劉 莉 , 陸 輝 , 蔡高峰 , 武彩紅 , 李 玲 , 陳曉蘭 , 張雪麗

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 , 江蘇 泰州 225300 ; 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 , 江蘇 南京 210095)

茶樹菇是一種食藥兼用真菌,隸屬真菌門,學(xué)名為柱狀田頭菇,因其生長在油茶樹的枯干上而得名為茶樹菇[1]。茶樹菇不僅是營養(yǎng)豐富的滋補佳品,而且具有扶正強體作用,享有“中華神菇”“菌中之冠”之美稱[2]。自20世紀90年代茶樹菇被列為珍稀菇品開發(fā)以來[3],目前成本低、產(chǎn)量高的茶樹菇栽培方法業(yè)已成熟,為茶樹菇的應(yīng)用和開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

多糖是菌菇中含量最豐富的活性成分之一,在菌絲體、子實體和發(fā)酵液中均可獲得[4]。菌菇多糖因具有降血糖、降血脂、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等生物活性,在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中備受關(guān)注[5]。在國際上,具有食藥用價值的菌菇多糖更是被稱為“生物應(yīng)答效應(yīng)物”[6]。

茶樹菇多糖(Agrocybaegeritapolysaccharid,AAP)的主要成分為蛋白多糖,由葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖等組成[7,8]。研究表明,AAP具有較強的抗氧化能力,可清除活性氧自由基[9-11]。陳少英等[4]研究也表明,3種不同方法提取的AAP經(jīng)灌喂給藥,小鼠血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性增加和肝臟中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量降低均與對照組存在顯著差異,證明AAP具有抗氧化活性。徐靜娟等[12]對荷瘤小鼠進行研究,發(fā)現(xiàn)AAP對荷瘤小鼠S180移植肉瘤和S180腹水瘤具有抑制作用,且可提高人工免疫抑制小鼠的白細胞數(shù)。也有學(xué)者對AAP的免疫功能進行了研究,發(fā)現(xiàn)其可以促進小鼠的特異性免疫應(yīng)答和非特異性免疫應(yīng)答[13],增加正常小鼠的脾臟重量,提高小鼠巨噬細胞的吞噬能力[8]。

目前,相對于其他菌菇多糖,AAP的研究較為缺乏,AAP免疫調(diào)節(jié)作用的機制還不清楚。鑒于此,本試驗以常用的小鼠巨噬細胞為研究對象,探討AAP對其表面分子抗原分化簇80(Cluster of differentiation 80,CD80)和86(Cluster of differentiation 86,CD86)及白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和一氧化氮(Nitrogen oxide,NO)表達的影響,為進一步闡明AAP的免疫功能和作用機制提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 SPF級6周齡ICR小鼠,購自揚州大學(xué)實驗動物中心[SCXK(蘇)2022—0009],自由采食和飲水。遵照江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定和要求進行飼養(yǎng)管理。

1.2 主要試驗藥物和材料 RAW264.7(小鼠巨噬細胞),購自美國細胞培養(yǎng)物收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC細胞庫)。RPMI1640培養(yǎng)基、FBS胎牛血清、胰酶和雙抗,均購自Gibico公司;DMEM高糖培養(yǎng)基,購自上海源培生物科技有限公司;Mouse-IL-1β、Mouse-IL-6和Mouse-TNF-α ELISA檢測試劑盒,均購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司;異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的CD80(FITC-CD80)和藻紅蛋白(Pphycoerythrin,PE)標記的CD86(PE-CD86),均購自eBioscience公司;NO檢測試劑盒,購自南京建成生物工程有限公司。

1.3 主要儀器和設(shè)備 精密電子天平(FA1104N),上海精密科學(xué)儀器有限公司;磁力攪拌器(85-1),上海志威電器有限公司;流式細胞儀(BD-C6),BD FACSVverse公司;BioTek Epoch全波長酶標儀,BioTek Instruments公司;CO2培養(yǎng)箱(SC010W-2),Revco公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 AAP提取 AAP與石油醚按1∶3(體積比)于60 ℃水浴加熱進行脫脂;過濾后濾渣與乙醇按1∶3(體積比)于80 ℃水浴,以除去小分子的醇溶物;過濾后再將濾渣與水按1∶10(體積比)提取2次,過濾后合并濾液并濃縮。在濾液中加入一定量無水乙醇至最終醇濃度為80%,進行醇沉,收集沉淀,分別用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌,真空干燥,得粗多糖(AAP)。使用時用RPMI1640完全培養(yǎng)液溶解。

1.4.2 RAW264.7細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和2%雙抗)于培養(yǎng)箱中(37 ℃、5%CO2)培養(yǎng),當細胞融合度達到90%時,用0.25%胰酶EDTA溶液消化細胞,取細胞進行后續(xù)試驗。

