湯朝暉, 趙健超 , 任慧英 , 張 燦 , 鄒 玲 , 尹燕博 , 劉宗柱 , 劉文華

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 , 山東 青島 266109 ; 2. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 , 山東 青島 266109)

大腸桿菌在環(huán)境中分布廣泛,致病血清型可以引起動(dòng)物發(fā)病,是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要病原菌,能夠單獨(dú)或協(xié)同其他病原混合感染[1],嚴(yán)重影響?zhàn)B殖效益。大腸桿菌既可以通過空氣、飼料和飲水等途徑水平傳播,也可以通過雞胚垂直傳播,雞胚感染大腸桿菌可造成孵化率降低或產(chǎn)生弱雛,混雜弱雛的雞苗是養(yǎng)殖場大腸桿菌感染的重要來源。大腸桿菌的致病性與所攜帶的毒力基因密切相關(guān),毒力基因有助于大腸桿菌的定植、入侵和逃避免疫清除。大腸桿菌毒力基因種類眾多,報(bào)道較多的有菌毛基因papC、氣桿菌素基因iucD、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)基因irp2和抗血清存活基因iss等[2]。致病性大腸桿菌血清型眾多,疫苗針對性差,防治效果不顯著,所以抗生素治療仍是目前治療大腸桿菌病的主要方法。但長期使用抗生素所導(dǎo)致的耐藥性與日俱增,因此必須要增強(qiáng)對大腸桿菌耐藥性的監(jiān)測,合理使用抗生素,以減緩大腸桿菌耐藥性的發(fā)生[3]。為了解死胚中分離大腸桿菌的致病性,本試驗(yàn)對啄殼死胚進(jìn)行了大腸桿菌的分離,并對分離的大腸桿菌進(jìn)行了致病性和耐藥性分析,揭示了毒力基因與大腸桿菌致病性的關(guān)系,旨在為種雞場防治大腸桿菌病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株 山東省某白羽肉雞孵化場采集的不同批次174枚啄殼未出殼死胚;SPF級 BALB/c小鼠,雄性,6～8周齡,體重(20±2)g,購自青島大吳富城科技有限公司(生產(chǎn)許可證號:913702853259697258);大腸桿菌K88、ATCC25922、BL21和鼠傷寒沙門菌ATCC14028,均為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)試劑 SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基和大腸桿菌顯色培養(yǎng)基,均購自青島海博生物技術(shù)有限公司;革蘭染色試劑盒,購自青島長和生物科技有限公司;2×TaqMaster Mix,購自上海派森諾生物科技股份有限公司;藥敏紙片,自制,并經(jīng)質(zhì)控菌株ATCC25922驗(yàn)證;細(xì)菌微量生化反應(yīng)管,購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器 PCR儀,杭州朗基科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;凝膠成像儀,上海旻泉儀器有限公司產(chǎn)品;生物安全柜,中國BIOBASE公司產(chǎn)品。

1.4 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 用75%酒精消毒待檢死胚蛋殼表面,用接種環(huán)挑取卵黃液和胎糞分別接種SS瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美蘭培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察結(jié)果。

1.5 分離菌的鑒定 將在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成的邊緣整齊的粉紅色菌落和在伊紅美蘭培養(yǎng)基上形成的有金屬光澤的黑色菌落作為疑似大腸桿菌,進(jìn)一步接種至大腸桿菌顯色培養(yǎng)基,同時(shí)進(jìn)行革蘭染色。挑取顯色培養(yǎng)基上的藍(lán)色菌落進(jìn)行生化鑒定,包括吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)。

1.6 小鼠攻毒試驗(yàn) 將大腸桿菌分離株分別接種LB培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)8 h,通過菌落計(jì)數(shù)測定菌液濃度,將BALB/c小鼠隨機(jī)分組,每組6只,其中試驗(yàn)組小鼠分別腹腔注射1×108CFU/mL的分離株培養(yǎng)液0.5 mL[4],陽性對照組小鼠腹腔注射1×108CFU/mL的K88菌液0.5 mL,陰性對照組小鼠腹腔注射1×108CFU/mL的BL21菌液0.5 mL,空白對照組小鼠腹腔注射LB培養(yǎng)基0.5 mL。各組小鼠隔離飼養(yǎng),觀察攻毒后5 d內(nèi)小鼠的臨床癥狀,及時(shí)剖檢全部死亡小鼠,觀察內(nèi)臟病理變化,并從肝臟取樣接種至大腸桿菌顯色培養(yǎng)基。

