安一娜 , 譚姝瑜 , 劉天龍 , 許建海 , 董彥君

(1. 中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院 獸醫(yī)公共衛(wèi)生安全全國重點實驗室 , 北京 海淀 100193 ; 2. 中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院 獸醫(yī)病理學和納米病理學實驗室 , 北京 海淀 100193)

伴侶動物飼養(yǎng)逐年增多,寵物腫瘤病已成為獸醫(yī)臨床常見疾病。近年來,獸醫(yī)工作者也越來越關注腫瘤發(fā)生發(fā)展及相關干預技術。許多癌細胞的生存生長都依賴于磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)信號通路。大量研究表明,Akt在PI3K依賴的腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[1]。由于血清和糖皮質激素誘導的蛋白激酶(Serum and glucocorticoid-induced protein kinase,SGK)與Akt具有高度保守的激酶域,二者相同的氨基酸約占整個結構域的54%,故SGK與Akt可以調節(jié)許多結構類似的靶蛋白[2]。SGK1可以參與激活PI3K下游通路[3]。SGK也可以調控上皮細胞Na+的轉運;通過磷酸化糖原合成酶激酶3(Glycogen synthase kinase-3,GSK3),抑制糖原合成酶[4];SGK1還可以與cAMP反應元件結合蛋白(Cyclic-AMP response binding protein,CREB)結合并磷酸化,干擾CREB依賴的基因轉錄[5]。最重要的是SGK1已被證明在維持細胞存活方面發(fā)揮重要作用[6-8]。異位表達SGK1可抑制化療誘導的乳腺癌細胞凋亡[8]。SGK1的抗凋亡作用部分歸因于叉頭轉錄因子的磷酸化[7],例如橫紋肌肉瘤家族中的轉錄因子FKRHL1[9]。此外,SGK3還可以通過磷酸化B淋巴細胞瘤-2基因相關啟動子(Bcl-xL/Bcl-2 asociated death promoter,Bad),阻止其進入線粒體,從而抑制細胞凋亡[10-12]。SGK在多種癌組織中表達升高[6,13],通過敲除SGK或使用SGK抑制劑可以阻斷前列腺癌細胞的生長[14]。綜上,SGK參與調控腫瘤細胞的生存生長,并在其中發(fā)揮著重要作用。

人表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2,HER2)是PI3K/Akt通路上游的重要調節(jié)因子[15]。乳腺癌患者中,HER2的高表達與預后不良相關[16]。p27Kip是周期蛋白依賴性激酶相互作用蛋白/激酶抑制蛋白(Cyclin-dependent kinase interaction protein/ kinase inhibitory protein,CIP/KIP)家族成員,編碼一種周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-dependent kinase,CDK)抑制劑,通過抑制G1周期蛋白-CDK的活性導致G1停擺[17]。在癌癥中經常能夠檢測到p27表達的減少,并已證明p27與癌癥的發(fā)展和預后有關[18]。因此,過表達p27Kip能夠抑制HER2介導的腫瘤形成和發(fā)展[19]。在腫瘤細胞中過表達p27可以抑制腫瘤細胞的生長,所以推測SGK有可能是通過抑制p27發(fā)揮其促腫瘤生長的作用。