1.4.3 AAP對RAW264.7細胞的安全濃度 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞(生長至90%融合度)用0.25%胰酶消化,完全培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細胞密度至1.0×106個/mL;將細胞懸液加到96孔細胞板中,100 μL/孔,每孔加入100 μL含不同濃度AAP的無菌完全培養(yǎng)液,終濃度依次為2 000、1 000、500、250、125、62.50、31.25、15.63 和7.81 μg/mL,每個濃度6個重復(fù)孔,以完全培養(yǎng)液作為空白對照組。在37.5 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后加入15 μL 四甲基偶氮唑藍(Methylthiazolyl tetrazolium,MTT),4 h后棄去上清,加入100 μL二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),微量振蕩器振蕩5 min,于570 nm波長處檢測各孔的吸光度(Optical density,OD)值,按公式(1)計算RAW264.7細胞活力。以巨噬細胞活力小于空白對照組的濃度為AAP的最大安全濃度。

細胞活力(%)=AAP組OD570 nm÷空白對照組OD570 nm×100%

(1)

1.4.4 分組與處理 試驗共設(shè)5個組,分別為空白對照(CON,DMEM完全培養(yǎng)液)組、AAP低劑量(AAP-Low,AAPL,50 μg/mL)組、AAP中劑量(AAP-Mid,AAPM,100 μg/mL)組、AAP高劑量(AAP-High,AAPH,200 μg/mL)組和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,50 ng/mL)組,每組重復(fù)4個孔,將細胞板置于5% CO2、37.5 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.4.5 AAP對RAW264.7細胞表面分子表達的影響 將各組細胞吹打均勻后轉(zhuǎn)入離心管離心(4 000 r/min,5 min),收集細胞,PBS洗滌細胞1次,然后加入FITC-CD80和PE-CD86抗體各1 μL,避光條件下吹打混勻后置于4 ℃孵育30 min;再用PBS離心(4 000 r/min,5 min)洗滌細胞2次,避光條件下進行流式檢測。

1.4.6 AAP對RAW264.7細胞因子表達的影響 收集細胞上清液,按ELISA檢測試劑盒說明書操作檢測細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NO含量。

2 結(jié)果

2.1 AAP對RAW264.7細胞的安全濃度 結(jié)果如圖1所示,AAP濃度在15.63～125 μg/mL范圍時,細胞活力均高于空白對照組,結(jié)果表明,AAP濃度高于250 μg/mL時才會對RAW264.7細胞產(chǎn)生一定的毒性,因此,選擇濃度低于250 μg/mL AAP進行后續(xù)試驗。

圖1 AAP對RAW264.7細胞活力的影響Fig.1 Effects of AAP on RAW264.7 cell viability

2.2 AAP對RAW264.7細胞表面分子CD80和CD86表達的影響 不同濃度AAP與RAW264.7細胞作用24 h后,用細胞表面分子相應(yīng)的熒光抗體進行標記,流式細胞術(shù)檢測CD80+和CD86+細胞百分比,結(jié)果如圖2所示,與CON組相比,除AAPL組外(P>0.05),AAPM組、APPH組和LPS組RAW264.7細胞的表面分子CD80的表達均顯著升高(P<0.01或P<0.001),所有AAP組和LPS組RAW264.7細胞的表面分子CD86的表達均顯著升高(P<0.01或P<0.001)。AAP中、高劑量均可顯著提高CD80+和CD86+細胞比例,且APPH組表達優(yōu)于AAPM組。結(jié)果表明,適當濃度AAP可以顯著活化RAW264.7細胞,且呈劑量依賴性。

圖2 AAP對RAW264.7表面分子CD80和CD86表達的影響Fig.2 Effects of AAP on expressions of cell surface molecule CD80 and CD86 in RAW264.7 cellsA:RAW264.7表面分子CD80流式細胞圖; B:RAW264.7表面分子CD86流式細胞圖; C:CD80+細胞所占比例; D:CD86+細胞所占比例與空白對照組相比,*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001;下同A:Flow cytometry of RAW264.7 surface molecule CD80; B:Flow cytometry of RAW264.7 surface molecule CD86; C:Ratio of CD80+ cells; D:Ratio of CD86+ cells Compared with the CON group,*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001. The same as below

2.3 AAP對RAW264.7細胞因子表達的影響 不同濃度AAP與RAW264.7細胞作用24 h后,收集細胞上清,檢測細胞因子的表達水平,結(jié)果如圖3所示,與CON組相比,AAPH組IL-1β表達水平顯著增加(P<0.01),AAPM組和AAPH組IL-6表達水平增加具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);AAPL組、AAPM組和AAPH組分泌的TNF-α均極顯著增加(P<0.001);AAPM組和AAPH組釋放的NO增加也具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且后者差異顯著(P<0.01);LPS組也可顯著提高RAW264.7細胞分泌的IL-1β、IL-6和TNT-α以及釋放的NO(P<0.01或P<0.001)。結(jié)果表明,AAP可以顯著提高RAW264.7細胞因子的表達和NO的釋放能力,且呈劑量依賴性。

