和仙靈骨葆膠囊組均明顯上調(diào)Runx2、BMP-2 及Smad1 蛋白的表達(dá)（#P＜0.01，##P＜0.01），藤黃健骨丸可以改善骨丟失，促進(jìn)成骨形成。見表2，如圖4。4 討論

表2 藤黃健骨丸對(duì)模型大鼠骨組織Runx2、Smad1、BMP-2蛋白表達(dá)的影響（± s，n = 3）

表2 藤黃健骨丸對(duì)模型大鼠骨組織Runx2、Smad1、BMP-2蛋白表達(dá)的影響（± s，n = 3）

注：與假手術(shù)組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

組別 Runx2/GAPDH Smad1/GAPDH BMP-2/GAPDH SHAM 0.64±0.11 0.58±0.05 0.76±0.10 OVX 0.31±0.12## 0.32±0.04## 0.32±0.11#THJGW-L 0.36±0.05 0.32±0.10## 0.54±0.03△△THJGW-M 0.56±0.09△△ 0.42±0.01 0.63±0.03 THJGW-H 0.67±0.08△ 0.50±0.06△ 0.72±0.06△XLGB 0.68±0.06△ 0.54±0.03△ 0.78±0.11△

圖4 各組大鼠骨組織中Runx2、Smad1、BMP-2 蛋白表達(dá)電泳

中醫(yī)學(xué)將骨質(zhì)疏松癥歸于“骨痿”“骨極”“骨枯”等范疇[16]?！端貑枴ゐ粽撈方庾x“由腎系主導(dǎo)的骨質(zhì)和髓液，如果腎氣過度增熱，會(huì)引發(fā)腰背部無法保持挺直，使骨質(zhì)干燥，髓液減少，這便構(gòu)成了骨痿的病象”。與此同時(shí)，《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病》中的描述是：“過量攝入咸味食物會(huì)對(duì)骨質(zhì)構(gòu)成破壞，骨質(zhì)的損害之后會(huì)產(chǎn)生肌無力，這個(gè)病狀被稱作枯病?！薄端貑枴の宀厣伞氛撌觯骸澳I具有調(diào)節(jié)骨髓生成的能力，腎中的精力充沛時(shí)，骨髓就能正常生化，骨骼也會(huì)變得強(qiáng)壯。但是，若腎氣消耗過大，骨髓就會(huì)失去補(bǔ)充?！币虼耍^經(jīng)后骨質(zhì)疏松與骨痿等骨疾病的病因和病理有許多相似之處。中醫(yī)認(rèn)為，該病病變?cè)诠?，其本在腎。腎是維護(hù)骨髓生長(zhǎng)和骨質(zhì)健康的關(guān)鍵器官，只有髓液充盈，骨骼才能保持健康。同樣的，腎也是身體的精力儲(chǔ)備，只有充足的精力，才能使髓液滋潤(rùn)骨骼，幫助骨骼得到營(yíng)養(yǎng)。

目前臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物[17-19]主要有幾大類，分別是雌激素和選擇性雌激素受體調(diào)整劑、雷洛昔芬、雙膦酸鹽以及地諾單抗等。雌激素主要包括雌二醇和雌酮，在女性進(jìn)入更年期以后，雌激素的產(chǎn)生能力會(huì)開始下降，這時(shí)候患者的骨密度也會(huì)明顯降低。根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，雌激素治療顯著減少骨折的發(fā)生率[20]，因此它展現(xiàn)了治療骨質(zhì)疏松的效果。經(jīng)過隨機(jī)實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)驗(yàn)證口服或者靜脈注射雙膦酸鹽可以降低骨折的概率[21-23]。但是會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐，甚至腎功能損害等不良反應(yīng)[24]。地諾單抗是第一種獲得許可，專門用于治療骨質(zhì)疏松癥的生物藥。它和雙膦酸鹽不同，其對(duì)腎機(jī)功能降低的女性更為合適。另一方面，特立帕肽是通過人工合成的重組人甲狀旁腺激素氨基酸末端1-34 活性片段，其主力作用是促進(jìn)骨質(zhì)生成，然而可能導(dǎo)致出現(xiàn)肌骨系統(tǒng)損傷、代謝和營(yíng)養(yǎng)問題以及皮膚和皮膚附件損壞等副作用[25]?；钚跃S他命D 目前在臨床上是治療骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)藥物。它不僅能減少更年期和老年骨質(zhì)疏松癥的骨折風(fēng)險(xiǎn)，也對(duì)類固醇性骨質(zhì)疏松病有療效[26]。