綜上,SGK在調控腫瘤細胞增殖和凋亡等方面具有重要作用,并且SGK可能通過抑制p27調控腫瘤細胞生長,但是SGK調控腫瘤細胞生長的具體機制及其與p27的關系仍有待進一步揭示。因此,本研究通過體內外試驗探究SGK對腫瘤細胞生長的影響及其作用機制,發(fā)現無論在體內還是體外,SGK均可以通過直接下調周期素依賴性激酶抑制劑p27Kip來促進乳腺癌細胞的生長,并且SGK磷酸化增加,腫瘤細胞的轉化也會增加。結果提示,SGK可以作為動物腫瘤診斷和預后的潛在指標,還可以作為腫瘤相關藥物研發(fā)的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 細胞:小鼠胚胎成纖維細胞系NIH3T3、人胚胎腎細胞系HEK293T和人乳腺癌細胞系MDA-MB-231,均購自國家生物醫(yī)學實驗細胞資源庫;過表達HER2的NIH-3T3細胞(NIH3T3/HER2),過表達p27的NIH-3T3細胞(NIH3T3/p27)及過表達HER2和p27的NIH-3T3細胞(NIH3T3/HER2/tTA-p27)均由本實驗室保存。動物:裸鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[生產許可證號:SCXK(京)2021—0006]。小干擾RNA(Small interfering RNA,siRNA)質粒和SGK過表達質粒,委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成(siRNA SGK序列為GAT CCG TCC TTC TCA GCA AAT CAA CTC AAG AGA TTG ATT TGC TGA GAA GGA CTT TTT TGG AAA)。

1.2 主要試劑 DMEM和FBS,均購自Gibco/Life Technologies公司;Lipofectamine 3000 試劑,購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;RIPA裂解液,購自碧云天生物技術有限公司;Cell Proliferation Kit XTT?Colorimetric Assay和Cell Proliferation ELISA Brdu(Colorimetric),均購自Hoffmann-La Roche有限責任公司;瓊脂粉、PI、MgCl2、Tris-HCl、RNase A和檸檬酸鈉抗原修復液,均購自北京索萊寶科技有限公司;含DAPI的封片劑,購自北京中杉金橋生物技術有限公司;anti-SGK、anti-p27、anti-p-SGK、anti-p-Akt和anti-β-actin抗體,均購自Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要儀器 熒光顯微鏡(80i),NIKON公司產品;流式細胞儀(FACSAriaTMⅢ),Becton,Dickinson and Company產品;酶標儀(800TS),安捷倫科技(中國)有限公司產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 動物倫理 所有用于試驗的小鼠均在中國農業(yè)大學實驗動物中心屏障條件下飼養(yǎng),飼喂標準飼料。所有動物護理和試驗方案均符合中華人民共和國衛(wèi)生部《動物管理條例》和美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)布的《實驗動物護理和使用指南》,并經中國農業(yè)大學實驗動物福利與動物實驗倫理審查委員會批準(批準號:AW42902202-2-1)。

1.4.2 細胞培養(yǎng)和轉染 NIH3T3是小鼠成纖維細胞系,具有增殖快、易培養(yǎng)、易轉染等特點;還具有一定的腫瘤形態(tài)和生物學特征,長期以來被作為轉染受體細胞進行腫瘤基因相關的研究,轉染后的NIH3T3更有利于進行特定基因的研究。本研究中使用的NIH3T3、NIH3T3/HER2和NIH3T3/HER2/tTA-p27細胞培養(yǎng)于含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。按照Lipofectamine 3000 試劑說明書步驟將SGK過表達質粒、siRNA CTRL(siRNA對照)質粒和siRNA SGK質粒轉染進入HEK 293T細胞中,分別獲得攜帶有SGK過表達質粒,siRNA CTRL質粒和siRNA SGK質粒的逆轉錄病毒。由攜帶有SGK過表達質粒的逆轉錄病毒感染NIH3T3、NIH3T3/p27和NIH3T3/HER2/tTA-p27細胞,經嘌呤霉素篩選后得NIH3T3/SGK、NIH3T3/p27/SGK和NIH3T3/HER2/tTA-p27/SGK細胞。

使用攜帶siRNA CTRL質粒和攜帶siRNA SGK質粒的逆轉錄病毒分別感染MDA-MB-231,得到siRNA CTRL對照細胞和敲低SGK的MDA-MB-231細胞[20]。

1.4.3 細胞蛋白提取和WB檢測 收集細胞,置于RIPA裂解液中,于冰上裂解30 min,收集裂解液,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,收集上清即為蛋白溶液。蛋白溶液進行蛋白免疫印跡(Western blot,WB)分析,使用的一抗為anti-SGK、anti-p-SGK、anti-p-Akt、anti-p27或anti-β-actin抗體,二抗為標記有HRP的IgG抗體,顯色后進行分析[21]。

