翁長江

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 , 黑龍江 哈爾濱 150069 ; 2. 黑龍江省獸醫(yī)免疫學(xué)重點實驗室 , 黑龍江 哈爾濱 150069)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家豬和野豬引起的一種急性、烈性、出血性傳染病。ASFV強毒株感染家豬的發(fā)病率和死亡率可達100%[1]。世界動物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,WOAH)官網(wǎng)數(shù)據(jù)表明,僅2023年1—8月,全球共有26個國家/地區(qū)通報1 664起家豬和4 218起野豬共5 882起ASF疫情,超過30萬頭家豬被撲殺,超過4 600頭野豬感染死亡,說明ASFV疫情的防控是一個世界級的難題。自2018年我國首次報道ASF疫情以來,截至2023年8月,全國31個省共發(fā)生ASF疫情197起(其中野豬疫情6起),主要分布在養(yǎng)豬業(yè)貿(mào)易頻繁的主要經(jīng)濟區(qū)域。目前,由于沒有安全有效的疫苗和商業(yè)化的藥物,世界養(yǎng)豬業(yè)仍然面臨ASF疫情蔓延帶來的嚴峻挑戰(zhàn)。因此,研究并闡明ASFV基因在ASFV感染、致病和免疫逃逸中的作用,并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)制有效的防控技術(shù)和產(chǎn)品,將為ASF防控提供強有力的科技支撐。

1 非洲豬瘟病毒

ASFV是一種有囊膜的DNA病毒,是非洲豬瘟病毒科的唯一成員。ASFV粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu),具有復(fù)雜且獨特的多層膜結(jié)構(gòu),由內(nèi)到外依次由核心、核殼、內(nèi)囊膜、衣殼和外囊膜組成[2]。ASFV基因組大小為170～190 kb,生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果表明,ASFV基因組含有150～170個開放閱讀框(Open reading frames,ORFs),在感染細胞中表達150～200種病毒蛋白。2018年底,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所從黑龍江省發(fā)病豬中成功分離了1株ASFV毒株,命名為ASFV HLJ/18,該毒株對無特定病原體(Specific pathogen free,SPF)的長白豬具有極強的感染性和致病性,肌肉注射低劑量的ASFV(102.5HAD50/mL),3～5 d感染豬全部出現(xiàn)癥狀,7～11 d所有感染豬全部死亡,血液中病毒滴度達到107～108HAD50/mL;另外,該病毒還具有水平傳播能力,同居豬13～14 d全部死亡。全基因組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn),ASFV HLJ/18的基因組序列與2017年波蘭ASFV分離株(PoL/2017)的基因組序列高度相似,但存在插入、缺失和突變[3]。最近,Sun等對2020年從全國各地分離的22株ASFV毒株的基因組進行分析發(fā)現(xiàn),一些毒株的基因組發(fā)生了不同程度的突變,EP402R基因(編碼CD2v)發(fā)生改變的毒株所感染的細胞不具有吸附紅細胞的特性,致病力也降低[4]。本團隊初步完成的ASFV HLJ/18毒株感染豬肺泡巨噬細胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),ASFV HLJ/18感染PAMs可以表達187個病毒蛋白,ASFV HLJ/18感染對NF-κB信號通路、天然免疫、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡和細胞自噬等多個生物學(xué)過程有重要影響。在此基礎(chǔ)上,對ASFV HLJ/18基因組進行了重新注釋(圖1)。

圖1 ASFV HLJ/18毒株基因組的注釋Fig.1 Genome annotation of ASFV HLJ/18 strain

2 ASFV感染與免疫調(diào)節(jié)基因

ASFV感染的臨床表型可呈現(xiàn)高致死性的急性臨床表現(xiàn)、亞臨床表現(xiàn)或病毒的持續(xù)性感染狀態(tài),這不僅取決于流行毒株的遺傳背景,也與宿主的遺傳背景有關(guān)[5]。ASFV感染的主要靶細胞是PAMs和單核巨噬細胞,包括特定組織巨噬細胞和網(wǎng)狀細胞的特定譜系。ASFV可以通過與細胞膜上的受體作用[6],通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[7]或巨胞飲途徑進入靶細胞。隨后病毒內(nèi)囊膜與次級內(nèi)體膜融合,病毒基因組被釋放到細胞質(zhì)中。

