邱瑾麗 , 康靜靜 , 郭增輝 , 李紅嬌 , 王 喆

(1. 河南省抗球蟲(chóng)藥物工程技術(shù)研究中心 , 河南 鄭州 450001 ; 2. 鄭州福源動(dòng)物藥業(yè)有限公司 , 河南 鄭州 450001 ;3. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院 , 河南 鄭州 450046)

近年來(lái)隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,雞呼吸道疾病發(fā)病率呈上升趨勢(shì),尤以病原復(fù)雜、病程長(zhǎng)和易反復(fù)為特點(diǎn),嚴(yán)重影響?zhàn)B殖效益,其中由傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)引起的急性高度接觸性雞傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis, IB)在生產(chǎn)中較為常見(jiàn),各年齡段的雞只均可感染(4周齡以內(nèi)的雞發(fā)病嚴(yán)重),對(duì)其生產(chǎn)性能影響極大。柴黃口服液由柴胡和黃芩兩味藥材組成,最早出自《傷寒論》,收載于《中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)》一部,功能為清熱解表,用于風(fēng)熱感冒,證見(jiàn)發(fā)熱、周身不適、頭痛、目眩和咽喉腫痛。柴黃制劑在人醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛,對(duì)小兒上呼吸道感染發(fā)熱和反復(fù)呼吸道感染療效顯著[1,2];獸醫(yī)臨床上主要用于預(yù)防高溫和高濕引起的家禽發(fā)熱、精神不振和食少[3]。國(guó)內(nèi)有報(bào)道顯示,柴黃顆粒對(duì)人工感染雞IB有較好的防治效果[4],但柴黃口服液作為成藥直接應(yīng)用于防治IB的研究相對(duì)較少。本試驗(yàn)通過(guò)在臨床常規(guī)治療基礎(chǔ)上使用柴黃口服液,評(píng)價(jià)柴黃口服液對(duì)IB的治療效果,旨在為擴(kuò)展其臨床應(yīng)用范圍提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和主要試劑 柴黃口服液(500 mL/瓶,產(chǎn)品批號(hào):202004001)和20%氟苯尼考粉(產(chǎn)品批號(hào):202002002),均購(gòu)自鄭州福源動(dòng)物藥業(yè)有限公司。ExTaq?DNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄聚合酶,均購(gòu)自TaKaRa Bio Inc.;核酸提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;甲醛,購(gòu)自西隴科學(xué)有限公司;無(wú)水乙醇和二甲苯,均購(gòu)自天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;石蠟,購(gòu)自德國(guó)徠卡公司;高碘酸,購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;堿性品紅,購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑總廠試劑三廠;偏重亞硫酸鈉,購(gòu)自天津市永大化學(xué)試劑有限公司;蘇木精,購(gòu)自鄭州派尼化學(xué)試劑廠;中性樹(shù)膠,購(gòu)自上海華靈康復(fù)器械廠;鹽酸,購(gòu)自煙臺(tái)市雙雙化工有限公司。

1.2 主要儀器 PCR儀ETC811,北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司產(chǎn)品;DYY-12電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc TMXR,美國(guó)伯樂(lè)Bio-Rad產(chǎn)品;輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)RM2245,徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司產(chǎn)品;DHP-500型電熱恒溫培養(yǎng)箱,北京市永光明醫(yī)療儀器廠產(chǎn)品;CS-VI型攤片烤片機(jī)和冷凍臺(tái),孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司產(chǎn)品;生物顯微鏡和數(shù)字化切片掃描系統(tǒng),麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.3 供試動(dòng)物 試驗(yàn)選用河南省鄭州市港區(qū)養(yǎng)殖戶2個(gè)棚共6 000只黑鳳雞,2個(gè)棚雞舍飼養(yǎng)條件一致,均飼喂不含抗菌藥物的全價(jià)日糧,自由飲水,所有雞只均未接種過(guò)IB疫苗。12日齡部分雞只出現(xiàn)輕微呼吸道癥狀,15日齡大群表現(xiàn)出精神不振、甩鼻、咳嗽和張嘴呼吸,個(gè)別雞只鼻腔有黏性分泌物等癥狀。初步懷疑為雞IB,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)確定為雞IBV陽(yáng)性。