1.4.4 細胞增殖的檢測

1.4.4.1 XTT試驗 使用The Cell Proliferation Kit XTT?Colorimetric Assay檢測細胞增殖情況。將細胞按照5×103個/孔的數量接種于96孔板,分別于培養(yǎng)的第1、2、3、4、5、6、7天,將二甲氧唑黃(XTT)添加至96孔板,濃度為0.3 mg/mL。將含有XTT的培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)1 h后產生橙色產物。使用酶標儀于450 nm處檢測吸光度(Optical density,OD)值。至少設置5個復孔,酶標儀至少重復讀數3次[22]。

1.4.4.2 Brdu摻入試驗 在細胞復制過程中,溴脫氧尿苷(Brdu)可以被整合進新的DNA,一旦細胞開始復制,合成的DNA就會摻有Brdu,因此,Brdu可以用來檢測細胞增殖情況。將轉染了siRNA的MDA-MB-231細胞、NIH3T3/p27/SGK細胞和NIH3T3/HER2/tTA-p27/SGK細胞培養(yǎng)7 d,按照Cell Proliferation ELISA Brdu(Colorimetric)檢測試劑盒說明書操作進行檢測[23]。

1.4.5 軟瓊脂克隆形成試驗 細胞經胰蛋白酶消化后,懸浮于含0.3%瓊脂和20% FBS的DMEM培養(yǎng)基中,調整細胞濃度為2×104個細胞/3.5 cm細胞培養(yǎng)皿,加入至底層預鋪0.6%瓊脂的細胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)14 d后,計數集落大于0.5 mm的克隆,計算克隆形成率。試驗進行3次獨立的重復[24]。

1.4.6 流式細胞術檢測細胞周期 收集處理后的細胞,2 000 r/min離心5 min,PBS洗2次,用70%冰乙醇于4 ℃固定1 h,PBS洗2次。加入50 μg/mL PI、5 μmol/L MgCl2、10 mmol/L Tris-HCl(pH=7)、25 μg/mL RNase A,于37 ℃孵育細胞30 min。流式細胞儀分析,激發(fā)光選擇488 nm[25]。

1.4.7 細胞免疫熒光(Immunofluorescence,IF)試驗 收集細胞,使用4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗2次,0.3% TritonX-100破膜10 min后,PBS洗2次,5%驢血清室溫封閉1 h,加入SGK和p27抗體4 ℃過夜孵育,PBS洗3次,加入AlexaFluor 594山羊抗兔IgG和AlexaFluor 488山羊抗鼠IgG避光室溫孵育1 h,經含有DAPI的封片劑封片后,于熒光顯微鏡下采集圖像[21]。

1.4.8 小鼠腫瘤模型的建立 選取9只4～5周齡的雌性裸鼠,隨機分為3個組,分別于小鼠左側腋部皮下注射5×106個NIH3T3/HER2、NIH3T3/HER2/tTA-p27或NIH3T3/HER2/tTA-p27/SGK細胞,連續(xù)飼養(yǎng)2周[26],獲得荷瘤小鼠并命名為CTRL、p27和SGK/p27。2周后處死小鼠,測量腫瘤體積,制作腫瘤組織切片利用免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)分析SGK、Cyclin D1和p27蛋白水平。

1.4.9 腫瘤體積測定 按照公式(1)計算荷瘤小鼠的腫瘤體積[27]。

腫瘤體積=1/2×腫瘤的長度×腫瘤的寬度2

(1)

1.4.10 IHC試驗 腫瘤組織固定于4%多聚甲醛中,經脫水、透明、包埋和切片后,制作為石蠟切片。切片脫蠟至水,3%雙氧水封閉15 min,蒸餾水沖洗,使用檸檬酸鈉抗原修復液進行抗原修復,5%驢血清室溫封閉1 h,分別加入SGK、Cyclin D1或p27抗體4 ℃過夜孵育,PBS洗3次,加入含有生物素標記的二抗室溫孵育30 min,PBS洗3次,加入HRP標記的二抗室溫孵育30 min,PBS洗3次,DAB顯色,自來水中止顯色,脫水透明,封片,于光學顯微鏡下采集圖像[28]。