西醫(yī)治療骨質(zhì)疏松癥多數(shù)會(huì)引發(fā)其他疾病，中藥資源豐富，藥效安全。在治療骨質(zhì)疏松的過程中，中醫(yī)學(xué)常針對(duì)其病源和病理進(jìn)行調(diào)整和改善，主要是通過益肝和補(bǔ)腎，以及配合活血藥用于治療由血液瘀積引發(fā)的疼痛。藤黃健骨丸是一種中成藥，其主要成分包括熟地黃、鹿銜草、骨碎補(bǔ)（燙）、肉蓯蓉、淫羊藿、雞血藤等。肉蓯蓉可以溫補(bǔ)腎陽，通經(jīng)絡(luò)，強(qiáng)筋骨；而熟地黃有助于益精填髓，活化血液，消除瘀血；萊菔子可以調(diào)節(jié)氣血和健骨，同時(shí)也防止滋膩過度；雞血藤有如活血行氣、滋陰養(yǎng)腎的效果；淫羊藿能去除風(fēng)濕，補(bǔ)肝和腎；骨碎補(bǔ)有益于腎陽，健骨，緩解疼痛。復(fù)方涵蓋7 種藥材，其中6 種都是歸類于腎經(jīng)。根據(jù)中醫(yī)學(xué)的觀念，“腎主骨生髓”，這些藥材可以共同發(fā)揮效力，從根本上幫助治療骨質(zhì)疏松等骨科疾病。除了能夠以腎虛血瘀為原理來緩解四肢疼痛和抑制骨頭的吸收，還可以增進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)骨頭的重塑，減少破骨細(xì)胞的活性，提高血中鈣的含量。此外，它還可以降低血液的黏稠度，阻止血小板的集結(jié)，提升骨質(zhì)密度[27]。

據(jù)研究顯示，張林等[28]所研究的對(duì)于藤黃健骨膠囊治療骨質(zhì)疏松癥（腎虛血瘀型）的療效評(píng)價(jià)，指出此藥物能有效緩解病患的病癥，推動(dòng)骨密度和骨質(zhì)的新陳代謝，因此，病患的生活品質(zhì)大幅提升，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。另外，單梅花等[29]亦在以藤黃健骨膠囊對(duì)64 位高齡、患有腎虛血瘀型骨質(zhì)疏松癥的病患進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)該藥品的顯著治療效果，能大幅減緩病患的病癥。

本實(shí)驗(yàn)采用的去除卵巢方法來建立的骨質(zhì)疏松模型是目前最廣泛被用來模擬女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型[30]。通過這個(gè)模型，進(jìn)行大鼠雙側(cè)卵巢切除手術(shù)，使其體內(nèi)雌激素含量降低，骨質(zhì)代謝速度加快，骨密度大幅度減少，有效地呈現(xiàn)出女性絕經(jīng)后由于雌激素水平下滑，骨密度降低，骨骼生長(zhǎng)與吸收不平衡所產(chǎn)生的骨質(zhì)疏松病癥[31]。本研究結(jié)果表明，去卵巢手術(shù)可顯著降低大鼠體質(zhì)量、子宮重量及腎臟質(zhì)量。藤黃健骨丸干預(yù)后，能明顯增加大鼠的子宮和腎臟重量。提示藤黃健骨丸從腎源出發(fā)，強(qiáng)腎生髓，改善骨質(zhì)疏松癥。骨強(qiáng)度表明藤黃健骨丸能夠顯著提升去卵巢大鼠的股骨強(qiáng)度，提高荷載能力，對(duì)骨質(zhì)疏松有較好的治療作用。VonKossa 染色提示藤黃健骨丸可以明顯改善去卵巢大鼠的病理形態(tài)，增加骨中鈣離子的沉積，減少脂肪細(xì)胞的生成，改善骨小梁結(jié)構(gòu)。

BMP-2/Smad 信號(hào)通路影響成骨分化，對(duì)骨穩(wěn)態(tài)的平衡起到關(guān)鍵作用的信號(hào)通路[32]。BMP-2 可以與細(xì)胞膜受體結(jié)合，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Runx2 的蛋白表達(dá)，促進(jìn)成骨的分化[33]。Runx2能夠影響骨髓細(xì)胞的分化過程，對(duì)骨的生成扮演重大角色。本次研究表明，相較于假手術(shù)組，模型組大鼠的Runx2 、BMP-2 和Smad1 等蛋白水平降低；當(dāng)藤黃健骨丸以不同劑量治療后，與模型組對(duì)比，這些對(duì)骨生成有影響的蛋白水平在不同程度上升高，這揭示了藤黃健骨丸可通過調(diào)控和骨生成相關(guān)的蛋白來影響絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，其作用機(jī)制可能通過BMP-2/Smad 信號(hào)通路來促進(jìn)骨生成。

5 結(jié)論

藤黃健骨丸具有補(bǔ)充腎精、活化骨髓的功效，對(duì)疾病的治療從根本上出發(fā)，使其在臨床應(yīng)用中更加安全、健康。其研究成果也為藤黃健骨丸在臨床上治療骨質(zhì)疏松提供了新的理論支持和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。