金云云 , 劉怡寧 , 吳營(yíng)霞 , 翟路峰 , 高盛果 , 高曉靜 , 田克恭

(1.國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心 , 河南 洛陽(yáng) 471000 ; 2. 普萊柯生物工程股份有限公司 , 河南 洛陽(yáng) 471000)

雞傳染性鼻炎(Infectious coryza,IC)是由副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)引起的一種雞急性呼吸道疾病[1],臨床癥狀主要表現(xiàn)為面部腫脹、流鼻涕和結(jié)膜炎,肉垂可出現(xiàn)明顯腫脹,雞是Apg的自然宿主,各種日齡的雞對(duì)Apg均易感,但幼雞一般不太嚴(yán)重[2]。該病造成較大經(jīng)濟(jì)損失,可導(dǎo)致育成雞生長(zhǎng)不良和產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋明顯下降(10%～40%),當(dāng)Apg與其他病原體混合感染時(shí),情況會(huì)變得復(fù)雜,這些損失將增加到85%并且死亡率相當(dāng)高[2-5]。通常臨床癥狀和產(chǎn)蛋率下降會(huì)在Apg感染20 d內(nèi)消失,但復(fù)雜的病例可能持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月。Page等[6]使用平板凝集試驗(yàn)將Apg分為A、B、C 三個(gè)血清型;Kume等[7]通過(guò)使用硫氰酸鉀處理并經(jīng)超聲裂解的菌體細(xì)胞、戊二醛固定的雞紅細(xì)胞和家兔高免血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)(Hemagglutination inhibitio,HI),將Apg分為A、B、C 三個(gè)血清群,與Page血清型A、B、C相對(duì)應(yīng)[8]。目前認(rèn)為,9種Kume血清型分別為A-1、A-2、A-3、A-4、B-1、C-1、C-2、C-3 和 C-4[8]。很多按照Page方法無(wú)法分型的菌株使用Kume方法很容易進(jìn)行分型[9]。Apg A、B、C型菌株引起的IC在我國(guó)不同地區(qū)均有流行[10],使用良好的滅活疫苗免疫接種是預(yù)防和控制該病的有效措施。Apg A、B、C三個(gè)血清型之間缺乏交叉保護(hù)[11,12],但同一血清型的不同亞型之間存在部分交叉保護(hù)[13],故良好的雞傳染性鼻炎滅活疫苗應(yīng)包含A、B、C三個(gè)血清型菌株,且菌株需要具備良好的免疫原性,才能對(duì)該病起到全面的預(yù)防和保護(hù)作用。

本試驗(yàn)為了篩選免疫原性良好的雞傳染性鼻炎滅活疫苗生產(chǎn)用菌株,通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期分離的A、B、C型Apg不同菌株的致病性和免疫原性進(jìn)行比較分析,選擇毒力較強(qiáng)、免疫原性較好的菌株用于后續(xù)疫苗研發(fā),為開(kāi)發(fā)良好的雞傳染性鼻炎三價(jià)滅活疫苗提供支持。

1 材料與方法

1.1 菌種 11株Apg分離株,由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心分離、鑒定并保存[10],其中A型菌5株(HN2株、HN3株、SD2株、HB1株、HB2株),B型菌3株(HN4株、HN5株、SD4株),C型菌3株(HN1株、SD1株、SD3株)。

1.2 陽(yáng)性血清 標(biāo)準(zhǔn)Apg血清A型菌株CCM6032株(CVCC 269)、血清B型菌株CCM6075株(CVCC 257)、血清C型菌株Modesto株(CVCC 258)陽(yáng)性血清,由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心制備和保存。

1.3 主要試劑 雞肉湯瓊脂平板、雞肉湯培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline,PBS,0.01 mol/L,pH 7.2),由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心制備并檢驗(yàn)合格后備用。