1.5 統(tǒng)計分析 本研究結果均以“平均值±標準誤(Mean±SEM)”表示。采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析,使用t檢驗進行差異分析。P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 SGK對腫瘤細胞增殖和轉化的影響 已經有大量報道發(fā)現SGK在腫瘤中表達升高[6,13]。為了進一步探究SGK對腫瘤細胞增殖的影響,本試驗使用siRNA技術敲低了MDA-MB-231細胞中的SGK。經WB檢測發(fā)現,與siRNA無意義序列對照(siRNA CTRL)組相比,siRNA SGK組的SGK蛋白含量明顯下降;XTT試驗同時顯示,無論培養(yǎng)1 d還是3 d,siRNA SGK組細胞增殖水平均顯著低于siRNA CTRL組(P<0.05)(圖1A)。Brdu摻入試驗結果也顯示,相比于siRNA CTRL組,siRNA SGK組細胞增殖水平顯著降低(P<0.05)(圖1B)。軟瓊脂克隆形成試驗結果顯示,與siRNA CTRL組相比,siRNA SGK組細胞集落的克隆形成率顯著降低(P<0.05)(圖1C)。綜上可知,抑制SGK后腫瘤細胞MDA-MB-231的增殖和轉化顯著下降,SGK參與調控腫瘤細胞的生長。

圖1 在體外下調SGK可抑制腫瘤細胞的生長Fig.1 Down-regulation of SGK inhibited tumor cell growth in vitroA:WB檢測SGK蛋白表達和XTT試驗檢測細胞增殖; B:Brdu摻入試驗檢測細胞增殖; C:軟瓊脂克隆形成試驗檢測細胞增殖和轉化*:P<0.05A:WB detected SGK protein expression and XTT assay detected cell proliferation; B:Brdu incorporation assay detected cell proliferation; C:Soft agar colony formation assay detected cell proliferation and transformation*:P<0.05

2.2 SGK影響腫瘤細胞生長轉化的機制 致癌基因HER2能夠促進細胞生長分裂和癌變,有文獻報道,在表達HER2的細胞中過表達p27能夠抑制腫瘤細胞的復制、錨定非依賴性生長和細胞轉化[19]。WB結果顯示,在過表達了HER2和p27(NIH3T3/HER2/tTA-p27)的細胞中過表達SGK(NIH3T3/HER2/tTA-p27/SGK),與NIH3T3/HER2/tTA-p27細胞(p27組)相比,NIH3T3/HER2/tTA-p27/SGK細胞(SGK/p27組)的p27蛋白含量明顯降低(圖2A)。XTT試驗結果顯示,培養(yǎng)3 d后p27組和SGK/p27組細胞的增殖均明顯低于CTRL 組細胞(NIH3T3/HER2);但與p27組相比,SGK/p27組細胞增殖明顯增加(P<0.05)(圖2B)。Brdu摻入試驗結果顯示,與p27組相比,SGK/p27組細胞增殖顯著增加(P<0.05)(圖2C)。細胞周期分析結果與細胞增殖結果類似,與p27組相比,SGK/p27組中G0-G1期細胞減少,S期細胞增加;且SGK/p27組和CTRL組顯示出相似的細胞周期分布(圖2D)。為了確定在HER2/p27過表達的細胞中,表達SGK是否會影響細胞的轉化,本研究利用軟瓊脂克隆形成試驗,評估SGK對HER2/p27過表達細胞轉化的影響,結果顯示,p27組細胞克隆率顯著低于CTRL組(P<0.05);但與p27組細胞相比,過表達SGK(SGK/p27組)顯著增加了細胞克隆率(P<0.05)(圖2E)。以上結果表明,SGK能夠通過抑制p27誘導腫瘤細胞的生長。