早期研究結(jié)果表明,一些ASFV編碼蛋白與基因組復(fù)制、DNA修復(fù)和病毒粒子組裝等功能密切相關(guān)。而另外一些ASFV編碼蛋白執(zhí)行免疫調(diào)節(jié)的功能,在逃避宿主的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。例如,這些蛋白在調(diào)控NF-κB信號通路[8]、干擾宿主天然免疫反應(yīng)[包括調(diào)控干擾素(Interferon,IFN)產(chǎn)生、IFN誘導(dǎo)的JAK-STAT信號通路和炎癥反應(yīng)][9,10]、調(diào)控細胞死亡(凋亡、壞死和焦亡)[11,12]和自噬[13,14]等過程中發(fā)揮重要作用。因此,本綜述將編碼參與天然免疫、炎癥反應(yīng)、細胞死亡和自噬的ASFV蛋白的基因統(tǒng)稱為ASFV免疫調(diào)節(jié)基因,并總結(jié)這些免疫調(diào)節(jié)基因的生物學(xué)功能。

2.1 ASFV免疫調(diào)節(jié)基因調(diào)控細胞凋亡 細胞凋亡又稱細胞程序性死亡(Programmed cell death,PCD)。有研究發(fā)現(xiàn),許多病毒能通過調(diào)控感染細胞的凋亡促進病毒復(fù)制和子代病毒的傳播[15]。ASFV感染組織出現(xiàn)廣泛的損傷并伴有大量的細胞死亡[16]。ASFV編碼部分蛋白與細胞凋亡的功能密切相關(guān),一些蛋白能促進細胞凋亡,如p54和pE199L,而另外一些蛋白對細胞凋亡有明顯的抑制作用[11],如pA179L和pA224L(圖2)。

圖2 ASFV編碼蛋白調(diào)控細胞凋亡Fig.2 ASFV-encoded proteins regulate apoptosis

2.1.1 ASFVE183L和E199L基因編碼蛋白誘導(dǎo)細胞凋亡 ASFV p54是由ASFVE183L基因編碼的一種膜蛋白,主要參與病毒的入侵粘附和病毒粒子的組裝等過程[17]。過表達p54可促進細胞凋亡。p54包含1個13個氨基酸的結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域與促細胞凋亡蛋白Bim的BH3結(jié)構(gòu)域具有一定相似性,缺失該結(jié)構(gòu)域的p54將失去誘導(dǎo)細胞凋亡的能力[18]。研究發(fā)現(xiàn),ASFV pE199L也能夠誘導(dǎo)細胞凋亡,pE199L的表達可導(dǎo)致線粒體膜電位勢能下降、細胞色素C釋放以及凋亡相關(guān)Caspase-9和-3/7激活,說明pE199L通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細胞死亡[19]。

2.1.2 ASFVA179L、A224L和EP153R基因編碼蛋白抑制細胞凋亡 ASFVA179L基因編碼Bcl-2類似蛋白,包含4個保守結(jié)構(gòu)域(BH1、BH2、BH3和BH4),屬于抗細胞凋亡Bcl-2家族成員之一[11]。ASFV pA179L蛋白序列在所有毒株中高度保守,該蛋白在病毒感染早期和晚期均有表達,主要定位在線粒體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)。過表達pA179L能抑制多種刺激誘導(dǎo)的細胞凋亡[20]。機制上,pA179L與促凋亡蛋白家族蛋白,如Bid、Bad、Bmf、Bik和Bim等相互作用,形成異源二聚體,抑制細胞凋亡[12]。

