許曉琳 , 張 旻 , 景宏麗 , 陳冬杰 , 王慧煜 , 袁向芬 , 孔玉方 , 呂繼洲 , 吳紹強(qiáng)

(中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 , 北京 亦莊 100176)

雙線絳蟲(Digrammainterrupta)隸屬于雙線屬(Digramma),其第一中間宿主為橈足類,第二中間宿主為魚類,終宿主為捕食魚類的鳥類。雙線絳蟲裂頭蚴寄生在魚類腹腔內(nèi)并生長(zhǎng)發(fā)育,可達(dá)數(shù)十厘米甚至更長(zhǎng),導(dǎo)致魚腹部膨大,腹肌變薄,嚴(yán)重?cái)D壓魚體內(nèi)組織器官并迫使其萎縮,魚膘被壓迫而無(wú)法充氣,各個(gè)器官正常機(jī)能受抑制或遭破壞,用力擠壓,裂頭蚴可從胸鰭基部鉆出體外,雙線絳蟲裂頭蚴對(duì)于魚類健康和漁業(yè)養(yǎng)殖業(yè)具有嚴(yán)重危害,此外,感染有絳蟲裂頭蚴的魚被水禽吞食后,裂頭蚴可在水禽體內(nèi)發(fā)育為成蟲,對(duì)水禽的健康也會(huì)造成影響[1,2]。

雙線絳蟲裂頭蚴形態(tài)缺乏特征性,自然環(huán)境、地理位置等因素會(huì)造成不同種和株的不同形態(tài)特征,僅靠形態(tài)特征難以進(jìn)行物種鑒定,因此,對(duì)物種特定基因的核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、DNA序列多態(tài)性和同源性分析已經(jīng)成為鑒定物種和遺傳變異的有效且高分辨的方法[3,4]。核糖體DNA和線粒體DNA等分子標(biāo)記被廣泛應(yīng)用于寄生蟲的分子分類和系統(tǒng)進(jìn)化分析研究[5]。線粒體基因組具有母系遺傳、分子量小、易于提取、無(wú)重復(fù)序列和進(jìn)化速率快等優(yōu)點(diǎn)[6,7],目前已被廣泛應(yīng)用于絳蟲裂頭蚴的系統(tǒng)發(fā)育和分類學(xué)等方面研究[8,9]。本試驗(yàn)基于核基因(18S ribosomal RNA gene,18S rRNA)、細(xì)胞色素氧化酶I(Cytochrome oxidase subunit I,COI)和細(xì)胞色素B(Cytochrome B,COB)基因,對(duì)鯉魚腹腔內(nèi)寄生的蟲體進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序分析和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,鑒定本試驗(yàn)獲取的絳蟲裂頭蚴種類,以期為絳蟲種類的鑒定和分析提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 主要試劑PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0),購(gòu)自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司;組織DNA提取試劑盒,購(gòu)自QIAGEN公司;75%乙醇,購(gòu)自北京博奧匯玖生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 Veriti96 PCR儀,ABI公司產(chǎn)品;化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng),Protein Simple公司產(chǎn)品。

1.3 蟲體采集 從天津市某養(yǎng)殖場(chǎng)的1條活鯉魚的腹腔中收集到2條蟲體,蟲體均呈乳白色、扁平帶狀,形似面條,2條蟲體分別長(zhǎng)約11 cm和25 cm,寬約0.5～1.0 cm(圖1)。蟲體用清水沖洗干凈后置于75%酒精中浸泡固定,4 ℃條件下保存。

圖1 鯉魚腹腔內(nèi)獲得的“面條樣”蟲體Fig.1 The “noodle-like” parasites obtained from the Abdominal cavity of Cyprinus carpio

1.4 DNA的提取 在蟲體一端剪取約0. 5 cm3大小的組織塊,用無(wú)菌的研缽和研杵將其碾碎,置于無(wú)菌的1.5 mL離心管中,參照組織DNA提取試劑盒使用說(shuō)明書提取蟲體組織DNA。

1.5 PCR鑒定 參照關(guān)于絳蟲裂頭蚴分子鑒定的相關(guān)文獻(xiàn)[9,10],合成18S rRNA、COI和COB基因的PCR擴(kuò)增引物(表1),以1.4中提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(20 μL):PremixTaq10 μL,上、下游引物(濃度為10 μmol/L)各1 μL,模板DNA 1 μL,水7 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 變性30 s,60 ℃(18S rRNA)/56 ℃(COⅠ)/48 ℃(COB)退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)(電壓130V,時(shí)間20 min),通過(guò)化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

表1 PCR鑒定所用引物[9,10]Table 1 Primers used for PCR identification[9,10]

