王紅濤 , 李大吉 , 李昕芮 , 李孝桓 , 王佳園 , 劉彥驕 , 王冠一 , 鄒 雪 , 白 鑫

(1. 通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 , 吉林 通化 134002 ; 2. 白城師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 , 吉林 白城 137000)

鎘(Cadmium,Cd)廣泛存在于水、土壤和空氣環(huán)境中,可沿食物鏈進入水生生物體內(nèi),導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙、造血功能異常和生長抑制等癥狀[1-3]。有調(diào)查顯示,在我國一些河流中懸浮物的Cd濃度超過0.187 μg/g[4]。水產(chǎn)品是人類重要的蛋白質(zhì)來源,隨著食物鏈的富集,水產(chǎn)品中Cd超標風(fēng)險越來越大。

目前,在畜牧業(yè)中對于慢性重金屬暴露的減毒主要方式是在飼料中添加維生素、益生菌和必需金屬[5]。硒(Selenium,Se)作為生物體必需的微量元素,在人類和動物的生理功能中發(fā)揮著有益的作用[6]。研究表明,有機硒比無機硒具有更高的吸收效率和更低的生物毒性[7]。此外,多糖(Polysaccharide)在魚類重金屬減毒中也具有較好的效果[8]。黑木耳對于無機硒具有較高的富集和轉(zhuǎn)化作用,其中提取的硒多糖具有抗氧化、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫等作用[9]。然而,對于硒多糖(Se-polysaccharide)在魚類重金屬暴露后的減毒作用的研究較少,有關(guān)富硒黑木耳硒多糖和未富硒黑木耳多糖在魚類重金屬暴露后的減毒作用研究更少。本試驗分別提取富硒黑木耳硒多糖(AuriculariaauriculaSe-polysaccharide,APSe)和未富硒黑木耳多糖(Auriculariaauriculapolysaccharide,AP),將其加入鎘暴露鯉魚日糧中,探究其對鎘暴露鯉魚組織Cd積累、血液指標、神經(jīng)遞質(zhì)和生長指標的影響,以期為鯉魚慢性鎘暴露解毒提供治療策略。

1 材料與方法

1.1 主要材料 富硒黑木耳,由通化師范學(xué)院試驗基地種植;富硒黑木耳硒多糖和未富硒黑木耳多糖均由通化師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院教研室采用醇提法富集制備(純度均>97%)。富硒黑木耳硒多糖和未富硒黑木耳多糖基礎(chǔ)信息如表1所示。氯化鎘(CdCl2·2.5H2O),購自國藥集團化學(xué)試劑公司;65%HNO3、蒽酮、苯酚、濃硫酸和乙醇均為分析純,購自天津化工有限公司。血紅蛋白測定、Na+/K+-ATP酶和乙酰膽堿酯酶試劑盒,均購自南京建成生物有限公司。

表1 富硒黑木耳硒多糖和未富硒黑木耳多糖基礎(chǔ)信息Table 1 Basic information of selenium-enriched Auricularia auricula selenium-polysaccharides and non-selenium-enriched Auricularia auricula polysaccharides

1.2 主要儀器 電子天平,上海精密儀器儀表有限公司產(chǎn)品;火焰原子吸收分光光度計,日本島津公司產(chǎn)品;高效液相儀,株式會社日立制作所公司產(chǎn)品;生物學(xué)顯微鏡,奧利巴斯公司產(chǎn)品。

1.3 試驗動物 鯉魚,購自吉林某水產(chǎn)養(yǎng)殖公司。鯉魚(約54 g)轉(zhuǎn)入實驗室后,放入玻璃缸中,馴化2周。水環(huán)境基本信息:溶解氧(6.69±0.61)mg/L,pH(6.8±0.2),氨<0.48 mg/L,亞硝酸鹽<0.05 mg/L,溫度(23±2)℃,光周期14 h/10 h。