1.4 主要儀器設(shè)備 二氧化碳培養(yǎng)箱(Hera cell 240I),購(gòu)自德國(guó)Thermo公司;臺(tái)式恒溫?fù)u床(EXCELLA E24R),購(gòu)自美國(guó)NBS公司;生物安全柜(Nu-425-400E),購(gòu)自美國(guó)NuAire公司;旋渦混勻器(MS3DS25),購(gòu)自德國(guó)IKA公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF種蛋和SPF白羽肉雞,均購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2014—0002],本試驗(yàn)經(jīng)普萊柯生物工程股份有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后開(kāi)展(批準(zhǔn)號(hào):201402001)。

1.6 毒力試驗(yàn)

1.6.1 Apg對(duì)雞胚的毒力 將分離的11株Apg分別接種于雞肉湯瓊脂平板,置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,挑取典型菌落接種于雞肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)11 h。按照《中華人民共和國(guó)獸藥典》三部附錄的活菌計(jì)數(shù)方法測(cè)定11株Apg菌液的活菌含量,將菌液均進(jìn)行105倍稀釋,卵黃囊接種6～7日齡SPF雞胚各10枚,每胚0.2 mL,置37 ℃繼續(xù)孵化,觀察雞胚30 h內(nèi)死亡情況。

1.6.2 Apg對(duì)雞的致病性 使用1.6.1制備的11株Apg菌液,經(jīng)眶下竇接種12～14周齡SPF雞各5只,0.2 mL/只,接種后連續(xù)觀察7 d,統(tǒng)計(jì)各菌株的發(fā)病比例,出現(xiàn)面部腫脹或流鼻涕任一項(xiàng)癥狀即判為發(fā)病。

1.6.3 最小發(fā)病劑量測(cè)定 根據(jù)1.6.1和1.6.2試驗(yàn)結(jié)果篩選出毒力較強(qiáng)的A型、B型和C型Apg各2株,按照1.6.1方法制備菌液,將菌液均稀釋至活菌數(shù)約為106、105、104和103CFU/mL,分別經(jīng)眶下竇接種12～14周齡SPF雞10只,0.2 mL/只,接種后連續(xù)觀察7 d,統(tǒng)計(jì)各菌株的發(fā)病比例。

1.7 免疫原性試驗(yàn) 根據(jù)1.6毒力試驗(yàn)結(jié)果篩選出毒力較強(qiáng)的A型、B型和C型Apg各2株,按照1.6.1方法制備菌液,8 000 r/min離心10 min,去除上清,用PBS(0.01 mol/L,pH 7.2)重懸菌體沉淀至原體積的1/10,使用硫柳汞溶液滅活后,分別與氫氧化鋁膠佐劑混合制備單價(jià)鋁膠佐劑滅活疫苗(每毫升疫苗含菌數(shù)均為2.0×109CFU),免疫組每種疫苗免疫8～10周齡SPF雞各20只,0.5 mL/只,另設(shè)60只不免疫雞作為對(duì)照組。免疫后28 d,所有免疫組和對(duì)照組雞只采血、分離血清,免疫組分別使用同血清型的2株HI抗原(制備方法參考國(guó)家農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[14])檢測(cè)HI抗體效價(jià)(血清使用雞醛化紅細(xì)胞吸附后檢測(cè),待檢血清起始稀釋度均為1∶5)。

免疫后28 d,對(duì)每個(gè)A型菌單價(jià)滅活苗免疫組和對(duì)照組的各20只雞,分別經(jīng)眶下竇注射2株A型Apg菌液,每株各接種10只雞,0.2 mL/只(最小發(fā)病劑量);B型菌和C型菌單價(jià)滅活苗免疫組和對(duì)照組也分別使用2株B型菌和2株C型菌以同樣方式進(jìn)行攻毒。接種后連續(xù)觀察7 d,統(tǒng)計(jì)各組的發(fā)病比例。比較各菌株的免疫原性和菌株間的交叉保護(hù)性。

1.8 最小抗原含量測(cè)定 根據(jù)1.7免疫原性試驗(yàn)篩選出免疫原性和交叉保護(hù)性較好的A型、B型和C型菌株各1株,按照1.7方法均制備成抗原含量分別為5.0×108、1.0×109、1.5×109和2.0×109CFU/mL的單價(jià)鋁膠佐劑滅活疫苗,免疫組分別免疫8～10周齡SPF雞10只,0.5 mL/只,另設(shè)30只雞不免疫作為對(duì)照組。免疫后28 d,所有免疫組和對(duì)照組雞只采血、分離血清,使用對(duì)應(yīng)疫苗菌株HI抗原分別檢測(cè)HI抗體效價(jià)。