1.6 基因測(cè)序分析 陽(yáng)性PCR產(chǎn)物委托北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序,每個(gè)基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)峰圖分析和DNAMAN軟件分析比對(duì),確定擴(kuò)增的3個(gè)線粒體基因片段序列,將所得序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。采用https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.Cgi在線搜索同源序列,并分析核苷酸序列的同源性。

1.7 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 利用BLAST搜索并下載雙線屬(Digramma)、舌狀屬(Ligula)、裂頭屬(Diphyllobothrium)絳蟲的18S rRNA、COI和COB基因序列。利用MEGA X軟件對(duì)這些基因序列進(jìn)行分析,選擇鄰近法(Neighbor-Joining method,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分析不同分離株間的進(jìn)化關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 PCR鑒定和基因測(cè)序 PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示,成功擴(kuò)增出569、396和405 bp的18S rRNA、COⅠ和COB基因的目的片段。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,所得序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(18S rRNA基因登錄號(hào)為ON746752,COⅠ基因登錄號(hào)為ON746750,COB基因登錄號(hào)為ON746751)。將獲得的18S rRNA、COⅠ和COB基因序列進(jìn)行BLAST初步分析,3個(gè)基因序列均與雙線絳蟲同源性較高,其次為舌狀絳蟲,表明本試驗(yàn)獲得的蟲體為雙線絳蟲裂頭蚴。

圖2 絳蟲裂頭蚴18S rRNA、COI和COB基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of 18S rRNA,COI and COB genes of tapeworm plerocercoidM:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2 000; 1:18S rRNA基因; 2:COI基因; 3:COB基因M:DNA Marker DL2 000; 1:18S rRNA gene; 2:COI gene; 3:COB gene

2.2 基因同源性分析 將經(jīng)鑒定的18S rRNA、COI和COB基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中雙線絳蟲和舌狀絳蟲的3種基因序列分別進(jìn)行同源性比較。結(jié)果如表1所示,本試驗(yàn)獲得的絳蟲裂頭蚴的18S rRNA、COI和COB基因與雙線絳蟲的3個(gè)基因的核苷酸序列同源性均較高,可達(dá)93.00%以上,其中18S rRNA基因序列與雙線絳蟲分離株MN204040.1(中國(guó)安徽)、MH935206.1(韓國(guó))和AF254122.1(中國(guó)廣州)的核苷酸序列同源性分別為99.45%、99.27%和99.09%;COI基因序列與分離株MN219466.1(中國(guó)安徽)、NC_039446.1(中國(guó)武漢)和EU241311.1(法國(guó))的核苷酸序列同源性均為98.74%;COB基因序列與分離株EU241209.1(法國(guó))和NC_039446.1(中國(guó)武漢)的核苷酸序列同源性分別為99.26%和98.53%。結(jié)果表明,獲得的絳蟲裂頭蚴與我國(guó)的雙線絳蟲分離株核苷酸序列同源性較高。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析 基于18S rRNA、COI和COB基因構(gòu)建的進(jìn)化樹如圖3～5所示,裂頭屬(Diphyllobothrium)絳蟲基本構(gòu)成一個(gè)群而形成一大分支,本試驗(yàn)獲得的絳蟲裂頭蚴與雙線屬(Digramma)和舌狀屬(Ligula)絳蟲親緣關(guān)系較近。基于18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,本試驗(yàn)獲得的裂頭蚴與舌狀絳蟲中國(guó)青海分離株(KY321842.1)聚在同一小分支,且與雙線絳蟲韓國(guó)分離株(MH935206.1)和雙線絳蟲中國(guó)安徽分離株(MN204040.1)聚在同一大分支;基于COⅠ基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,本試驗(yàn)獲得的裂頭蚴與雙線絳蟲中國(guó)武漢分離株(NC_039446.1)和舌狀絳蟲法國(guó)分離株(EU241311.1)親緣關(guān)系較近,聚在同一分支,同時(shí),與包括英國(guó)分離株(MW602520.1)、芬蘭分離株(MZ359924.1)、中國(guó)武漢分離株(MT558599.1)、捷克分離株(JQ279103.1、KY552874.1)和土耳其分離株(OM760040.1)的其他舌狀絳蟲聚在同一大分支?；贑OB基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,本試驗(yàn)獲得的裂頭蚴與雙線絳蟲中國(guó)武漢分離株(NC_039446.1)聚在同一小分支,同時(shí)與舌狀絳蟲中國(guó)青海分離株(KY321843.1)和舌狀絳蟲中國(guó)武漢分離株(NC_039445.1)共聚在同一大分支。以上結(jié)果表明,本試驗(yàn)獲得的雙線絳蟲裂頭蚴與雙線絳蟲中國(guó)分離株(武漢)種屬親緣關(guān)系最近,在進(jìn)化上與其他地區(qū)的分離株的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。