ASFV pA224L是由ASFVA224L基因編碼的晚期表達蛋白,屬于凋亡抑制因子(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族成員[21]。有研究表明,在細胞中穩(wěn)定表達pA224L能夠抑制TNFα誘導(dǎo)的Caspase-3激活和細胞凋亡[22]。過表達pA224L能激活NF-κB信號通路,從而通過誘導(dǎo)包括IAP和Bcl-2家族成員的大量抗凋亡基因的轉(zhuǎn)錄而抑制細胞凋亡,促進病毒增殖[23]。A224L基因缺失的ASFV毒株(ASFV-ΔA224L)感染Vero細胞后,Caspase-3的活性增強,但并沒有降低ASFV在巨噬細胞內(nèi)的復(fù)制能力及其對家豬的致病力[22]。

ASFVEP153R基因編碼的pEP153R在病毒感染的早期和晚期均有表達,該蛋白與一些C型凝集素分子的N-端結(jié)構(gòu)域具有同源性。pEP153R蛋白是多功能蛋白,能抑制主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類(Major histocompatibility complex class Ⅰ(MHC-Ⅰ)分子表達,調(diào)控細胞凋亡,參與紅細胞吸附過程[11],也能通過抑制p53蛋白的激活從而抑制星形孢菌素或病毒感染誘導(dǎo)的細胞凋亡[24]。缺失EP153R基因的ASFV BA71V毒株(ASFV-ΔEP153R)感染細胞可以激活Caspase-3,從而誘導(dǎo)細胞死亡,同時ASFV感染細胞吸附紅細胞的特征消失。

2.1.3 ASFVDP71L和E66L基因編碼蛋白抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡 ASFV感染細胞中出現(xiàn)未折疊蛋白在ER內(nèi)積累,導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)反應(yīng)。持續(xù)的ERS會激活翻譯起始因子2α(Translation initiation factor 2α,eIF2α)-ATF4-CHOP信號通路,使細胞啟動ERS誘導(dǎo)的程序性細胞凋亡[25,26]。ASFV感染還可以激活Caspase-12,上調(diào)鈣聯(lián)蛋白(Calnexin)和鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin)的表達。ASFV感染可激活未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded protein response,UPR)信號通路中的轉(zhuǎn)錄激活因子6(Activating transcription factor 6,ATF6),阻止早期的細胞凋亡,有利于病毒的復(fù)制[27]。研究發(fā)現(xiàn),ASFV pE66L能夠關(guān)閉宿主翻譯機制,這與PKR/eIF2a信號通路有關(guān)[28]。另外,ASFV pDP71L蛋白可招募蛋白磷酸酶1(Protein phosphatase 1,PP1),促進eIF2α去磷酸化,從而抑制eIF2α-ATF4-CHOP信號通路的激活及其介導(dǎo)的細胞凋亡,促進病毒的增殖[29]。

2.2 ASFV免疫調(diào)節(jié)基因調(diào)控宿主天然免疫反應(yīng) ASFV感染并不能誘導(dǎo)大量IFN的產(chǎn)生,且ASFV感染能抑制poly (I∶C)誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn),ASFV感染可同時抑制JAK-STAT信號通路中信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1(Signal transducer and activator of transcription,STAT1)和STAT2的磷酸化[30]。ASFV編碼蛋白能抑制IFN產(chǎn)生[10],且能抑制IFN誘導(dǎo)的JAK-STAT信號通路的激活,從而抑制了IFN刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的表達,阻止宿主抗病毒作用的發(fā)揮[31,32](圖3)。

圖3 ASFV編碼蛋白抑制IFN產(chǎn)生和其下游JAK-STAT信號通路Fig.3 ASFV-encoded proteins inhibit interferon production and its downstream JAK-STAT signal pathway

2.2.1 ASFVMGF360和MGF505家族基因編碼蛋白調(diào)控I 型IFN產(chǎn)生 早期研究發(fā)現(xiàn),ASFVMGF360和MGF505基因不僅決定病毒感染宿主的范圍[33],而且抑制IFN的產(chǎn)生[34,35],且與病毒的致病力相關(guān)。隨后的研究發(fā)現(xiàn),多個MGF360和MGF505家族成員能夠抑制I型IFN表達,同時能夠抑制IFN誘導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)。如pMGF360-15R/pA276R可以抑制Poly(I∶C)刺激的I型IFN表達上調(diào),但對I型和II型IFN誘導(dǎo)的JAK-STAT途徑和NF-κB信號通路沒有抑制作用;而pMGF505-7R/pA528R可通過抑制干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子而抑制Ⅰ型IFN的產(chǎn)生[31]。

