張易安 , 郭琰娜 , 劉 妍 , 劉涵笑 , 沈幸玲 , 劉逸雷 , 唐陸平 , 何永明

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系 , 廣東 佛山 528000)

沙門菌是重要的人獸共患病原體之一。沙門菌病不僅能降低成年動(dòng)物的繁殖力,還會(huì)對(duì)幼齡動(dòng)物的健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害,影響人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展[1,2]。鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium,S.typhimurium)是沙門菌屬目前分離率最高的菌型之一,其感染機(jī)體時(shí),能逃避免疫系統(tǒng)并在體內(nèi)進(jìn)行定殖,最終可引起動(dòng)物的傷寒、腸炎和敗血癥狀。一直以來,藥物在防治鼠傷寒沙門菌病中存有局限性,但中草藥在抑菌方面有著安全性好、有效成分多和靶點(diǎn)多等特點(diǎn),而且中草藥不僅能提高機(jī)體整體免疫力達(dá)到抗菌抗炎的效果,還能降低細(xì)菌耐藥性和節(jié)約治療成本[3],應(yīng)用安全有效的中草藥防治鼠傷寒沙門菌病一直以來受到廣泛關(guān)注。

火炭母(PolygonumchinenseL.,PCL)為常用中草藥之一,常用于治療腸炎、痢疾和肝炎等疾病[4,5]。關(guān)于火炭母對(duì)沙門菌感染機(jī)體腸道的保護(hù)作用和作用機(jī)制,目前鮮見報(bào)道。本試驗(yàn)旨在通過對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠模型進(jìn)行預(yù)防性給藥,結(jié)合組織病理學(xué)檢查和Western blot,檢測(cè)與調(diào)控機(jī)體免疫功能相關(guān)的TLR4-TBK1 信號(hào)通路的相關(guān)蛋白,最終探討火炭母對(duì)小鼠空腸免疫的影響及其可能的作用機(jī)制。本試驗(yàn)結(jié)果可為臨床開發(fā)防治畜禽沙門菌病藥物,提高畜禽生產(chǎn)效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium,ATCC 14028),廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.2 主要藥品和試劑 火炭母(PCL,批號(hào):190501),購(gòu)自北京同仁堂中藥有限公司佛山分公司;慶大霉素(Gentamicin,GM,批號(hào):102328948),購(gòu)自 Sigma 公司;Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)、β干擾素 TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)、TANK結(jié)合激酶1(TANK binds kinase 1,TBK1)、磷酸化TANK結(jié)合激酶1(Phosphonylated TANK binds kinase 1,p-TBK1)、β干擾素(Interferon-β,IFN-β)、干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)、磷酸化干擾素調(diào)節(jié)因子3(Phosphorylated interferon regulatory factor 3,p-IRF3)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1 β)、核因子κB p65(Nuclear factor kappa-B p65,NF-κB p65)和β肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體,(批號(hào)分別為:14358、4596、38066、5483、97450、4302、29047、12912、12242、8242和4970),均購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology 公司;γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)抗體(批號(hào):ab9657),購(gòu)自美國(guó) Abcam公司;增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(Enhanced chemiluminescence,ECL)顯色液(批號(hào):102031748),購(gòu)自 Bio-Rad公司。

1.3 主要儀器 航方分體式煎藥壺,潮州市一壺百飲電氣實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品;Supper 10 FV 超純水儀,Thelab 公司產(chǎn)品;SW-CJ-1 FD 超凈臺(tái),蘇凈安泰公司產(chǎn)品;Tanon-5200 SF,廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司產(chǎn)品;EPS 200 電泳儀和DK-80 電熱恒溫水浴鍋,上海天能科技有限公司產(chǎn)品;DW-86 L 626 超低溫冰箱,Haier 公司產(chǎn)品;SIM-F 140 AY 65-PC 自動(dòng)制冰機(jī),PHcbi 公司產(chǎn)品。

1.4 火炭母口服液的制備及其質(zhì)量控制 將火炭母以藥液比 1∶30 加入超純水,浸泡 0.5 h,煎煮 30 h,收集藥液;重復(fù)煎煮 3 次,合并藥液;紗布過濾,濃縮至 1 g/mL 濃度,置于 4 ℃ 冰箱密封保存。高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)檢測(cè)火炭母主要化學(xué)成分,以建立其質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)所用火炭母口服液的 3 種指示成分質(zhì)量控制:沒食子酸≥0.9 mg/g,綠原酸≥2.5 mg/g,金絲桃苷≥4.7 mg/g。