1.4 試驗設(shè)計 選取540條馴化后的鯉魚,隨機分成6個組(每組6個缸,每個缸15條),分別為對照(Control,CK)組、富硒黑木耳硒多糖(APSe,基礎(chǔ)日糧中添加3 g/kg APSe和8.1 μg/kg Se)組、未富硒黑木耳多糖(AP,基礎(chǔ)日糧中添加3 g/kg AP)組、鎘暴露(Cd,水中添加1 mg/L Cd)組、鎘暴露富硒黑木耳硒多糖(APSeCd,水中添加1 mg/L Cd;基礎(chǔ)日糧中添加3 g/kg APSe和 8.1 μg/kg Se)組和鎘暴露未富硒黑木耳多糖(APCd,水中添加1 mg/L Cd 和基礎(chǔ)日糧中添加3 g/kg AP)組。日糧中Se的實際水平為8.0 μg/kg。水中Cd的實際水平是1.012 mg/L。每天飼喂2次(8:00和16:00),飼喂量為體重的3%,持續(xù)60 d。

1.5 樣品采集 采樣前禁食24 h。分別在試驗30 和60 d時,于每個魚缸中隨機選擇6條鯉魚,使用300 mg/L甲烷磺酸鹽-222(MS-222)進行麻醉,采集脾臟、肝臟、鰓、腎臟、大腦、肌肉和血液樣本。所有樣品在液氮中冷凍后,放于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標檢測

1.6.1 組織Cd濃度檢測 在試驗30和60 d時,分別檢測脾臟、肝臟、鰓、腎臟、大腦、肌肉和血液中的Cd濃度。具體方法:稱量3 g組織或1 mL血液,取5倍體積的65% HNO3,與組織或血液一起放入消化管中,65 ℃下消化48 h,對消化管進行定容,蒸餾水作為對照,采用火焰原子吸收分光光度法測定Cd濃度。

1.6.2 血液指標檢測 在試驗30和60 d時,血液樣本中紅細胞(Red blood cell,RBC)和白細胞(White blood cell,WBC)數(shù)量使用生物學(xué)顯微鏡計數(shù);血紅蛋白含量采用氰化高鐵蛋白(Haemiglobincyanide,HiCN)比色法,按照血紅蛋白測定試劑盒說明書進行測定。

1.6.3 神經(jīng)遞質(zhì)檢測 在試驗30和60 d時,大腦樣本中Na+/K+-ATP酶和乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)含量按照試劑盒說明書進行測定;多巴胺(Dopamine,DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量通過高效液相色譜法進行測定,方法參照參考文獻[10]。

1.6.4 生長指標測定 在試驗60 d時,測定生長指標,包括:初始體重(Initial weight,IW)、終末體重(Finial weight,FW)、增重(Weight gain,WG)、肝胰臟重量(Hepatosomatic wight,HW)、肝胰臟指數(shù)(Hepatosomatic index,HPI)、采食量(Feed intake,FP)、生長速率(Specific growth rate,SGR)和飼料轉(zhuǎn)化率(Feed conversion ratio,FCR)。

計算方法如下:

WG(g)= FW-IW

1.7 數(shù)據(jù)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析,各組間比較采用單因素方差分析和兩兩比較的Turkey檢驗,數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差(Mean±SD)”表示,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織Cd濃度檢測 結(jié)果如表2所示,在試驗30和60 d時,與CK組相比,Cd組、APSeCd組和APCd組脾臟、肝臟、鰓、腎臟、大腦和肌肉中Cd濃度顯著提高(P<0.05);與Cd組相比,APCd組和APSeCd組脾臟、肝臟、鰓、腎臟、大腦和肌肉中Cd濃度顯著降低(P<0.05);與APCd組相比,APSeCd組脾臟、肝臟、鰓、腎臟、大腦(60 d除外)和肌肉中Cd濃度顯著降低(P<0.05)。

表2 APSe和AP對鯉魚Cd暴露組織中Cd濃度的影響Table 2 Effects of APSe and AP on Cd concentration in carp tissues exposed to Cd (μg/g)

2.2 血液指標檢測 結(jié)果如圖1所示,在試驗30和60 d時,與CK組相比,Cd組、APSeCd組和APCd組血液中Cd濃度和白細胞數(shù)量顯著增加(P<0.05),紅細胞數(shù)量和血紅蛋白含量顯著降低(P<0.05);與Cd組相比,APSeCd組和APCd組血液中Cd濃度和白細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05),血紅蛋白含量顯著增加(P<0.05),紅細胞數(shù)量無顯著變化(P>0.05);與APCd組相比,APSeCd組血液中Cd濃度和白細胞數(shù)量顯著降低(P<0.05),紅細胞數(shù)量和血紅蛋白含量無顯著變化(P>0.05)。