圖2 在體外SGK通過抑制p27調控腫瘤細胞生長Fig.2 SGK regulated tumor cell growth through decreasing p27 in vitroA:WB檢測SGK和p27蛋白表達; B:XTT試驗檢測細胞增殖; C:Brdu摻入試驗檢測細胞增殖; D:流式細胞術檢測細胞周期; E:軟瓊脂克隆形成試驗檢測細胞增殖和轉化*:與CTRL組相比,P<0.05; #:與p27組相比,P<0.05A:WB detected SGK and p27 protein expression; B:XTT assay detected cell proliferation; C:Brdu incorporation assay detected cell proliferation; D:Flow cytometry detected cell cycle; E:Soft agar colony formation assay detected cell proliferation and transformation *:Compared with the CTRL group,P<0.05; #:Compared with the p27 group,P<0.05

2.3 SGK對p27的影響 為了避免其他原癌基因的干擾,本研究僅在NIH3T3細胞中過表達了SGK和p27,WB結果與圖2A的結果一致,SGK的過表達降低了p27蛋白含量(圖3A),可能是SGK促進了p27蛋白的降解。使用siRNA敲低MAD-MB-231細胞中的SGK后,WB結果顯示,siRNA SGK 組的p27含量明顯升高(圖3B)。這些結果說明,SGK可能通過調控p27蛋白的降解從而調控細胞周期和腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究顯示,p27只有進入細胞核才可以發(fā)揮細胞周期調控蛋白的作用[17]。因此,本研究使用IF技術檢測了SGK與p27的定位關系,結果顯示,在SGK/p27過表達的NIH3T3/HER2/tTA-p27/SGK細胞(SGK/p27組)中,p27蛋白定位在細胞質中,而NIH3T3/HER2/tTA-p27細胞(p27組)的p27蛋白定位于細胞核(圖3C)。有文獻報道,p27能夠通過抑制HER2的作用,從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[19]。本研究使用表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)抑制劑抑制了HER2的磷酸化,結果顯示,p-SGK蛋白水平被明顯下調,但p27蛋白水平被提高(圖3D);而利用胰島素(Insulin)激活SGK后,p27蛋白水平被明顯下調(圖3E)。這些結果說明,SGK確實通過影響p27的胞質定位、降解和細胞周期來調控腫瘤細胞的增殖和轉化。有文獻報道,Akt的激活能夠下調p27[17]。本研究使用Akt活性抑制劑抑制了Akt的磷酸化,結果顯示,p-SGK和p27蛋白表達沒有明顯變化(圖3F)。因此推測,SGK雖然與Akt具有類似的結構,但SGK獨立于Akt調控p27。

圖3 在體外SGK促進p27的胞質定位和降解Fig.3 SGK promoted cytosolic localization and degradation of p27 in vitroA和B:WB檢測SGK和p27蛋白表達; C:IF檢測SGK和p27的表達和定位; D和E:WB檢測p-SGK和p27蛋白表達;F:WB檢測p-Akt、p-SGK和p27蛋白表達A and B:WB detected SGK and p27 protein expression; C:Immunofluorescence detected expression and localization of SGK and p27; D and E:WB detected p-SGK and p27 protein expression; F:WB detected p-Akt,p-SGK and p27 protein expression

2.4 SGK對小鼠腫瘤生長的影響 為了檢測SGK是否在體內影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,本研究使用裸鼠建立了腫瘤模型以檢測SGK對小鼠腫瘤生長的影響。結果如圖4所示,p27組小鼠明顯高表達p27,但是無明顯的SGK和Cyclin D1表達,形成的腫瘤體積最小;SGK/p27組存在明顯的SGK表達,Cyclin D1表達高于p27組低于CTRL組,p27表達高于CTRL組低于p27組,形成腫瘤體積介于CTRL組與p27組之間;CTRL組SGK表達低于SGK/p27組高于p27組,但沒有明顯的p27表達,Cyclin D1表達最高,腫瘤形成體積最大。本試驗涉及所有小鼠的腫瘤體積均未超過2 000 mm3,CTRL組、p27組和SGK/p27組小鼠形成的腫瘤體積分別為(1 830±206) mm3、(654±90) mm3和(1 050±136) mm3。