1.7 大腸桿菌毒力基因的PCR測定 參照參考文獻(xiàn)[5,6]設(shè)計(jì)毒力基因irp2、iucA、iucD、fimA、fimC、papA、papC、iutA、tsh、fyuA、iss、coIV、eaeA和vat的PCR擴(kuò)增引物,引物由華大基因有限公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系包括:2×TaqMaster Mix 12.5 μL,DNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,46～56 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃總延伸10 min,退火溫度根據(jù)引物不同進(jìn)行選擇。對大腸桿菌分離株、大腸桿菌工程菌K88、BL21和鼠傷寒沙門菌ATCC14028進(jìn)行上述14種毒力基因的PCR擴(kuò)增。

1.8 藥敏試驗(yàn) 選擇鏈霉素、慶大霉素、新霉素、安普霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉和氨芐西林共10種抗菌藥物進(jìn)行紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn),具體操作和結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照參考文獻(xiàn)[7]。藥敏試驗(yàn)結(jié)果用軟件GraphPad Prism 6.0和Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 分離菌的鑒定 將在SS瓊脂培養(yǎng)基上呈粉紅色、伊紅美蘭培養(yǎng)基上呈黑色帶金屬光澤、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上呈藍(lán)色的符合大腸桿菌生長特點(diǎn)的菌落進(jìn)行革蘭染色,將革蘭染色陰性短桿菌且吲哚試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)結(jié)果陽性、V-P試驗(yàn)和枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)結(jié)果陰性者,判定為大腸桿菌,共獲得大腸桿菌分離株28株。分離菌株按阿拉伯?dāng)?shù)字順序進(jìn)行編號,其中分離自卵黃的菌株以“E”和數(shù)字組合命名;分離自胎糞的菌株以“F”和數(shù)字組合命名。

2.2 小鼠攻毒試驗(yàn) 結(jié)果如表1所示,觀察期內(nèi),空白對照組和陰性對照組小鼠無異常情況;陽性對照組小鼠全部死亡;試驗(yàn)組除1株大腸桿菌分離株(F39)攻毒小鼠6只均正常存活外,其他試驗(yàn)組小鼠均出現(xiàn)不同數(shù)量死亡,其中有8株大腸桿菌分離株對小鼠的致死率是100%,有16株大腸桿菌分離株對小鼠的致死率是83.3%,有1株大腸桿菌分離株對小鼠的致死率是66.7%,有2株大腸桿菌分離株對小鼠的致死率是50.0%;從試驗(yàn)組和陽性對照組死亡小鼠肝臟取樣接種大腸桿菌顯色培養(yǎng)基,培養(yǎng)結(jié)果顯示,均獲得均勻一致的高純度藍(lán)色菌落。

表1 大腸桿菌小鼠攻毒試驗(yàn)Table 1 Mouse inoculation test of Escherichia coli

2.3 大腸桿菌毒力基因的PCR測定 PCR擴(kuò)增結(jié)果如表2所示,28株大腸桿菌攜帶irp2、iucA、iucD、fimA、fimC、iutA、tsh、fyuA、iss和coIV共10種毒力基因,總檢出率為71.4% (10/14);其中檢出率最高的毒力基因是fimC,檢出率為85.7%(24/28);另外9種毒力基因的檢出率介于3.6%(1/28)～64.3%(18/28)。papA、papC、eaeA和vat這4種毒力基因未檢出。本試驗(yàn)還檢測了大腸桿菌K88、BL21和鼠傷寒沙門菌ATCC14028的毒力基因攜帶情況,K88檢測到9種毒力基因,BL21只檢測到了fimA和fimC兩種毒力基因,鼠傷寒沙門菌ATCC14028沒有檢測到上述毒力基因,說明這14種毒力基因是大腸桿菌獨(dú)有的。由表1和表2的結(jié)果可知,共有20株菌株攜帶了2種以上(3～6種)毒力基因,其中19株菌株的致死率在83.0%以上,表明大腸桿菌菌株毒力基因的攜帶數(shù)量與大腸桿菌的致死率大致呈正相關(guān)。

表2 28株大腸桿菌分離菌株攜帶的毒力基因Table 2 Virulence genes carried by 28 E. coli isolated strains