圖3 AAP對RAW264.7細胞IL-1β(A)、IL-6(B)、TNF-α(C)和NO(D)濃度的影響Fig.3 Effects of AAP on concentrations of IL-1β(A),IL-6(B),TNF-α(C)and NO(D) in RAW264.7cells

3 討論

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞,具有抗原呈遞、調(diào)節(jié)T細胞和B細胞免疫等作用[14],常常作為評價活性成分的免疫調(diào)節(jié)能力的重要載體[15]。研究表明,巨噬細胞受到LPS刺激后,其表面的共刺激分子CD80和CD86會高表達[16]。同時,LPS刺激巨噬細胞,可促進IL-1β、IL-6、TNF-α和NO等細胞因子表達,進而激發(fā)免疫應(yīng)答[17]。細胞因子對CD80和CD86的表達也具有調(diào)節(jié)作用[16]。因此,利用LPS刺激巨噬細胞是進行藥物機制研究的良好模型[18]。本試驗以小鼠巨噬細胞RAW264.7為模型,以LPS為陽性對照,研究AAP對RAW264.7細胞CD80和CD86的表達及細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NO等表達的調(diào)節(jié)作用。

CD80和CD86是巨噬細胞活化的標志分子,屬于免疫球蛋白超家族成員[19],CD86作為CD80的配體,二者共同調(diào)節(jié)T細胞活化,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[20]。在抗原遞呈細胞(Antigen-presenting cells,APC)中,協(xié)同刺激分子CD80和CD86最具有特征,二者無論發(fā)生質(zhì)變還是量變,均會影響巨噬細胞抗原提呈能力,影響免疫功能[16]。本試驗結(jié)果顯示,與CON組比較,AAP組均可提高CD80+和CD86+細胞的比例,且AAPH組的CD80+細胞百分比以及AAPM組和AAPH組的CD86+細胞百分比均高于LPS組,說明AAP對巨噬細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用,并呈一定的劑量依賴性。

研究表明,植物多糖不僅可刺激巨噬細胞表面分子的表達,而且可誘導(dǎo)巨噬細胞分泌細胞因子,從而通過免疫調(diào)節(jié)作用提高機體的免疫力[21]。IL-1β、IL-6和TNF-α是由巨噬細胞產(chǎn)生的最具代表性的細胞因子,可參與機體免疫應(yīng)答[22,23]。NO是重要的信使分子,其合成和釋放的增加是說明巨噬細胞被激活并參與免疫反應(yīng)的一個重要指標[24]。NO也可刺激TNF-α、IL-6和IL-1β等細胞因子的分泌[25]。本試驗結(jié)果也顯示,AAP不僅可刺激RAW264.7細胞表面分子CD80和CD86的表達,而且可誘導(dǎo)RAW264.7分泌IL-1β、IL-6、TNF-α和NO,并表現(xiàn)出劑量依賴性。Yang等[26]研究也表明,生姜多糖可誘導(dǎo)巨噬細胞分泌NO、TNF-α、IL-1β和IL-6等發(fā)揮免疫作用的細胞因子。劉蘇等[27]對5種食用菌多糖的免疫活性進行比較研究,發(fā)現(xiàn)平菇多糖、茶樹菇多糖、香菇多糖、木耳多糖和金針菇多糖5種食用菌多糖均可刺激小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO,分泌TNF-α和IL-1β。這些研究成果均與本試驗結(jié)果一致。Lee等[28]研究表明,多糖可有效激活巨噬細胞,使其分化為 M1巨噬細胞。NO和促炎因子分泌增加以及參與啟動免疫,則是M1巨噬細胞的典型特征。

綜上所述,推測AAP通過激活小鼠巨噬細胞RAW264.7,刺激其分化為M1巨噬細胞,上調(diào)共刺激分子CD80和CD86表達,進一步促進IL-1β、IL-6、TNF-α和NO的表達,參與免疫調(diào)節(jié)。AAP能提高小鼠體外巨噬細胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)活性,并且當AAP濃度為200 μg/mL時,不僅能顯著上調(diào)巨噬細胞表面分子CD80和CD86的表達,而且能顯著促進細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌和NO的釋放。表明AAP具有提高小鼠巨噬細胞RAW264.7免疫能力的作用。該結(jié)果對于AAP的臨床應(yīng)用和開發(fā)具有一定的參考價值。