圖4 在體內SGK通過抑制p27促進腫瘤生長Fig.4 SGK promoted tumor growth by inhibiting p27 in vivoA:IHC檢測SGK、Cyclin D1和p27的表達; B:腫瘤體積展示A:Immunohistochemistry detected expression of SGK,Cyclin D1 and p27; B:Presentation of tumor volume

3 討論

隨著動物飼養(yǎng)水平的提高,診療技術的革新,伴侶動物的壽命逐漸延長。動物老年疾病,特別是腫瘤的發(fā)生率逐年增高,癌癥已成為小動物死亡的主要病因之一。據統(tǒng)計,3年間,沈陽地區(qū)5家不同的寵物醫(yī)院共收治犬類病例11 204例,其中腫瘤疾病為1 225例,占總數的10.9%[29];2年間,哈爾濱某地區(qū)寵物醫(yī)院的71例犬腫瘤病例中,惡性腫瘤病例就達28例[30]。此外,腫瘤疾病也給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經濟損失。據統(tǒng)計,廣西及周邊的26批共247份疑似腫瘤病毒感染的病雞中,共檢測出20批合計122份腫瘤病病毒[31]。對福清市規(guī)模養(yǎng)殖場的羊傳染性鼻腫瘤進行統(tǒng)計發(fā)現,其羊鼻腫瘤場群流行率達35.7%[32]。因此,無論是伴侶動物還是經濟動物,動物腫瘤的防治已引起科研工作者的廣泛關注。探究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程,對于揭示腫瘤的致病機制及腫瘤相關藥物的研發(fā)至關重要。

已有研究表明,SGK在乳腺癌組織[6]和肝癌組織[13]中表達上調。核受體亞家族4 A族成員3(Nuclear receptor subfamily 4 group A member 3,NR4A3)編碼的尤文肉瘤/硝基還原酶結構域蛋白1(Ewing sarcoma/oxidored-nitro domain containing protein 1,EWS/NOR1)融合蛋白參與腫瘤的發(fā)生,骨外黏液樣軟骨肉瘤中存在EWS/NOR1時,SGK1 mRNA表達會上調[33]。在乳腺癌中,p-Akt-1和SGK-1的表達顯著相關[34],大量腫瘤樣本中僅表達p-Akt-1,另有相當數量的腫瘤過表達SGK-1,這表明Akt與SGK在調控PI3K信號通路中具有互補的生理功能。有報道稱,胰島素可刺激誘導Akt轉位到膜,但SGK不會發(fā)生膜轉位[35]。這可能是Akt和SGK在細胞生理反應中發(fā)揮不同功能的原因。據報道,在各種誘導物的誘導下,Akt均不影響上皮鈉離子通道(Epithelial Na+channel,ENaC)的活性,但SGK1可使ENaC活性增加10倍。Akt不參與p53依賴的FKHRL1抑制。但SGK1在DNA損傷后以p53依賴的方式被激活[36]。此外,通過siRNA敲低SGK1,FKHRL1的磷酸化水平會隨之顯著降低[37]。以上研究說明,SGK在腫瘤疾病中發(fā)揮著重要作用,且與Akt的作用機制不同。