1.4 動(dòng)物分組和給藥 將上述陽(yáng)性雞群雞只隨機(jī)分為2個(gè)組:試驗(yàn)組按2.5 mL/L飲水量給予柴黃口服液,按1 g/L飲水量給予20%氟苯尼考粉;對(duì)照組,按1 g/L飲水量給予20%氟苯尼考粉,混飲,每天1次,連用5 d。

1.5 臨床癥狀觀察 每日觀察2個(gè)組雞只的采食、飲水和精神等表現(xiàn),統(tǒng)計(jì)各組的死亡率和平均增重。部分療效考核標(biāo)準(zhǔn)參照參考文獻(xiàn)[5]。

1.6 試驗(yàn)動(dòng)物剖檢和取材 給藥前(14日齡)和給藥后(20日齡),分別隨機(jī)于各組選取10只雞,活體稱重后放血處死進(jìn)行剖檢,并采集主要臟器用于臟器指數(shù)檢測(cè)和病理組織學(xué)觀察。

1.7 臟器指數(shù)檢測(cè) 依次完整取出雞只的肺臟、心臟、肝臟和脾臟,仔細(xì)將臟器周圍的脂肪和結(jié)締組織剔除干凈,并使用濾紙吸干臟器組織表面的血液后稱重,根據(jù)公式(1)計(jì)算各臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(%)=臟器鮮重(g)÷雞只活體重(g)×100%

(1)

1.8 組織病理學(xué)觀察 將采集的雞只的氣管、肺臟、心臟、肝臟、脾臟、腎臟和腸道組織置于10%福爾馬林溶液中固定,根據(jù)組織結(jié)構(gòu)和病變位置,將固定完全的組織進(jìn)行修整,之后沖水、脫水、透明,浸蠟4 h后包埋,切片、攤片和烤片后,進(jìn)行蘇木素-伊紅(Hematoxylin eosin,H.E.)染色,樹(shù)膠封片后,進(jìn)行數(shù)字切片掃描,觀察組織學(xué)病變特點(diǎn)并采集圖片。

1.9 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”方式表示,試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,使用方差分析進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察 給藥前,試驗(yàn)組和對(duì)照組雞只均出現(xiàn)不同程度呼吸道疾病的臨床癥狀,主要表現(xiàn)為眼腫(圖1A)、呼吸困難、啰音、鼻腔有黏液性分泌物(圖1B)、張口呼吸、甩鼻和打噴嚏等。治療5 d后,試驗(yàn)組和對(duì)照組雞只精神狀態(tài)均有不同程度好轉(zhuǎn),呼吸道癥狀均有改善,且試驗(yàn)組雞只的食欲明顯好于對(duì)照組。

圖1 用藥前雞只眼腫(A)和鼻腔黏性分泌物(B)Fig.1 Chickens with swollen eyes(A) and viscous secretions in nasal cavity(B) before administration

如表1所示,2個(gè)組雞只平均始重?zé)o顯著差異(P>0.05),連續(xù)給藥5 d后,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組雞只死亡率降低1.7%,平均末重提高18.47%,平均增重提高37.36%,即平均末重和平均增重極顯著增加(P<0.01)。

表1 柴黃口服液對(duì)雞只生產(chǎn)性能的影響Table 1 Effect of Chaihuang oral liquid on production performance of chickens

2.2 剖檢變化 用藥前,雞只氣管有黏液性滲出物,氣囊壁增厚,表面有滲出物,導(dǎo)致氣囊壁渾濁(圖2A);腎臟腫大,因尿酸鹽沉積表現(xiàn)典型的“花斑腎”(圖2B);肝臟微腫。連續(xù)用藥5 d后,試驗(yàn)組雞只氣管內(nèi)黏液性滲出物減少,氣囊壁表面僅可見(jiàn)少量散在的白色滲出物(圖2C);腎臟仍然腫大,呈現(xiàn)“花斑腎”病理變化(圖2D)。

