涂會鑫 , 董文龍

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院 , 吉林 吉林 132109)

細(xì)菌素(Bacteriocin)是由部分革蘭陽性菌和陰性菌在生長代謝過程中通過核糖體合成并分泌到環(huán)境中的一類具有抑菌活性的蛋白或多肽類物質(zhì),具有高效、安全、無毒和無殘留等特點,在新型天然抑菌劑研究和開發(fā)中具有巨大應(yīng)用潛力,可作為代替抗生素的新型抗菌藥物[1]。細(xì)菌素靶標(biāo)細(xì)胞對細(xì)菌素的抗性主要與靶細(xì)胞的膜成分有關(guān),很難在后代間傳遞[2],而抗生素耐藥性的產(chǎn)生則依賴于遺傳因素的變化[3]。乳酸菌(Lactic acid bacteria)是公認(rèn)的食品級微生物,已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)[4]。1988年,乳酸鏈球菌素(Nisin)首次作為食品添加劑得到美國食品藥物管理局的認(rèn)可[5]。乳酸菌細(xì)菌素可破壞靶細(xì)胞細(xì)胞膜,同時結(jié)合靶細(xì)胞細(xì)胞壁肽聚糖的前體類脂域,從而破壞靶細(xì)胞細(xì)胞壁的合成[6]。而抗生素主要通過阻斷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)、干擾DNA和RNA的復(fù)制等機(jī)制殺傷靶細(xì)胞[7]。

在前期研究中,作者從內(nèi)蒙古手工奶酪中分離得到1株具有良好熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性的Lacticaseibacillussaniviri(LS-1),其所產(chǎn)細(xì)菌素對金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性[8]。LS-1是一種具有作為新型替抗產(chǎn)品潛力的益生菌,但其細(xì)菌素編碼基因簇尚不明確。因此,本試驗對LS-1進(jìn)行全基因組測序(Whole genome sequencing,WGS),通過非冗余蛋白質(zhì)(Non-redundant protein,Nr)和基因本體(Gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組功能注釋,從基因組水平分析LS-1的功能基因,為菌株的基因改造提高細(xì)菌素發(fā)酵產(chǎn)率的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 菌株LS-1,從內(nèi)蒙古手工奶酪中分離獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS瓊脂培養(yǎng)基和LB肉湯培養(yǎng)基,均采購自青島海博股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化和培養(yǎng) 將于-80 ℃甘油保存的菌種LS-1接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,分離出單個菌落;再轉(zhuǎn)接至LB肉湯培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h,3 500 r/min離心60 min,收集菌體。

1.2.2 細(xì)菌基因組提取和測序 建庫和測序委托百邁克生物科技有限公司完成。提取菌株LS-1的高質(zhì)量基因組DNA,利用Nanodrop、Qubit和0.35%瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對其純度、濃度和完整性進(jìn)行檢測。濃度和純度達(dá)到測序要求后,使用BluePippin全自動核酸回收系統(tǒng)回收大片段DNA,構(gòu)建文庫。受損DNA經(jīng)過損傷和末端修復(fù)后,使用DNA黏合酶連接接頭,并使用磁珠提純DNA片段。完成DNA文庫制備,使用Qubit進(jìn)行濃度檢測,確保文庫的有效濃度,以保證文庫質(zhì)量,進(jìn)行Nanopore測序。