1.5 試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和給藥 雌性 BALB/c 小鼠,體重 14～16 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào):202106942,廣州)提供,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(粵)2020—0054。小鼠購(gòu)回后適應(yīng)性飼養(yǎng) 1 周,環(huán)境溫度(23±2) ℃,12 h 光/暗循環(huán),自由飲食和飲水。所有動(dòng)物工作均按照中華人民共和國(guó)科技部制定的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理使用指南》(批準(zhǔn)文號(hào):2006-398)進(jìn)行,并經(jīng)佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選擇臨床健康、體重均一的 48 只雌性 BALB/c小鼠,隨機(jī)分為6個(gè)組:空白對(duì)照組(Blank-control,滅菌生理鹽水)、模型組(Model,鼠傷寒沙門菌+滅菌生理鹽水)、陽(yáng)性藥物組[Positive drug,鼠傷寒沙門菌+20 mg/(kg·bw)慶大霉素]、火炭母高劑量組[簡(jiǎn)稱 PCL-H,鼠傷寒沙門菌+16 g/(kg·bw) 火炭母]、火炭母中劑量組[簡(jiǎn)稱 PCL-M,鼠傷寒沙門菌+8 g/(kg·bw)火炭母]和火炭母低劑量組[簡(jiǎn)稱 PCL-L 組,鼠傷寒沙門菌+4 g/(kg·bw)火炭母],每組8只小鼠。試驗(yàn)動(dòng)物灌胃給藥,給藥體積為 0.2 mL/(10 g·bw),連續(xù)給藥 8 d。經(jīng)過 2 d 預(yù)防性給藥后,灌胃 0.2 mL 半數(shù)致死量(Lethal dose 50%,LD50) 鼠傷寒沙門菌(5×104CFU/mL)致病(空白對(duì)照組除外)。染毒后第 6 天,處死小鼠,取空腸用于組織病理學(xué)檢查和 Western blot。

1.6 空腸組織病理學(xué)檢查 將空腸固定于4%多聚甲醛溶液中,石蠟包埋后切片,進(jìn)行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察其組織病理學(xué)變化情況。

1.7 Western blot 取空腸用 RIPA 裂解液勻漿,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)將蛋白分離,隨后電轉(zhuǎn)印跡到 PVDF膜。將目的膜條帶放于 5% 脫脂奶粉中封閉 1 h;然后于 4 ℃下過夜孵育一抗(TLR4、TRIF、TBK1、p-TBK1、IFN-β、IFN-γ、IRF3、p-IRF3、IL-6、IL-1β、NF-κB p65和β-actin);用 TBST 緩沖液洗滌 3 次,每次 15 min;隨后使用二抗孵育 1 h;TBST 緩沖液洗滌 3 次后,用 ECL顯色液處理,采集圖像,進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析 使用 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,定量資料采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示。組間比較采用單因素方差分析,P< 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 火炭母對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸形態(tài)變化的影響 小鼠空腸組織病理學(xué)變化如圖1 所示,空白對(duì)照組小鼠空腸結(jié)構(gòu)完整、清晰;模型組小鼠空腸組織結(jié)構(gòu)之間不緊密,杯狀細(xì)胞增多,腸腺紅細(xì)胞增多。與模型組相比,陽(yáng)性藥物組小鼠空腸出現(xiàn)少量固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn);火炭母各組小鼠空腸杯狀細(xì)胞和腸腺紅細(xì)胞明顯減少。

圖1 火炭母對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸形態(tài)變化的影響(H.E.染色,400×)Fig.1 Effects of Polygonum chinense L. on jejunum morphology in mice infected with S.typhimurium (H.E.staining,400×)A:空白對(duì)照組; B:模型組; C:陽(yáng)性藥物組; D:火炭母高劑量組; E:火炭母中劑量組; F:火炭母低劑量組藍(lán)色箭頭:杯狀細(xì)胞; 紅色箭頭:腸腺紅細(xì)胞; 黃色箭頭:固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn); 綠色箭頭:細(xì)胞變性,呈網(wǎng)孔狀A(yù):Blank control group; B:Model group; C:Positive drug group; D:PCL-H group; E:PCL-M group; F:PCL-L groupBlue arrow:Goblet cells; Red arrow:Intestinal glandular erythrocytes; Yellow arrow:Lamina propria inflammatory cell infiltration;Green arrow:Cell degeneration,mesh shape

2.2 火炭母對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸IFN-β和IFN-γ蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果如圖2所示,與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠空腸中 IFN-β蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05),IFN-γ 蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性藥物組小鼠空腸中 IFN-β 和 IFN-γ 蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05),PCL-H 組小鼠空腸中 IFN-β 蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05),PCL-M 組 IFN-β蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05),且火炭母各劑量組小鼠空腸中 IFN-γ 蛋白表達(dá)均顯著上升(P<0.05)。