圖2 用藥前后雞只剖檢病理變化Fig.2 Post-mortem pathological changes in chickens before and after administration A、B:分別為雞只用藥前的氣囊壁和腎臟;C、D:分別為雞只連續(xù)用藥5 d后的氣囊壁和腎臟紅色箭頭:氣囊壁渾濁;藍(lán)色箭頭:“花斑腎”;黃色箭頭:氣囊壁滲出物減少A, B: The air sac wall and kidney of chickens before administration, respectively; C, D: The air sac wall and kidney of chickens after continuous administration for 5 daysRed arrows: Opacity of the air sac wall; Blue arrows: "Spotty kidney"; Yellow arrows: Decrease in exudate of the air sac wall

2.3 臟器指數(shù)的檢測(cè) 由表2可知,給藥前2個(gè)組雞只的各臟器指數(shù)均無(wú)顯著性差異(P>0.05);經(jīng)5 d連續(xù)給藥后,與對(duì)照組相比,試驗(yàn)組雞只的肺臟、肝臟和脾臟指數(shù)略有升高,但差異不顯著(P>0.05)。

表2 柴黃口服液對(duì)雞只臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of Chaihuang oral liquid on organ index of chickens (%,n=10)

2.4 組織病理學(xué)觀察 給藥前,2個(gè)組雞只心臟和肝臟組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯病變;氣管黏膜充血水腫;肺臟組織中支氣管管腔中黏膜上皮脫落且有大量滲出物;腸道組織結(jié)構(gòu)不完整,血管充血;腎臟組織中均可見(jiàn)血管擴(kuò)張充血,腎小管上皮細(xì)胞腫脹變形、壞死脫落。連續(xù)給藥5 d后,2個(gè)組雞只心臟和肝臟與剖檢所見(jiàn)基本一致,未見(jiàn)明顯病理變化,肝臟組織小葉結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常,心臟組織結(jié)構(gòu)完整,心肌纖維排列整齊且致密,均未見(jiàn)明顯異常。試驗(yàn)組雞只氣管管腔結(jié)構(gòu)均完整(圖3A);對(duì)照組黏膜固有層內(nèi)可見(jiàn)血管明顯擴(kuò)張,紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜下層結(jié)締組織間隙增寬,含有淡染水腫液(圖3B)。試驗(yàn)組雞只肺臟組織中肺小葉結(jié)構(gòu)完整、界限清晰,小葉間結(jié)締組織內(nèi)血管擴(kuò)張充血(圖3C);對(duì)照組部分小葉間結(jié)締組織內(nèi)血管擴(kuò)張充血,少部分三級(jí)支氣管黏膜上皮輕微脫落,初級(jí)支氣管中含有少量脫落的黏膜上皮細(xì)胞(圖3D)。試驗(yàn)組雞只腸腔內(nèi)無(wú)異常內(nèi)容物,十二指腸組織結(jié)構(gòu)完整清晰,黏膜上皮細(xì)胞排列整齊,固有層血管未見(jiàn)明顯擴(kuò)張充血(圖3E);對(duì)照組部分黏膜上皮與固有層分離并脫落,固有層內(nèi)血管擴(kuò)張充血,部分區(qū)域可見(jiàn)紅細(xì)胞浸潤(rùn)以及胞漿紅染的異嗜性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3F)。2個(gè)組雞只腎臟部分小葉內(nèi)腎小球萎縮,腎小管上皮細(xì)胞腫脹變性,胞漿內(nèi)充滿顆粒狀物質(zhì)或網(wǎng)狀空泡,部分腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生壞死破裂,腎小管管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落的細(xì)胞和崩解的細(xì)胞碎片(圖3G、3H)。