研究發(fā)現(xiàn),pMGF505-7R[36]、pMGF360-11L[37]、pMGF360-12L[38]和pMGF360-14L[39]通過不同途徑抑制IFN的產(chǎn)生。如pMGF505-7R能夠促進自噬相關(guān)蛋白UNC-51樣激酶1(UNC-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)的表達進而降解干擾素基因刺激因子(Stimulator of interferon genes,STING),從而抑制激活的環(huán)狀GMP-AMP合酶(Cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)-STING信號通路[40];還能通過與IRF3相互作用并抑制其核轉(zhuǎn)位,抑制I型IFN的產(chǎn)生[36]。pMGF360-12L通過抑制輸入蛋白α(Importin α)與NF-κB的相互作用破壞NF-κB的核轉(zhuǎn)位,從而抑制I型IFN的產(chǎn)生[41]。pMGF505-11R可抑制cGAS、STING和TANK結(jié)合激酶(TANK-binding kinase,TBK1)等誘導(dǎo)的IFN和ISRE 的激活,并可抑制IFN-β、ISG15和ISG56的轉(zhuǎn)錄;pMGF505-11R可與STING相互作用,并通過溶酶體、泛素化蛋白酶體和自噬等多個途徑降解STING;另外,pMGF505-11R也可抑制過表達cGAS/STING誘導(dǎo)的TBK1和IRF3的磷酸化,從而抑制I型IFN的產(chǎn)生[42]。

2.2.2 ASFV MGF家族蛋白調(diào)控JAK-STAT信號通路,抑制ISGs的表達 ASFV感染不僅可以抑制IFN的產(chǎn)生[30],也能拮抗IFN信號通路,從而抑制IFN誘導(dǎo)的ISGs的表達。ASFV感染細胞中IFN刺激因子3(Interferon-stimulated gene factor 3,ISGF3)的核易位受損,導(dǎo)致蛋白酶體依賴性STAT2的降解和Caspase-3依賴性STAT1的切割[43]。值得注意的是,敲除MGF505-7R基因的ASFV毒株感染細胞能產(chǎn)生相對高水平的ISGs[36]。與親本病毒相比,敲除MGF360和MGF505家族部分基因的ASFV毒株對IFN更加敏感。研究發(fā)現(xiàn),多個MGF家族成員負調(diào)控IFN信號通路。如pMGF360-9L通過與STAT1/2相互作用并促進其降解而抑制ISGs的表達,該基因敲除毒株在PAMs中的復(fù)制能力降低,且對豬的致病力也降低[44]。pMGF505-7R能夠抑制IFN-γ激活的JAK-STAT1信號通路,其機制為通過上調(diào)E3泛素連接酶RNF125和抑制Hse5的表達以促進JAK1和JAK2的降解[45]。

2.2.3 ASFVI329L、E120R、DP96R和I215L等基因編碼的蛋白抑制IFN的產(chǎn)生 pI329L為Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)家族蛋白同系物,是在細胞膜上表達的高度糖基化蛋白。有研究表明,pI329L可拮抗TLR3激活的天然免疫反應(yīng)[46]。在機制上,pI329L能夠抑制β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing IFN-β,TRIF)的活性,進而阻斷TRIF介導(dǎo)的IRF3和NF-κB激活以及下游細胞因子的轉(zhuǎn)錄,過表達TRIF可以逆轉(zhuǎn)pI329L的抑制作用[47]。pE120R是ASFV編碼的在病毒感染晚期表達的結(jié)構(gòu)蛋白,與病毒毒力相關(guān),pE120R參與ASFV粒子從組裝位點到質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運,在ASFV的傳播中發(fā)揮重要作用[48]。研究表明,pE120R通過與IRF3相互作用,抑制TBK1與IRF3相互作用,從而抑制IRF3的磷酸化,進而阻斷IFN-β的產(chǎn)生[49]。pDP96R是ASFV編碼的病毒毒力相關(guān)因子之一,有研究表明,pDP96R能夠抑制cGAS-STING誘導(dǎo)的TBK1的活性,進而負調(diào)控I型IFN的產(chǎn)生[50]。