2.3 火炭母對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸TBK1和IRF3蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果如圖3所示,與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠空腸中IRF3和p-TBK1蛋白表達(dá)均顯著上升(P<0.05),p-IRF3和TBK1表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05);與模型組相比,陽(yáng)性藥物組和火炭母各劑量組小鼠空腸中TBK1、p-TBK1和IRF3蛋白表達(dá)均顯著上升(P<0.05),陽(yáng)性藥物組和PCL-H組p-IRF3蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05)。

圖3 火炭母對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸TBK1和IRF3蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of Polygonum chinense L. on TBK1 and IRF3 protein expression in jejunum of mice infected with S.typhimuriumA:Western blot檢測(cè)TBK1和IRF3蛋白表達(dá); B～E:分別為IRF3、p-IRF3、TBK1和p-TBK1蛋白相對(duì)表達(dá)A:Western blot analysis of TBK1 and IRF3 protein expression; B-E:Relative protein expression of IRF3,p-IRF3,TBK1 and p-TBK1,respectively

2.4 火炭母對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸TLR4-TRIF通路蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果如圖4所示,與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠空腸中TLR4蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05),而TRIF蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05);與模型組相比,陽(yáng)性藥物組和不同劑量火炭母處理組小鼠空腸中TLR4和TRIF蛋白表達(dá)均顯著上升(P<0.05)。

圖4 火炭母對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸TLR4-TRIF通路蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of Polygonum chinense L. on TLR4-TRIF pathway protein expression in jejunum of mice infected with S.typhimuriumA:Western blot 檢測(cè)TLR4-TRIF通路蛋白表達(dá); B、C:分別為TLR4和TRIF蛋白相對(duì)表達(dá)A:Western blot analysis of TLR4-TRIF pathway protein expression; B,C:Relative protein expression of TLR4 and TRIF,respectively

2.5 火炭母對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸促炎因子表達(dá)的影響 結(jié)果如圖5所示,與空白對(duì)照組相比,模型組小鼠空腸中IL-6、IL-1β和NF-κB p65蛋白表達(dá)均顯著上升(P<0.05);與模型組相比,陽(yáng)性藥物組和火炭母不同劑量組IL-1β和NF-κB p65蛋白表達(dá)均顯著下降(P<0.05),陽(yáng)性藥物組IL-6蛋白表達(dá)顯著上升(P<0.05),PCL-L組IL-6蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)。

圖5 火炭母對(duì)鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸促炎因子表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Polygonum chinense L. on jejunal proinflammatory factor in mice infected with S.typhimuriumA:Western blot 檢測(cè)IL-6、IL-1β和NF-κB p65通路蛋白表達(dá); B～D:分別為IL-6、IL-1β和NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)A:Western blot analysis of IL-6,IL-1β and NF-κB p65 pathway protein expression; B-D:Relative-protein expression of IL-6,IL-1β and NF-κB p65,respectively

3 討論

中草藥對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有良好的保護(hù)作用,并由此減少細(xì)菌和病毒等生物因子引起的炎癥反應(yīng)?；鹛磕钢饕铀岷忘S酮類成分[6];本實(shí)驗(yàn)室首次對(duì)廣東產(chǎn)火炭母所含的酚酸類(沒食子酸、綠原酸)和黃酮醇苷類(金絲桃苷)兩類化學(xué)成分的含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定,以保證藥材的品質(zhì)。據(jù)報(bào)道,沒食子酸具有抑菌和抗炎等生物活性,其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和鼠傷寒沙門菌等均有較好的抑制作用[7];綠原酸具有抗炎、抗菌和改善免疫調(diào)節(jié)等作用[8],重要的是,綠原酸對(duì)腸炎沙門菌具有抗菌活性[9];金絲桃苷具有抗氧化、抗炎和抗癌等作用[10]。這些成分可能是火炭母防治腸炎的物質(zhì)基礎(chǔ),故本試驗(yàn)建立了鼠傷寒沙門菌感染小鼠模型,探討火炭母對(duì)其空腸的保護(hù)作用及其潛在機(jī)制。

沙門菌感染機(jī)體后在腸道內(nèi)大量繁殖,并在此過程中持續(xù)產(chǎn)生毒素,當(dāng)毒素超過腸道自身免疫調(diào)節(jié)閾值時(shí)會(huì)導(dǎo)致腹瀉,還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1β等多種促炎細(xì)胞因子[11]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,鼠傷寒沙門菌感染后小鼠空腸組織杯狀細(xì)胞增多、腸腺紅細(xì)胞增多、結(jié)構(gòu)松散,腸道中炎性因子IL-6和IL-1β水平上升,而火炭母能顯著減少小鼠空腸組織中的杯狀細(xì)胞和腸腺紅細(xì)胞,改善腸道損傷,同時(shí)能顯著抑制IL-6和IL-1β蛋白的表達(dá),減輕空腸炎癥。