2.4 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1所示,28株大腸桿菌分離株對10種抗菌藥物的敏感性差異較大,對多西環(huán)素(75.0%)、氟苯尼考(75.0%)、頭孢噻呋鈉(64.3%)、氨芐西林(89.3%)和鏈霉素(57.1%)耐藥率均超過50.0%,對恩諾沙星(50.0%)、新霉素(42.9%)、安普霉素(32.1%)、大觀霉素(17.9%)和慶大霉素(25.0%)耐藥率介于17.9%～50.0%。

圖1 大腸桿菌分離菌株對10種抗菌藥物的敏感性Fig.1 Sensitivity of E. coli isolated strains to 10 antibiotics

藥物的多重耐藥分析的雷達(dá)圖結(jié)果如圖2所示,通過比較分析不同大腸桿菌分離株對10種臨床常用抗菌藥物的耐藥情況可知,7耐和7耐以上有8株,占28.6%;5～6耐有11株,占39.3%;3～4耐有6株,占21.4%。由此可知,大腸桿菌分離株中5耐及5耐以上的菌株數(shù)量較多,多重耐藥現(xiàn)象明顯。

圖2 大腸桿菌分離菌株的多重耐藥性分析Fig.2 Multiple drug resistance analysis of E. coli isolated strains

3 討論

大腸桿菌的致病性與其攜帶的毒力基因具有緊密的相關(guān)性。致病性大腸桿菌感染宿主后,其攜帶的毒力基因之間相互協(xié)調(diào),如黏附相關(guān)基因、大腸桿菌素基因、血清抗性相關(guān)基因和溫度敏感性相關(guān)基因表達(dá),共同發(fā)揮致病作用,從而引起動(dòng)物發(fā)病[8]。小鼠攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示,有27株大腸桿菌分離株對小鼠有不同程度的致死性;毒力基因的PCR檢測結(jié)果顯示,不同菌株攜帶毒力基因的數(shù)量不一。fimC屬于Ⅰ型菌毛毒力基因,本試驗(yàn)中fimC基因的檢出率為85.7%,與Janben等[9]和孟慶美等[10]對fimC基因的檢測結(jié)果一致;本試驗(yàn)中大腸桿菌BL21和分離株F39沒有致病性,但都檢測到fimC基因,與王亞君等[11]報(bào)道的fimC基因幾乎只存在于高致病性大腸桿菌中有差異。iss和tsh是大腸桿菌的2個(gè)重要毒力基因,iss能夠提高細(xì)菌在宿主血清中的存活能力,tsh是黏附和蛋白水解相關(guān)的毒力基因,本試驗(yàn)分離到含有這2種毒力基因的13株大腸桿菌中有12株對小鼠致死率在83.0%以上,與已有的研究結(jié)果一致[2,12-14]。iutA是細(xì)菌獲得鐵的重要毒力基因,能夠使細(xì)菌在低鐵環(huán)境下生長。本試驗(yàn)分析結(jié)果顯示,致病性大腸桿菌至少含有3～6個(gè)與黏附、血清抗性、鐵攝取等相關(guān)的毒力基因。大腸桿菌毒力基因種類繁多,本試驗(yàn)只對14種毒力基因進(jìn)行了檢測,并不排除含有其他毒力基因的可能。此外,毒力基因檢測并不能作為判定大腸桿菌致病性的唯一標(biāo)準(zhǔn),需要結(jié)合臨床動(dòng)物試驗(yàn),亦有用雞胚接種來判定大腸桿菌致病性的報(bào)道[15]。

本試驗(yàn)分離的28株大腸桿菌對多西環(huán)素、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、氨芐西林和鏈霉素的耐藥率較高且多重耐藥現(xiàn)象明顯,通過溯源了解到與種雞場在飼養(yǎng)過程中經(jīng)常使用這上述幾種抗菌藥物有關(guān)。

本試驗(yàn)通過對雞胚源大腸桿菌致病性和耐藥性的分析,提示種雞場和孵化場應(yīng)重視對雞場的日常管理和孵化器的消毒工作,盡可能減少環(huán)境中的大腸桿菌,降低雞胚大腸桿菌的攜帶率,從而提高雛雞健康水平。另一方面,雞場在應(yīng)用抗菌藥物進(jìn)行治療時(shí),應(yīng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果以提高治療效果。本試驗(yàn)結(jié)果為種雞場加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和針對耐藥性有選擇地使用替抗產(chǎn)品提供了參考依據(jù)。