通過無偏見的篩選發(fā)現(xiàn),4個ASFV蛋白(pI215L、pE301R、pD345R和pS273R)可顯著抑制cGAS-STING誘導(dǎo)IFN的產(chǎn)生。ASFV編碼早期蛋白pI215L是一種泛素結(jié)合酶,是ASFV復(fù)制所必須的[51]。pI215L通過招募RNF138降解RNF128,抑制RNF128對TBK1的K63位泛素化修飾,進而抑制I型IFN的產(chǎn)生[52]。而pE301R通過抑制cGAMP和poly(I∶C),誘導(dǎo)IRF3入核,從而抑制I型IFN的產(chǎn)生[53]。pS273R則是通過與IKKε相互作用干擾IKKε與STING之間的相互作用,從而抑制IFN的產(chǎn)生[54]。

2.2.4 CD2v 和pS273R抑制IFN和ISGs的產(chǎn)生 ASFV的EP402R基因可編碼Ⅰ型跨膜蛋白CD2v,該蛋白與T淋巴細胞表面粘附受體CD2序列同源[55]。利用ASFV-ΔCD2v毒株感染PAMs發(fā)現(xiàn),IFN和ISGs的mRNA水平上調(diào),在機制上,CD2v與STING和IRF3相互作用,抑制STING和IRF3的核轉(zhuǎn)位,從而抑制IFN的產(chǎn)生;同時,CD2v通過與Ⅰ型干擾素受體1(Interferon α and β receptor subunit 1,IFNAR1)和IFNAR2的作用抑制了JAK-STAT信號通路,從而抑制了宿主的抗病毒反應(yīng)[56]。有研究發(fā)現(xiàn),pS273R與STAT2 相互作用并招募 E3 連接酶 DCST1以泛素化STAT2,從而促進STAT2的降解,值得注意的是,pS273R抑制IFN的產(chǎn)生和ISGs的表達,與pS273R酶的活性無關(guān)[57]。

2.3 ASFV 感染調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)

2.3.1 ASFV 感染調(diào)控NF-κB信號通路 早期研究發(fā)現(xiàn),pA238L通過調(diào)控NF-κB、NF-AT和c-Jun 的轉(zhuǎn)錄活性進而抑制促炎性細胞因子的表達[58]。盡管缺失A238L基因的重組毒株(ASFV-ΔA238L)感染豬也能誘導(dǎo)TNF-α表達上調(diào),但與親本毒株相比,缺失A238L基因的ASFV Malawi Lil-20/1毒株的復(fù)制能力和致病力都沒有明顯改變[59]。研究發(fā)現(xiàn),pI215L、pDP96R、pMGF360-12L和pF317L能抑制NF-κB的激活。pI215L通過阻止p65的入核而抑制NF-κB的激活[60],參與抑制宿主蛋白的合成[61]。pDP96R蛋白還能夠阻斷IKKβ介導(dǎo)的NF-κB啟動子活性[50]。pMGF360-12L與核轉(zhuǎn)運蛋白KPNA2、KPNA3和KPNA4相互作用,抑制了p65與KPNA2、KPNA3和KPNA4之間的相互作用,通過阻止NF-κB和核轉(zhuǎn)運蛋白抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位[38]。pF317L與IKKβ相互作用并抑制其磷酸化,這直接導(dǎo)致IκBα的磷酸化和泛素化程度降低,增強了IκBα的穩(wěn)定性,IκBα的累積阻止了NF-κB的激活和核定位,減少了炎性因子的表達,敲除或敲低F317L基因的表達能增強病毒的復(fù)制[62]。