1.2.3 LS-1的基因組序列分析 使用Canu v1.5[9]軟件進(jìn)行LS-1的基因組組裝,并分析基因組組分。分別通過軟件Prodigal v2.6.3[10]、Infernal v1.1.3[11]、RepeatMasker v4.0.5[12]和IslandPath-DIMOB v0.2[13],進(jìn)行編碼基因、非編碼RNA(non-coding RNA)、重復(fù)序列和基因島的預(yù)測,并應(yīng)用軟件Circos v0.66[14]繪制基因組環(huán)狀圖。采用Nr數(shù)據(jù)庫[15]注釋物種信息,GO數(shù)據(jù)庫[16]注釋基因和蛋白質(zhì)功能。將LS-1的基因組序列上傳到次級代謝物基因簇數(shù)據(jù)庫BAGEL 4[17]進(jìn)行預(yù)測,點擊關(guān)注區(qū)域(Areas of interest,AOI)中的條目,查看預(yù)測到的基因簇并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 LS-1的基因組序列分析 整理組裝LS-1的完整序列,可知基因組全長為2 356 714 bp,GC含量為47.87%,拼接獲得LS-1基因組環(huán)狀圖(圖1)。LS-1的基因組有2 316個編碼基因,總長度為2 058 534 bp,最大長度為9 249 bp,最小長度為93 bp,平均長度為888 bp。重復(fù)序列總長度為1 899 bp,含量為0.08%;非編碼RNA含18個rRNA、66個tRNA和25個其他非編碼RNA。LS-1含有4個基因島,最大長度為28 772 bp,最小長度為5 740 bp。

圖1 LS-1基因組環(huán)狀圖Fig.1 Loop diagram of LS-1 genome第1圈:基因組大小; 第2圈:基因組正鏈的基因; 第3圈:基因組負(fù)鏈的基因; 第4圈:重復(fù)序列; 第5圈:tRNA和rRNA(藍(lán)色:tRNA; 紫色:rRNA); 第6圈:GC含量(淺黃色:GC>平均GC; 藍(lán)色:GC<平均GC); 第7圈:GC-skew(深灰色:G>C; 紅色:C>G)Round 1:Genome size; Round 2:Positive-strand genes in the genome; Round 3:Negative-strand genes in the genome; Round 4:Repeat sequence; Round 5:tRNA and rRNA (Blue:tRNA; Purple:rRNA); Round 6:GC content (Light yellow:GC>average GC; Blue:GCC; Red:C>G)

2.2 LS-1的基因注釋

2.2.1 Nr數(shù)據(jù)庫注釋 LS-1的Nr注釋結(jié)果見圖2,序列的物種分布情況為83.03%匹配到Lacticaseibacillussaniviri(Lactobacillussaniviri),此外,有3.82%的基因集中于Lactobacillus,有3.82%的基因?qū)儆谖锓N分布未知。

圖2 Nr注釋圖Fig.2 Nr annotation diagram

2.2.2 GO數(shù)據(jù)庫注釋 LS-1的GO注釋結(jié)果見圖3,GO功能注釋了560個基因,分別歸屬于細(xì)胞組分、分子功能和生物過程3個部分。存在1個與細(xì)胞組分相關(guān)的基因,10個與生物過程相關(guān)的基因,4個與分子功能相關(guān)的基因。

圖3 GO功能注釋圖Fig.3 GO functional annotation diagram

2.3 LS-1細(xì)菌素的編碼基因簇預(yù)測 如圖4所示,LS-1基因組中存在1個AOI,共計16個基因,其編碼的細(xì)菌素與III類細(xì)菌素Enterolysin A(EnlA)100%相同。LS-1的核心肽位于基因組的1 529 262～1 530 485 bp。啟動子在orf00009～orf00011之間和orf00015～orf00018之間。orf00012編碼穩(wěn)態(tài)反應(yīng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子A(Homeostatic response regulator transcription factor A,HsrA),orf00015編碼周質(zhì)寡肽結(jié)合蛋白(Periplasmic oligopeptide binding protein),orf00018編碼鏈霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶A(Streptothricin acetyltransferase A,SatA),orf00030編碼鈣轉(zhuǎn)運ATP酶1(Calcium transporting ATPase 1),orf00034編碼青霉素結(jié)合蛋白X(Penicillin-binding protein X,PbpX),orf00036編碼煙酸磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nicotinate phosphoribosyltransferase)。此外,含有3個ABC基因,編碼了2個未表征的ABC轉(zhuǎn)運蛋白(Uncharacterized ABC transporter)和1個硫胺素轉(zhuǎn)運蛋白(Thiamine transporter)。