免疫后28 d,對(duì)不同抗原含量的A型菌單價(jià)滅活苗免疫組各10只雞和對(duì)照組10只雞,經(jīng)眶下竇注射A型Apg菌液,0.2 mL/只(最小發(fā)病劑量);不同抗原含量的B型和C型菌單價(jià)滅活苗免疫組和對(duì)照組也分別使用B型菌和C型菌以同樣方式進(jìn)行攻毒。接種后連續(xù)觀察7 d,統(tǒng)計(jì)各組的發(fā)病比例。

2 結(jié)果

2.1 毒力試驗(yàn)

2.1.1 Apg對(duì)雞胚的毒力 經(jīng)測(cè)定,11株Apg攻毒菌液的活菌含量介于1.8×109～2.4×109CFU/mL,每胚實(shí)際接種劑量介于3.6×103～4.8×103CFU,接種后30 h內(nèi)雞胚死亡比例介于7/10～10/10(表1)。結(jié)果表明,11株Apg菌株對(duì)雞胚均具有較強(qiáng)的毒力。

表1 11株副雞禽桿菌的毒力測(cè)定Table 1 Virulence determination of 11 Apg strains

2.1.2 Apg對(duì)雞的致病性 經(jīng)計(jì)算,每只雞實(shí)際接種劑量介于3.6×108～4.8×108CFU。接種菌液后24～72 h試驗(yàn)雞出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀,主要為面部腫脹和流鼻涕;接種后連續(xù)觀察7 d,出現(xiàn)面部腫脹或流鼻涕任一項(xiàng)癥狀即判為發(fā)病,各菌株攻毒雞的發(fā)病比例介于3/5～5/5(表1)。結(jié)果表明,11株Apg菌株對(duì)雞均具有一定的毒力,其中A型HN3株和HB2株,B型HN5株和SD4株,C型HN1株和SD3株毒力較強(qiáng),用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 最小發(fā)病劑量測(cè)定 將Apg A型HN3株和HB2株、B型HN5株和SD4株、C型HN1株和SD3株菌液稀釋至不同活菌數(shù)后進(jìn)行攻毒,結(jié)果見(jiàn)表2,A型HN3株和HB2株的最小發(fā)病劑量分別約為2.0×104和2.5×105CFU;B型HN5株和SD4株的最小發(fā)病劑量分別約為1.8×103和2.2×105CFU;C型HN1株和SD3株的最小發(fā)病劑量分別約為2.1×105和2.3×103CFU。

表2 6株副雞禽桿菌最小發(fā)病劑量測(cè)定Table 2 Minimum pathogenic dose determination of 6 Apg strains

2.2 免疫原性試驗(yàn) 將Apg A型HN3株和HB2株、B型HN5株和SD4株、C型HN1株和SD3株制備成單價(jià)鋁膠佐劑滅活疫苗,免疫SPF雞28 d后,檢測(cè)HI抗體效價(jià),結(jié)果見(jiàn)表3～5,相同血清型之間A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株滅活疫苗免疫后血清,使用同源和異源菌株HI抗原檢測(cè)HI抗體效價(jià)的幾何平均值介于1∶139～1∶970(4.8～7.6 log2×5),陽(yáng)性比例(HI抗體效價(jià)≥1∶10判為陽(yáng)性)介于8/10～10/10;而A型HB2株、B型SD4株和C型HN1株滅活疫苗免疫后血清使用同源和異源菌株HI抗原檢測(cè)HI抗體效價(jià)的幾何平均值介于1∶30～1∶299(2.6～5.9 log2×5),陽(yáng)性比例介于5/10～9/10。

表3 A型副雞禽桿菌不同菌株免疫原性試驗(yàn)血清HI抗體檢測(cè)Table 3 Serum HI antibody determination in immunogenicity test of different Apg strains of serotype A (log2×5)