2.3.2 ASFV感染調(diào)控NLRP3炎癥小體 ASFV感染PAMs并不引起嚴重的炎癥反應(yīng)和細胞焦亡。有研究發(fā)現(xiàn),ASFV pMGF505-7R和pH240R可與NLRP3相互作用,抑制凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)的寡聚化,從而抑制Caspase-1的激活和IL-1β的分泌[36,63]。進一步研究發(fā)現(xiàn),pMGF505-7R與IKK復(fù)合體中的IKKα相互作用,抑制NF-κB的激活,并與NLRP3相互作用抑制炎癥小體的形成,從而抑制IL-1β的產(chǎn)生;與親本毒株相比,ASFV-ΔMGF505-7R感染PAMs能夠誘導(dǎo)更高水平的IFN和IL-1β的產(chǎn)生;動物試驗結(jié)果顯示,與親本病毒相比,ASFV-ΔMGF505-7R毒株在體內(nèi)的復(fù)制水平和致病力降低[36]。而pH240R與IKK復(fù)合體中的NEMO相互作用,抑制NF-κB的激活,并與NLRP3相互作用抑制炎癥小體的形成,從而抑制IL-1β的產(chǎn)生[63]。

ASFV感染細胞中Caspase-1 特異性切割GSDMD產(chǎn)生1個具有誘導(dǎo)細胞焦亡活性的GSDMD氨基端片段(GSDMD-N1-279)。Zhao等研究發(fā)現(xiàn),pS273R繼續(xù)切割GSDMD-N1-279所產(chǎn)生的GSDMD-N1-107和GSDMD-N108-279均不觸發(fā)細胞焦亡,揭示ASFV pS273R蛋白能夠通過切割GSDMD負調(diào)控炎癥反應(yīng),從而有利于病毒的復(fù)制[64](圖4)。

圖4 ASFV感染調(diào)控炎癥反應(yīng)Fig.4 ASFV infection regulates inflammatory responses

2.4 ASFV免疫調(diào)節(jié)基因調(diào)控自噬 ASFV感染可以調(diào)控自噬過程,一些ASFV編碼蛋白通過自噬途徑降解先天免疫信號通路的關(guān)鍵分子來調(diào)節(jié)天然免疫。如pA179L通過與Beclin-1互作調(diào)節(jié)饑餓條件誘導(dǎo)的自噬體形成[13,14]。pE199L與PYCR2相互作用促進細胞自噬[65],而p17通過促進SQSTM1與TOM70的相互作用促進線粒體自噬,調(diào)節(jié)先天免疫[66]。pMGF505-7R通過自噬降解STING,抑制IFN的產(chǎn)生[40]。pMGF110-9L促進TBK1自噬降解,抑制IFN信號[67]。而pA137R通過自噬途徑降解TBK1,進一步負向調(diào)節(jié)I型IFN信號傳導(dǎo)[68]。有研究發(fā)現(xiàn),pL83L與cGAS和STING相互作用,通過募集Tollip促進STING的自噬溶酶體降解,從而阻斷下游信號分子TBK1、IRF3和IκBα的磷酸化,減少IFN-I的產(chǎn)生[69]。

3 敲除ASFV免疫調(diào)節(jié)基因?qū)Σ《局虏×Φ挠绊?/h2>

大量的研究結(jié)果表明,ASFV 分離毒株的致病力與毒力相關(guān)基因、毒株的遺傳背景和動物飼養(yǎng)狀態(tài)密切相關(guān)。因此,判斷某個基因是否是ASFV的毒力基因,要考慮多種因素。

3.1 敲除ASFVA238L和EP153R基因并不影響ASFV的致病力 盡管pA238L在介導(dǎo)宿主免疫逃逸方面有重要作用,但敲除A238L基因并不影響ASFV在巨噬細胞中的復(fù)制能力,也不影響病毒對家豬的致病性[59]。同樣,敲除EP153R基因也不影響病毒的復(fù)制及其對家豬的致病性[70]。