Akt被報道在多種生命過程中發(fā)揮關鍵作用,包括葡萄糖轉運、糖原合成、DNA合成、抗凋亡和細胞增殖[38]。SGK的活性突變體(D-SGK,Ser422被Asp取代)和myr-SGK過表達均能夠磷酸化GSK3,從而增強肝細胞中糖原合成酶的活性,這與myr-Akt的作用機制相似。然而,盡管myr-Akt與D-SGK或myr-SGK的GSK3磷酸化程度相當,但D-SGK和myr-SGK未能增強脂肪細胞的葡萄糖轉運活性、IL-3依賴性細胞(32D細胞)的DNA合成以及NIH3T3細胞的致癌轉化,細胞僅有高水平的SGK表達并不能促使細胞異常增殖或轉化[39]。SGK需要與其他致癌基因共同作用才能使細胞發(fā)生轉化,但是沒有SGK的存在同樣能夠發(fā)生細胞轉化,那么在腫瘤細胞轉化過程中,為什么需要SGK,以及SGK在腫瘤細胞轉化過程中發(fā)揮的作用值得深入探究。本研究發(fā)現,抑制SGK后,腫瘤細胞的增殖和轉化受到抑制,表明在腫瘤生長過程中SGK確實發(fā)揮著重要的作用。既然明確了SGK的作用,揭示其調控腫瘤細胞生長的機制就尤為關鍵。

SGK蛋白激酶要發(fā)揮功能,需要通過磷酸化激活。研究表明,PI3K、3-磷脂酰肌醇依賴性激酶1和一種尚未識別的激酶均參與調控SGK磷酸化[40-42]。SGK也是絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節(jié)激酶(Mitogen-activated protein kinases/extracellular signal-regulated kinase,MAPK/ERK)信號級聯的下游靶點[43],ERK可直接磷酸化SGK的Ser78,參與大鼠空間記憶的形成以及白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)誘導的人類腫瘤的發(fā)生,如膽管癌[44,45]。在長期的研究中發(fā)現,SGK信號通路在乳腺腫瘤中表達升高,并且在乳腺癌細胞中改變SGK的表達會下調核細胞周期相關抑制因子p27的表達[46]。p27Kip1在T157/T198位點的磷酸化和細胞質定位被認為與SGK激活相關[17,46]。Akt能夠誘導p27的T157位點磷酸化,從而使p27(kip1)滯留在細胞質中,阻止由p27(kip1)誘導的G1期滯留[17]。HER2/neu是一種受體酪氨酸激酶癌基因,可通過下調細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑p27 Kip1,促進癌細胞的有絲分裂生長和轉化[47]。因此,SGK是否通過p27影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,并且在這個過程中Akt發(fā)揮怎樣的作用值得探究。

因此,本研究針對SGK是否能夠通過p27調控腫瘤生長展開一系列試驗。結果顯示,與NIH3T3/HER2細胞相比,NIH3T3/HER2/p27細胞的細胞增殖和轉化水平更低;而在NIH3T3/HER2/p27細胞中過表達SGK后,這種降低被逆轉。已有文獻報道,單獨的SGK并不能使細胞發(fā)生異常增殖[39],因此,可以推測在HER2的作用下SGK可能成為一種原癌基因,且SGK可能是通過p27發(fā)揮作用。為了證明這種假設,本研究使用EGFR抑制劑抑制了HER2,結果顯示,SGK的磷酸化也被抑制,同時,p27蛋白的含量升高。無論NIH3T3、NIH3T3/HER2還是MDA-MB-231中均檢測到p-SGK抑制p27的負反饋調節(jié),SGK能夠抑制p27的核定位,從而抑制p27作為抑癌基因的作用。由于SGK和Akt在其催化域中有45%～55%的序列同源,這2種激酶都有相似的磷酸化位點(RXRXXS/T),且在體內外Akt均能磷酸化p27。為了明確SGK的作用是否與Akt相關,本研究使用Akt抑制劑處理細胞,結果顯示,p-SGK和p27的含量沒有明顯變化,表明SGK是一個關鍵的調控因子,能夠通過抑制p27調控腫瘤細胞增殖,且其激活并不受Akt的影響。

綜上所述,SGK能夠通過增強p27的胞質定位,促進p27降解,調控腫瘤細胞的細胞周期、增殖和轉化,從而促進小鼠腫瘤的生長,結果提示SGK可以作為潛在的腫瘤診斷指標指示動物腫瘤疾病的病程和預后,也為腫瘤相關治療藥物的研發(fā)提供潛在的靶點。