表4 B型副雞禽桿菌不同菌株免疫原性試驗(yàn)血清HI抗體檢測(cè)Table 4 Serum HI antibody determination in immunogenicity test of different Apg strains of serotype B (log2×5)

表5 C型副雞禽桿菌不同菌株免疫原性試驗(yàn)血清HI抗體檢測(cè)Table 5 Serum HI antibody determination in immunogenicity test of different Apg strains of serotype C (log2×5)

免疫后28 d,各型單價(jià)疫苗免疫組分別使用同血清型不同菌株進(jìn)行攻毒(含至少1個(gè)發(fā)病劑量),攻毒后發(fā)病結(jié)果見(jiàn)表6,相同血清型之間A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株對(duì)同源和異源菌株的攻擊均可產(chǎn)生理想的保護(hù)效果,保護(hù)比例介于8/10～10/10;而A型HB2株、B型SD4株和C型HN1株對(duì)同源菌株的保護(hù)比例分別為9/10、8/10和7/10,對(duì)異源菌株的保護(hù)比例分別只有8/10、7/10和5/10,攻毒保護(hù)結(jié)果與血清HI抗體效價(jià)結(jié)果相關(guān)性較高,HI抗體陽(yáng)性的雞只攻毒后均獲得保護(hù)。因此將毒力較強(qiáng)、免疫原性較好的A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株作為疫苗生產(chǎn)和攻毒用菌株。

表6 副雞禽桿菌不同菌株免疫原性試驗(yàn)攻毒后發(fā)病比例Table 6 Incidence ratio after challenge in immunogenicity test of different Apg strains

2.3 最小抗原含量測(cè)定 將A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株制備成不同抗原含量的單價(jià)滅活疫苗,進(jìn)行免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn),免后28 d血清HI抗體效價(jià)和攻毒后發(fā)病比例見(jiàn)表7和表8。A型HN3株抗原含量不低于5.0×108CFU/mL時(shí),免疫后28 d血清HI抗體效價(jià)幾何平均值介于1∶98～1∶1 114(4.3～7.8 log2×5),陽(yáng)性比例介于8/10～10/10,攻毒后能提供8/10～10/10的保護(hù);B型抗原含量不低于1.0×109CFU/mL時(shí),免疫后28 d血清HI抗體效價(jià)幾何平均值介于1∶184～1∶788(5.2～7.3 log2×5),陽(yáng)性比例介于8/10～10/10,攻毒后能提供8/10～10/10的保護(hù);C型SD3株抗原含量不低于1.5×109CFU/mL時(shí),免疫后28 d血清HI抗體效價(jià)幾何平均值介于1∶139～1∶368(4.8～6.2 log2×5),陽(yáng)性比例介于8/10～10/10,攻毒后能提供8/10～10/10的保護(hù)。因此,疫苗中A型HN3株、B型HN5株和C型SD3株的最小抗原含量分別為5.0×108、1.0×109和1.5×109CFU/mL。

表7 副雞禽桿菌不同菌株最小抗原含量測(cè)定試驗(yàn)血清HI抗體檢測(cè) Table 7 Serum HI antibody determination in minimum antigen content test of different Apg strains (log2×5)

表8 副雞禽桿菌不同菌株最小抗原含量測(cè)定攻毒后發(fā)病比例Table 8 Incidence ratio after challenge in minimum antigen content test of different Apg strains

3 討論

研究表明,不同Apg菌株的致病性存在差異,并通過(guò)田間菌株和參考菌株得到證實(shí)[15,16]。Apg的致病性與多種因素有關(guān),目前研究主要針對(duì)血凝素抗原(Hemagglutination antigen,HA)[2],HA抗原是一種大小為210 kDa的蛋白(HMTp210蛋白),由血凝素、自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和黏附素構(gòu)成的三聚體,具有血凝、細(xì)胞黏附和生物被膜形成活性[17]。針對(duì)HA抗原作為保護(hù)性抗原也開(kāi)展了很多研究,Takagi等[18,19]已證實(shí)一種針對(duì)Page血清A型HA的特異性單克隆抗體具有被動(dòng)保護(hù)作用,并且用該抗體純化的HA抗原也具有保護(hù)性。