3.2 敲除ASFVI226R、A137R和I177L基因顯著影響ASFV的致病力 ASFV編碼的pI226R是序列高度保守的糖蛋白。有研究發(fā)現(xiàn),敲除I226R基因的ASFV SY18毒株(ASFV SY18-ΔI226)毒力完全喪失,以104.0TCID50或107.0TCID50的劑量接種豬均未引起明顯的臨床癥狀,接種21 d后用親本毒株ASFV SY18肌內(nèi)注射攻毒,所有攻毒豬均存活,無明顯發(fā)熱或異常的臨床癥狀,當病毒血癥消失時,解剖組織都檢測不到病毒DNA[71]。

pA137R蛋白是ASFV編碼的晚期表達蛋白,定位于病毒工廠,并在病毒感染后期組裝到病毒粒子中[72]。有研究表明,以pA137R的合成多肽免疫豬后,能夠抵抗ASFV Espania 70毒株的攻擊,敲除A137R基因的ASFV-Georgia2010 (ASFV-G)毒株(ASFV-G-ΔA137R)的毒力顯著降低,肌內(nèi)注射102HAD50的ASFV-G-ΔA137R的豬在28 d觀察期內(nèi)保持臨床健康,所有接種豬均表現(xiàn)出中高度病毒血癥,并產(chǎn)生了較強的病毒特異性抗體應(yīng)答,所有ASFV-G-ΔA137R接種豬在受到親本毒株攻擊時都得到保護[73]。

pI177L 是ASFV編碼的晚期表達膜蛋白,但功能未知。研究表明,低劑量ASFV-G-ΔI177L毒株免疫豬后,能拮抗親本毒株的攻擊,高劑量接種時對豬也不具有致病性[74],越南最近批準了該減毒活疫苗在其境內(nèi)的使用。但國內(nèi)的一些實驗室初步研究結(jié)果表明,中國分離毒株敲除了I177L基因后致病力降低,但豬免疫該毒株后仍然具有高病毒血癥,提示該候選疫苗可能存在一定的安全風(fēng)險。

3.3 ASFVDP71L和DP148R基因?qū)Σ《緩?fù)制和致病力的影響與病毒遺傳背景相關(guān) pDP71L是一種與細胞的MyD116和單純皰疹病毒神經(jīng)毒力因子ICP34.5相似的蛋白質(zhì),其可與PP1相互作用并激活PP1[75]。敲除DP71L基因的ASFV E70毒株(ASFV-E70-ΔDP71L)并不影響其在巨噬細胞中的復(fù)制能力,但該敲除毒株對豬的致病力明顯下降,被ASFV-ΔDP71L毒株感染的豬除了短暫的發(fā)熱反應(yīng)沒有出現(xiàn)其他臨床癥狀,血液中病毒滴度降低1 000倍,所有接種豬均未出現(xiàn)死亡[76]。然而缺失DP71L基因的ASFV Malawi Lil-20/1毒株(ASFV-Malawi-ΔDP71L)感染家豬的致死率仍達100%,值得注意的是,缺失DP71L基因的ASFV Pretoriuskop/96/4毒株(ASFV Pretoriuskop-ΔDP71L)能夠延遲家豬接種后出現(xiàn)病毒血癥和死亡的時間,但仍然有很高的致死率[77]。

pDP148R能夠調(diào)節(jié)宿主IFN應(yīng)答反應(yīng),缺失DP148R的ASFV Benin毒株(ASFV-Benin-ΔDP148R)的致病力降低,該致弱毒株免疫豬可以獲得對同源病毒的攻毒保護[78]。但另一項研究發(fā)現(xiàn),敲除DP148R基因的ASFV HLJ/18 毒株(ASFV-HLJ-ΔDP148R)在巨噬細胞中的復(fù)制能力和對豬的致病力并不降低[79]。這些研究結(jié)果提示,DP148R基因是非必需基因,該基因的致病性與毒株的遺傳背景有關(guān),病毒基因和遺傳背景共同決定了病毒的致病力。