圖1 APSe和AP對鯉魚Cd暴露血液指標的影響Fig.1 Effects of APSe and AP on blood indicators in carp exposed to Cd同試驗時期數(shù)據(jù)標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),標有相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05);下圖同During the same experimental period,data labeled with different lowercase letters indicated significant differences (P<0.05),while data labeled with the same lowercase letters indicated no significant differences (P>0.05). The same as the following figure

2.3 神經(jīng)遞質(zhì)檢測 結(jié)果如圖2所示,在試驗30和60 d時,與CK相比,Cd組、APSeCd組和APCd組大腦中Na+/K+-ATP酶、AChE、DA和5-HT含量均顯著降低(P<0.05);與Cd組相比,APSeCd組和APCd組大腦中Na+/K+-ATP酶、AChE、DA和5-HT含量均顯著升高(P<0.05)。與APCd組相比,APSeCd組大腦中Na+/K+-ATP酶、AChE、DA和5-HT含量均顯著升高(P<0.05)。

圖2 APSe和AP對鯉魚Cd暴露神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響Fig.2 Effects of APSe and AP on neurotransmitter contents in carp exposed to Cd

2.4 生長指標測定 結(jié)果如表3所示,與CK組相比,APSe組和AP組FW指標顯著升高(P<0.05);Cd組、APSeCd組和APCd組FW、HPI和SGR指標均顯著降低(P<0.05);FCR指標顯著提高(P<0.05)。與Cd組相比,APCd組和APSeCd組生長表現(xiàn)差異不顯著(P>0.05)。

表3 APSe和AP對鯉魚Cd暴露生長性能的影響Table 3 Effects of APSe and AP on growth performance in carp exposed to Cd [n(%)]

3 討論

食用菌作為藥食兩用的菌類,在我國使用已經(jīng)超過千年歷史,研究表明,食用菌多糖是食用菌的主要活性物質(zhì),具有抗氧化、抗癌和調(diào)節(jié)免疫等作用[11]。Se作為身體的必需微量元素,適當(dāng)補充可以提升機體健康狀態(tài)。此外,有機硒的利用度顯著高于無機硒。本試驗提取富硒黑木耳硒多糖和未富硒黑木耳多糖,通過硒多糖或多糖飼喂鎘暴露鯉魚,結(jié)果顯示,硒多糖和多糖均能夠顯著降低組織和血液中鎘濃度(P<0.05)、提高血紅蛋白含量(P<0.05)、降低白細胞數(shù)量(P<0.05)、提高大腦中AChE、DA、Na+/K+-ATP酶和5-HT含量(P<0.05),具有減少Cd毒性的潛力。

盡管水體中Cd濃度很低,但是通過食物鏈的富集作用,魚類很容易獲得較高濃度的Cd。Wang等研究發(fā)現(xiàn),對鯉魚進行鎘暴露后,其組織Cd濃度依次為腸>腎臟>肝臟>鰓>肌肉[12]。本試驗結(jié)果顯示,鎘暴露會顯著增加組織中Cd濃度,其組織積累依次為腎臟>肝臟>脾臟>鰓>大腦>肌肉,腎臟可能為主要靶器官。研究表明,在魚類日糧中添加多糖或硒能夠有效降低組織中毒性金屬的濃度。Zhao等研究發(fā)現(xiàn),蒲公英多糖能夠顯著降低烏鱧鉻暴露后組織中鉻含量[13]。Zhou等研究發(fā)現(xiàn),富硒螺旋藻硒多糖能夠顯著降低鎘暴露造成的大鼠氧化應(yīng)激損傷,有效降低Cd毒性,且效果優(yōu)于無機硒(亞硒酸鈉)[14]。本試驗結(jié)果顯示,富硒黑木耳硒多糖和未富硒黑木耳多糖均能顯著降低鯉魚鎘暴露后組織中Cd濃度,且硒多糖效果更好,可能是由于多糖能夠與Cd螯合形成螯合物,降低了Cd的吸收[15],而硒多糖本身就為多糖,此外其中的有機硒能夠競爭金屬轉(zhuǎn)運蛋白進而減少Cd的吸收[16],因此表現(xiàn)出優(yōu)于多糖的效果。