研究發(fā)現(xiàn),沙門菌感染機(jī)體過程中,能誘導(dǎo)I型IFN的產(chǎn)生,特別是IFN-β的產(chǎn)生,以抑制先天性炎癥反應(yīng)[12]。另有研究發(fā)現(xiàn),大腸桿菌感染機(jī)體時(shí)能通過誘導(dǎo)Ⅰ型IFN的表達(dá)維持腸道屏障功能,保護(hù)腸道屏障不被破壞[13]。在哺乳動(dòng)物中,Ⅰ型IFN通過誘導(dǎo)干擾素刺激基因(Interferon-stimulated gene,ISG)的產(chǎn)生,抑制過度的炎癥反應(yīng)來抑制細(xì)菌感染,增加干擾素水平,從而改善沙門菌感染引起的疾病[14]。研究表明,Ⅱ型IFN可控制腸道組織中的病原體負(fù)荷,調(diào)節(jié)杯狀細(xì)胞黏蛋白的釋放,提高Ⅱ型IFN的產(chǎn)生可改善鼠傷寒沙門菌引起的疾病[15]。有研究發(fā)現(xiàn),肉雞感染鼠傷寒沙門菌后,空腸中的 IFN-γ 含量降低,TNF-α 和 IL-1β 蛋白表達(dá)增高[16]。綠原酸是本試驗(yàn)中火炭母口服液所含的主要化學(xué)成分之一,該化合物可通過抑制 NF-κB進(jìn)而抑制脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、IFN-γ 和 TNF-α 等炎癥因子的基因表達(dá),通過抑制活性蛋白質(zhì)來緩解炎癥[17,18]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,沙門菌感染小鼠的空腸中 IFN-β 蛋白表達(dá)上升,IFN-γ 表達(dá)下降,而火炭母各劑量組小鼠空腸中IFN-γ蛋白表達(dá)均上升,火炭母高劑量組小鼠空腸中IFN-β蛋白表達(dá)上升,提示火炭母可能通過增強(qiáng)腸道免疫提高腸道屏障功能。當(dāng)病原體侵襲機(jī)體后,TBK1蛋白會(huì)發(fā)出信號(hào),引發(fā)抑制病原體復(fù)制的程序[13]。在TBK1缺乏的細(xì)胞中,病原體能夠大量繁殖[19],提示沙門菌感染小鼠空腸的免疫功能變化可能與TBK1有關(guān)。TBK1的典型抗病毒活性依賴于轉(zhuǎn)錄因子IRF3的磷酸化。磷酸化是IRF3的活化形式,其活化形式移至細(xì)胞核可誘導(dǎo)IFN-α和IFN-β的生成[20]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,沙門菌感染小鼠的空腸中IRF3和p-TBK1蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),火炭母能提高沙門菌感染小鼠空腸中IRF3、TBK1、p-IRF3和p-TBK1的蛋白表達(dá),提示火炭母提高沙門菌小鼠空腸免疫功能可能與TBK1上調(diào)有關(guān)。

當(dāng)細(xì)菌感染機(jī)體時(shí),腸道細(xì)胞表面的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)和細(xì)胞內(nèi)的 Nod 樣受體(NOD-like receptors,NLRs)對(duì)細(xì)菌的識(shí)別起關(guān)鍵作用。沙門菌作用機(jī)體能上調(diào)TLR4的表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)[21]。TLR4誘導(dǎo)TBK1激活進(jìn)一步介導(dǎo)IRF3的磷酸化,并誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)[22]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,鼠傷寒沙門菌感染小鼠的空腸中TLR4蛋白表達(dá)增強(qiáng),火炭母能提高鼠傷寒沙門菌小鼠空腸中TLR4和TRIF蛋白表達(dá)水平,且與p-TBK1、p-IRF3和IFN的變化趨勢(shì)一致,提示火炭母可能通過上調(diào)TLR4-TBK1信號(hào)通路增強(qiáng)鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸中IFN-β和IFN-γ蛋白表達(dá),使其免疫功能上調(diào)。

綜上所述,本試驗(yàn)采用鼠傷寒沙門菌感染BALB/c小鼠建立小鼠腸炎模型,探索火炭母對(duì)空腸免疫的影響,結(jié)果表明,火炭母可能通過上調(diào) TLR4-TBK1信號(hào)通路誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生,從而改善鼠傷寒沙門菌誘導(dǎo)的腸炎。