3.4 敲除ASFVMGF360、MGF505家族基因和EP402R等基因降低病毒的致病力 早期研究表明,MGF360和MGF505家族與ASFV的致病性相關(guān),是ASF的關(guān)鍵毒力基因。缺失ASFV的3個MGF360基因和4個MGF505基因可顯著降低ASFV在巨噬細胞中的復(fù)制能力和對豬的致病力[80]。Chen等利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除ASFV HLJ/18 毒株基因組中6個MGF360/505家族的基因(MGF360-12L、13L、14L和MGF505-1R、2R、3R),成功制備了多基因缺失毒株ASFV-Δ6GD,與親本毒株相比較,ASFV-Δ6GD毒株對豬的致病性顯著降低,大劑量病毒感染也不會引起豬死亡[79]。有研究表明,敲除EP402R基因可以降低ASFV在豬體內(nèi)的復(fù)制能力和致病性[81]。敲除EP402R基因的ASFV HLJ/18 毒株(ASFV-HLJ/18-ΔEP402R)對豬的致病力明顯減弱,與親本毒株相比,EP402R基因缺失毒株致死率僅為50%,剩余感染豬存活且獲得免疫保護。在ASFV-Δ6GD毒株的基礎(chǔ)上,進一步敲除EP402R基因獲得多基因聯(lián)合敲除ASFV毒株(ASFV-Δ7GD),與親本毒株比較,ASFV-Δ7GD在體內(nèi)的復(fù)制能力和致病力明顯降低,具有良好的安全性,育肥豬免疫2次即可對ASFV親本毒株的攻擊提供完全保護[79]。

以上研究表明,敲除ASFV部分免疫調(diào)節(jié)基因,可以顯著降低ASFV毒株在豬體內(nèi)的復(fù)制能力和致病性。同時,這些研究結(jié)果也提示,ASFV自身遺傳背景的差異性可能決定了ASFV毒株的致病力,或是多個ASFV基因共同決定ASFV毒株的致病力。

4 前景與展望

ASFV難以控制的因素是多方面,但主要原因是人類對ASF的流行、感染和免疫逃逸了解不全面,對ASFV的致病機制和免疫保護機制認識不足。在過去30年的科研實踐中,與ASFV致病力相關(guān)的毒力基因相繼被發(fā)現(xiàn),敲除這些基因并不影響毒株的復(fù)制能力,但病毒的致病力降低。利用這些毒株免疫豬可以提供部分或完全保護,但其安全性、穩(wěn)定性、是否會誘發(fā)交叉保護等問題仍需要進一步評價。傳統(tǒng)的ASFV滅活疫苗已被證明沒有保護效果,且已嘗試了多種佐劑與滅活的ASFV混合誘導(dǎo)免疫反應(yīng),但對免疫豬均無法提供有效的保護。研究還表明,雖然免疫高劑量滅活A(yù)SFV或γ輻照滅活A(yù)SFV是安全的,但免疫保護效果也不理想。此外,已經(jīng)積累的數(shù)據(jù)表明,利用ASFV自然致弱毒株或基因工程制備的減毒毒株免疫豬可以提供完全的保護,但血液和部分器官中仍然有病毒存在,豬會間歇性排毒,并具有水平傳播的風(fēng)險。值得注意的是,有些減毒株免疫后更難被檢出,且對母豬的繁殖性能存在影響。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,亞單位疫苗、DNA疫苗和活載體疫苗的研究也隨之展開,但效果還有待提高。因此,利用現(xiàn)代病毒學(xué)、免疫學(xué)等方法鑒定出ASFV免疫調(diào)節(jié)基因,并在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)和鑒定ASFV關(guān)鍵毒力基因,闡明其在病毒感染、免疫逃逸和致病中的功能就顯得尤為迫切。只有在深入了解ASFV免疫調(diào)節(jié)基因調(diào)控病毒毒力的基礎(chǔ)上,闡明ASFV逃逸宿主免疫的機制和ASFV致病性和持續(xù)性感染的機理,才能開發(fā)出更安全和高效的ASFV疫苗和抗病毒藥物。

致謝:黃麗研究員繪制的部分插圖;宋潔、李婷婷和陳欣等同志對本文的認真校對。