Caballero-Garcia等[20]通過(guò)研究包含3種血清型的24株Apg菌株的致病性,選擇各血清型中致病性最強(qiáng)的菌株制備滅活疫苗進(jìn)行同源菌株的攻毒評(píng)價(jià),證實(shí)菌株的免疫原性良好,同時(shí)提出了另一種篩選雞傳染性鼻炎滅活疫苗菌株的方法,即根據(jù)致病性而不僅僅是血清型來(lái)選擇疫苗菌株。

本試驗(yàn)通過(guò)雞胚和雞只的毒力試驗(yàn)對(duì)分離的5株A型、3株B型和3株C型Apg的毒力進(jìn)行比較,各血清型初步篩選出2株毒力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行最小發(fā)病劑量測(cè)定,從而確定毒力最強(qiáng)的A型、B型和C型Apg菌株并建立各菌株的攻毒模型,用于疫苗效力檢驗(yàn);在此基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)各血清型的2株毒力較強(qiáng)菌株的免疫原性研究發(fā)現(xiàn),毒力最強(qiáng)菌株制備的滅活疫苗免疫后不僅能夠抵抗同源菌株的攻擊,對(duì)同血清型異源菌株也能提供良好的保護(hù),說(shuō)明毒力更強(qiáng)的菌株其免疫原性和交叉保護(hù)性更好,與Caballero-Garcia等[20]的研究結(jié)果一致。

Sawata等[21]研究發(fā)現(xiàn),用HI檢測(cè)免疫雞只的抗體效價(jià)達(dá)到1∶5或更高時(shí),對(duì)攻毒有保護(hù)作用,但疫苗免疫后不刺激機(jī)體產(chǎn)生HI抗體也具有保護(hù)作用[15],說(shuō)明其他抗體在免疫保護(hù)過(guò)程中也具有重要作用。在本試驗(yàn)中對(duì)各菌株滅活疫苗免疫后28 d血清的HI抗體效價(jià)進(jìn)行測(cè)定,與攻毒保護(hù)結(jié)果具有較高的相關(guān)性,毒力更強(qiáng)菌株的滅活疫苗免疫血清使用同源菌株及同血清型異源菌株HI抗原檢測(cè)的HI抗體效價(jià)和陽(yáng)性比例均較高,HI抗體陽(yáng)性的雞只攻毒后均獲得保護(hù),個(gè)別HI抗體陰性的雞只攻毒后也獲得保護(hù),進(jìn)一步印證了上述文獻(xiàn)[21]報(bào)道的結(jié)論,但可能也與Apg HI抗體檢測(cè)方法的靈敏度不高有關(guān)。HI抗體檢測(cè)方法與滅活疫苗免疫攻毒保護(hù)結(jié)果相關(guān)性較好,可以作為疫苗攻毒保護(hù)效力評(píng)價(jià)的替代方法,但該方法所用抗原和雞醛化紅細(xì)胞制備過(guò)程較為繁瑣,在臨床推廣使用較為困難,臨床需要一種操作更簡(jiǎn)便的方法用于疫苗免疫效果評(píng)價(jià)。

綜上所述,為了篩選更好的雞傳染性鼻炎滅活疫苗生產(chǎn)菌株,提升雞傳染性鼻炎滅活疫苗的免疫保護(hù)效果,在疫苗菌株篩選過(guò)程中,可以將菌株致病性作為一項(xiàng)重要指標(biāo),同時(shí)可以結(jié)合HI抗體檢測(cè)方法,使用同血清型的多個(gè)不同菌株HI抗原檢測(cè)候選菌株滅活疫苗免疫后血清的HI抗體效價(jià),選擇能夠產(chǎn)生更高HI抗體及能夠與多個(gè)不同菌株HI抗原反應(yīng)良好的菌株作為疫苗菌株,確保疫苗具備良好和廣譜的免疫保護(hù)效果。