血液是機體運輸營養(yǎng)物質(zhì)的重要載體,重金屬會隨著血液被運往機體各組織器官。本試驗結(jié)果顯示,鎘暴露后血液中Cd濃度顯著增加。有研究表明,重金屬會導(dǎo)致動物紅細胞破裂,導(dǎo)致血紅蛋白減少[17]。鎘暴露會導(dǎo)致機體出現(xiàn)貧血,主要由于減少了機體對鐵的吸收,進而降低了血紅蛋白含量。Yin等研究發(fā)現(xiàn),鯽魚鉛暴露4周后,其紅細胞數(shù)量和血紅蛋白含量顯著降低[18]。郝卓璐等研究發(fā)現(xiàn),小鼠納米鎘暴露后,血液紅細胞數(shù)量和血紅蛋白含量顯著降低、白細胞數(shù)量顯著提高[19]。本試驗結(jié)果顯示,與Cd組相比,APCd組和APSeCd 組雖然紅細胞數(shù)量沒有顯著變化(P>0.05),但是血紅蛋白含量顯著增加(P<0.05),這暗示著紅細胞的功能得到了一定的提升。此外,本試驗中,鎘暴露后鯉魚血液中白細胞數(shù)量顯著增加,而富硒黑木耳硒多糖或未富硒黑木耳多糖均可顯著降低白細胞數(shù)量,表現(xiàn)出降低炎癥的作用,這與多糖和有機硒可減輕炎癥反應(yīng)研究結(jié)果一致[20,21]。

魚類生長發(fā)育的過程中,重金屬暴露會影響其神經(jīng)系統(tǒng),并對其生長發(fā)育造成一定的負面影響[22]。AChE能夠催化乙酰膽堿分解,以維持正常的乙酰膽堿含量。Cai等研究發(fā)現(xiàn),鯉魚鎘暴露后,大腦中AChE活性顯著降低,此外,鯉魚生長受到顯著抑制[23]。Ping等研究發(fā)現(xiàn),斑馬魚鎘暴露后,大腦中DA含量顯著降低,甲狀腺系統(tǒng)也會被破壞,同時斑馬魚的生長發(fā)育會受到抑制[24]。本試驗結(jié)果顯示,鯉魚鎘暴露后,AChE含量顯著降低,而富硒黑木耳硒多糖或未富硒黑木耳多糖均能夠顯著提高鯉魚AChE含量,這對于調(diào)節(jié)突觸間隙中的乙酰膽堿含量具有重要作用。神經(jīng)遞質(zhì)的改變會導(dǎo)致鯉魚活動的改變,進而可能影響生長。本試驗結(jié)果顯示,鎘暴露顯著降低了鯉魚的生長表現(xiàn),而相對于Cd組,APCd組和APSeCd組生長表現(xiàn)差異不顯著(P>0.05),但APCd組和APSeCd組平均體重均提高,對于生長表現(xiàn)有較小的恢復(fù)作用。大量研究都表明,天然多糖能夠調(diào)節(jié)機體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化,具有一定的抗抑郁、調(diào)節(jié)代謝等作用。蘇安祥研究發(fā)現(xiàn),金針菇多糖能夠顯著提高乙酰膽堿、DA、去甲腎臟上腺素和5-HT的生成[25]。劉文春等研究發(fā)現(xiàn),硒能夠顯著調(diào)節(jié)大腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化,顯著提高小鼠的記憶能力[26]。本試驗發(fā)現(xiàn),與Cd組相比,APSe或AP均能夠顯著增強鯉魚體內(nèi)的AChE、Na+/K+-ATP酶、5-HT和DA含量。APSe或AP對于神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)研究較少,其機制需要進一步研究。

綜上所述,鯉魚鎘暴露后,APSe或AP均能夠有效緩解Cd毒性,且APSe效果優(yōu)于AP,本試驗為鯉魚慢性鎘暴露中毒提供新的治療策略,而對于硒多糖飼喂后組織中硒含量評價需要進一步研究。