圖3 基于18S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed based on 18S rRNA gene▲:本試驗(yàn)獲取得蟲株; 下同▲:The strain obtained in this study. The same as below

圖4 基于COI基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on COI gene

圖5 基于COB基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree constructed based on COB gene

3 討論

魚肉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,具有高蛋白和低脂肪的特點(diǎn),是人類攝取動(dòng)物性蛋白質(zhì)的重要來(lái)源之一。魚類感染了雙線絳蟲裂頭蚴后會(huì)影響其生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖,對(duì)魚類健康造成危害,而感染有絳蟲裂頭蚴的魚被水禽等吞食后,對(duì)水禽的健康也會(huì)造成影響,如果人類對(duì)寄生有絳蟲裂頭蚴的魚類處理不當(dāng)并食用,會(huì)對(duì)人類身體健康造成一定的危害和影響。實(shí)時(shí)發(fā)現(xiàn)并開展魚類體內(nèi)寄生蟲的系統(tǒng)發(fā)育分析,對(duì)了解寄生蟲的遺傳變異、分子結(jié)構(gòu)變化具有重要意義,有助于魚類寄生蟲的防控。

本試驗(yàn)利用18S rRNA、COI和COB基因?qū)︴庺~腹腔內(nèi)的寄生蟲體進(jìn)行了分析,鑒定該蟲體為雙線絳蟲裂頭蚴。本試驗(yàn)所取得蟲體的18S rRNA、COI和COB基因與雙線絳蟲的相關(guān)基因同源性較高,其中,核基因分子標(biāo)記18S rRNA顯示各分離株之間的變異小,線粒體分子標(biāo)記(COI和COB基因)顯示各分離株之間的變異相對(duì)大一些。而目前關(guān)于雙線絳蟲裂頭蚴的系統(tǒng)進(jìn)化和分子分類方面的研究較少,GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中雙線絳蟲COI和COB基因數(shù)量較少,本試驗(yàn)補(bǔ)充了雙線絳蟲裂頭蚴的分子分類和系統(tǒng)進(jìn)化分析研究的分子標(biāo)記(COI和COB基因)數(shù)據(jù)。

有研究表明,隨著地理位置、宿主特異性等因素的改變,物種的分子結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化,促使絳蟲種系進(jìn)化[11]。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹的分支狀況可以發(fā)現(xiàn),本試驗(yàn)分離的雙線絳蟲裂頭蚴在進(jìn)化上與中國(guó)分離株遺傳進(jìn)化距離較近,表明雙線絳蟲種系存在明顯的地理特異性。此外,雖然雙線絳蟲和舌狀絳蟲存在分支跨越,但是均聚在同一大分支上,明顯與其他屬種(裂頭屬)分開,類似的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果在其他研究中也有發(fā)現(xiàn),即不同地區(qū)的舌狀絳蟲和雙線絳蟲分離株聚在同一分支上[9,10,12]。對(duì)于上述系統(tǒng)進(jìn)化現(xiàn)象,有研究認(rèn)為將舌狀屬分為L(zhǎng)igulaBloch1782和DigrammaCholodkovsky1914 兩個(gè)屬的傳統(tǒng)分類方法存在爭(zhēng)議。在基因序列水平上,雙線屬與舌狀屬的28S rRNA和COⅠ基因序列相同,內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(Internal transcribed spacer,ITS1)和NADH脫氫酶亞基(NADH dehydrogenase 1,ND1)基因分別存在0.7%和7.4%的差異,同時(shí),28S rRNA、COⅠ、ITS1和ND1基因都具有高度的遺傳保守性,雙線屬與舌狀屬之間的這4個(gè)基因的遺傳差異較小,表明雙線屬可能不是獨(dú)立的屬[13]。也有研究認(rèn)為,雙線屬應(yīng)屬于舌狀屬,關(guān)于裂頭科中的雙線屬、舌狀屬和裂頭屬等分類需要重新修訂[14]。本試驗(yàn)的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析進(jìn)一步驗(yàn)證了雙線屬和舌狀屬親緣關(guān)系很近,雙線屬可能不是獨(dú)立的屬,而屬于舌狀屬。

本試驗(yàn)對(duì)鯉魚腹腔內(nèi)寄生的雙線絳蟲裂頭蚴的18S rRNA、COI和COB基因序列進(jìn)行了PCR鑒定和測(cè)序,分析了裂頭科常見屬種間的系統(tǒng)發(fā)育,比較了不同分離株核苷酸序列的同源性和進(jìn)化關(guān)系,為雙線絳蟲的鑒定和進(jìn)化分析提供更多的數(shù)據(jù)支持。