圖4 LS-1細(xì)菌素的編碼基因簇Fig.4 Coding gene cluster of LS-1 bacteriocin

3 討論

WGS可對未知物種進(jìn)行基因組測序,以此獲得該物種的完整基因組序列,并通過基因組裝和序列分析,挖掘出目標(biāo)基因組。張歡暢等通過基因組裝分析了2株植物乳桿菌的全基因組信息,發(fā)現(xiàn)了1段細(xì)菌素合成相關(guān)基因簇[18]。王娜娜等研究發(fā)現(xiàn),高產(chǎn)細(xì)菌素優(yōu)良菌株KLDS 4.0325具有2個細(xì)菌素合成基因簇[19]。本試驗根據(jù)全基因組預(yù)測結(jié)果,獲知LS-1有1個細(xì)菌素合成基因簇。

細(xì)菌素主要被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三類,其中Ⅲ類細(xì)菌素是一類分子量大且熱不穩(wěn)定的細(xì)菌素,如彎曲乳桿菌、益生乳酸菌和糞腸球菌產(chǎn)生的Helveticin M、Helveticin J和EnlA[20]。EnlA是腸球菌屬最早發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)菌素,屬于Ⅲ類細(xì)菌素,具有廣泛的抑制譜[21]。EnlA不僅僅存在于腸球菌屬,還部分存在于乳酸菌屬中。Zhang 等利用NCBI數(shù)據(jù)庫篩選EnlA的氨基酸序列用于設(shè)計引物,其中6種氨基酸序列來自乳酸菌[22]。乳酸菌分泌的大多數(shù)細(xì)菌素是肽和蛋白質(zhì),其可破壞敏感菌株的細(xì)胞膜。細(xì)胞壁是革蘭陽性細(xì)菌的重要保護(hù)層,有助于維持細(xì)胞形狀和大小,并防止?jié)B透性裂解[23]。在細(xì)胞壁被破壞后,細(xì)胞膜不能再承受細(xì)胞內(nèi)部高達(dá)25個大氣壓的膨脹,導(dǎo)致細(xì)胞裂解[24]。Khan等在Lactococcuslactisssp. crmoris 2144的細(xì)胞懸液中加入純EnlA,發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)迅速下降[25]。Nilsen 等在純化的LactococcuslactisIL1403和EnterococcusfaeciumCTC492細(xì)胞壁中加入EnlA也有類似結(jié)果[26]。這些結(jié)果表明,EnlA是一種細(xì)胞壁降解細(xì)菌素,可通過裂解細(xì)胞壁肽聚糖單體而殺死敏感菌株的細(xì)胞。此外,Khan等還發(fā)現(xiàn),EnlA能切割肽聚糖單體,第1個作用位點在短肽的L-丙氨酸和D-谷氨酸之間,第2個作用位點在短肽的L-賴氨酸和肽橋的D-天冬氨酸之間[25]。本試驗在LS-l中發(fā)現(xiàn)了1個細(xì)菌素合成相關(guān)基因簇,推斷菌株LS-1可通過合成并分泌細(xì)菌素EnlA來抑制金黃色葡萄球菌生長。

綜上,本試驗采用全基因組測序技術(shù)對1株可拮抗金黃色葡萄球菌的LS-1進(jìn)行全基因組測序分析,并利用數(shù)據(jù)庫BAGEL 4預(yù)測細(xì)菌素基因簇,發(fā)現(xiàn)LS-1的細(xì)菌素屬于Ⅲ類細(xì)菌素EnlA,可能通過裂解細(xì)胞壁肽聚糖單體而殺死敏感菌株。細(xì)菌素EnlA對金黃色葡萄球菌的具體抑菌作用機(jī)制,還需進(jìn)一步研究。