圖3 給藥后雞只各器官病理組織學(xué)變化(H.E.染色)Fig.3 Histopathological changes in various organs of chickens after administration(H.E. staining)紅色箭頭:血管擴(kuò)張,紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);藍(lán)色箭頭:脫落的黏膜上皮細(xì)胞;黃色箭頭:胞漿紅染的異嗜性粒細(xì)胞浸潤(rùn);粉色箭頭:壞死破裂的腎小管上皮細(xì)胞;綠色箭頭:脫落的細(xì)胞和崩解的細(xì)胞碎片Red arrows: Vascular dilation, infiltration of red blood cells, and lymphocytes; Blue arrows: Shedding mucosal epithelial cells; Yellow arrows: Eosinophilic infiltration in cytoplasm; Pink arrows: Necrotic and ruptured renal tubular epithelial cells; Green arrows: Shedding cells and disintegrated cell fragments

3 討論

中獸醫(yī)認(rèn)為雞IB屬氣血兩燔型風(fēng)溫證。肉雞大多養(yǎng)殖于封閉雞舍中,極易受外邪入侵而致病,并在雞群內(nèi)傳播[6]。感染IB后,熱毒內(nèi)蘊(yùn),引起津液不化、痰涎阻塞,導(dǎo)致咳嗽氣喘、鼻腔有鼻液、氣管有啰音[7]。根據(jù)中醫(yī)辨證施治理論,本證應(yīng)以清熱解表為主。柴胡-黃芩是臨床常用的經(jīng)典藥對(duì),柴胡可疏散退熱、疏肝解郁、清解表里,黃芩可清熱燥濕、瀉火解毒,二者合用清熱疏肝、和解少陽(yáng)、外透內(nèi)清。

近些年有關(guān)柴胡和黃芩藥對(duì)的研究很多,其中有柴胡黃芩有效組分、提取物、作用機(jī)理和藥效評(píng)價(jià)等方面的研究,但是對(duì)于柴黃口服液用于治療自然感染雞IB的研究極少。崔小七[8]研究顯示,柴黃顆粒對(duì)人工感染IB具有防治效果,可使發(fā)病率降低至50%,治愈率最高可達(dá)92%。文英先[9]研究顯示,柴黃顆粒對(duì)雞喉氣管炎的治療總有效率達(dá)98.33%。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,柴黃口服液對(duì)于雞IB具有很好的防治效果,同時(shí)柴黃口服液可以明顯降低雞只的死亡率,具有較好的抗病毒增效效果,這與黃錦標(biāo)等[10]研究的使用柴胡黃芩中西醫(yī)結(jié)合治療流感的結(jié)果一致。

現(xiàn)代研究表明,黃芩和柴胡都具有明顯的抗病毒作用,柴胡的保肝效果較好,配伍使用可使藥對(duì)的抗病毒作用更加明顯,并且增加了保肝的療效。有文獻(xiàn)報(bào)道,柴胡和黃芩配伍對(duì)撲熱息痛所致的小鼠急性肝損傷有較好的保護(hù)作用[11]。柴胡和黃芩不同劑量比例配伍對(duì)大鼠急性酒精性肝損傷模型的多項(xiàng)指標(biāo)均有影響[12]。本試驗(yàn)中,2個(gè)組雞只的心臟和肝臟均未發(fā)生明顯病變,說(shuō)明相較于呼吸系統(tǒng),雞IBV對(duì)肝臟和心臟的損傷較小,而是否與柴胡和黃芩配伍的保肝作用有關(guān),還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)研究確認(rèn)。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示,使用柴黃口服液和氟苯尼考粉聯(lián)用治療IB,不僅對(duì)雞只的氣管、肺臟和腸道的結(jié)構(gòu)完整性具有保護(hù)作用,還可提高雞只的生產(chǎn)性能,提高雞只的平均增重,降低其死亡率,這與何雯娟等[13]的研究結(jié)果一致。中草藥提取物中含有多種天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì),這些物質(zhì)中含有動(dòng)物所需的氨基酸和維生素等,被動(dòng)物機(jī)體吸收后可以補(bǔ)充受損機(jī)體所需,不僅有利于受損組織修復(fù),還可提高機(jī)體整體免疫力,從而在治療原發(fā)疾病的同時(shí)達(dá)到改善禽類生產(chǎn)性能的目的。