高勤 左友波 劉琪琳

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科,四川 南充 637000 )

異氟醚是臨床常用的吸入性全身麻醉藥物,麻醉誘導(dǎo)平穩(wěn)、迅速、舒適,蘇醒快,肌肉松弛良好,且無交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮作用[1]。有研究報道,異氟醚可能誘導(dǎo)大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡,從而嚴(yán)重影響其腦功能,而且這種影響可長期存在,甚至出現(xiàn)行為功能障礙[2]。故對異氟醚麻醉導(dǎo)致術(shù)后認(rèn)知功能障礙誘因、預(yù)防、診斷及治療的分析成為研究熱點。地塞米松可用于風(fēng)濕性疾病、嚴(yán)重過敏、哮喘、腦水腫等多種疾病[3]。近年來,研究報道地塞米松在修復(fù)血腦屏障[4]、減輕神經(jīng)損傷[5]方面發(fā)揮重要作用。韓佳[6]研究顯示,地塞米松可降低七氟烷所致新生大鼠記憶障礙和神經(jīng)元損傷,可能與上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)表達(dá)有關(guān)。由此推理,地塞米松在異氟醚麻醉引起的認(rèn)知功能損傷中可能也存在保護(hù)作用。核因子(nuclear factor,NF)-κB通路是經(jīng)典的炎癥信號通路,SIRT1可負(fù)向調(diào)控NF-κB表達(dá),抑制炎癥反應(yīng)水平,在腦組織炎性損傷中有重要作用。為了評價地塞米松對異氟醚麻醉手術(shù)大鼠認(rèn)知功能及SIRT1/NF-κB信號通路的作用,本研究將通過吸入異氟醚模擬異氟醚麻醉狀態(tài),觀察地塞米松處理后大鼠認(rèn)知功能、海馬區(qū)形態(tài)學(xué)改變、炎癥細(xì)胞因子水平及SIRT1/NF-κB信號通路蛋白的影響,為臨床麻醉藥物的合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 R419型動物麻醉呼吸機(jī)(深圳瑞沃德生命科技有限公司),XR-XM101型Morris水迷宮實驗系統(tǒng)、XR-XX117型物體位置識別系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.2 主要藥品與試劑 地塞米松片(國藥準(zhǔn)字H44024618,批號190520)購自廣東南國藥業(yè)有限公司,異氟醚(CAS26675-46-7,批號:54832601)購自美國MERCK公司,大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司,批號分別為T1568、T1840、T3349,蘇木精-伊紅(HE)染色試劑、末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、蛋白裂解液均上海碧云天生物技術(shù)有限公司,批號分別為20200518、20210130、20210210,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteine proteinase-3,caspase-3)、caspase-9、SIRT1、NF-κB、磷酸化(phosphorylated,p)-NF-κB、NF-κB抑制蛋白(NF-κB inhibitory protein,IκBα)、β-肌動蛋白(β-actin)抗體均購自美國Abcam公司,批號分別為ab32499、ab32539、ab110304、ab209795、ab28849、ab183503、ab8226。

1.3 實驗動物 40只SPF級SD大鼠購于川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心,雄性,6～8周齡,體質(zhì)量200～250 g,動物生產(chǎn)合格證編號為SCXK(川)2018-0018。大鼠飼養(yǎng)于溫度為22～25 ℃、相對濕度為40%～60%的動物房,光照和黑暗每12 h交替,適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)3 d再正式進(jìn)入實驗。本研究經(jīng)我院動物倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號:202219)。

1.4 動物分組與處理 將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組:Sham組,不做任何處理;ISO組,持續(xù)4 h吸入1.4%異氟醚[7];5 Dex Iso組,吸入異氟醚前30 min腹腔注射5 mg/kg地塞米松[6];10 Dex Iso組,吸入異氟醚前30 min腹腔注射10 mg/kg地塞米松[6],每組10只。麻醉過程中注意觀察大鼠呼吸情況,防止發(fā)生呼吸抑制,其中異氟醚吸入后大鼠翻正反射消失即為麻醉成功。麻醉大鼠結(jié)束后需要繼續(xù)吸入2 L/min的氧氣,待其恢復(fù)翻正反射,再放入各自籠中。

1.5 大鼠行為學(xué)觀測 大鼠麻醉3 d后進(jìn)行Morris水迷宮實驗和物體位置識別實驗。Morris水迷宮實驗:定位航行實驗,第1至5天,每天固定時間,將大鼠從任一點面向池壁放入水池,記錄120 s內(nèi)大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期);空間探索實驗,第6天撤除平臺,將大鼠從任一點面向池壁放入水池,記錄120 s內(nèi)大鼠在原平臺位置穿越的次數(shù)。物體位置識別實驗:將A、B兩個物體放在一側(cè)壁的左右兩端,大鼠背朝兩物體放入場地內(nèi),記錄10 min內(nèi)大鼠與這兩個物體接觸的情況,結(jié)束后立即將大鼠放回原來飼養(yǎng)的鼠盒內(nèi),待大鼠休息1 h后再進(jìn)行測試,這時將場地內(nèi)物體移到新的位置,仍將大鼠背向兩物體放入,記錄5 min內(nèi)大鼠對物體的探索時間(物體記憶時間)。

1.6 大鼠海馬組織病理染色 行為學(xué)觀測結(jié)束后處死大鼠,采集腦組織,分離海馬組織,部分固定于4%多聚甲醛溶液,制備石蠟組織切片,分別行HE染色和TUNEL染色,觀察海馬區(qū)形態(tài)學(xué)變化和細(xì)胞凋亡情況。

1.7 ELISA 檢測大鼠海馬組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平 取海馬組織,混入預(yù)冷生理鹽水制備海馬組織勻漿液,4 ℃下5 000 r/m離心10 min分離上清液,參照酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒說明書操作,檢測海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.8 Western blot法檢測大鼠海馬組織相關(guān)蛋白表達(dá)量 采用取海馬組織,加入蛋白裂解液提取總蛋白,采用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)法檢測蛋白濃度,再經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳至蛋白完全分離,以300 mA恒流轉(zhuǎn)移至聚二偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜,5%脫脂牛奶中封閉2 h,然后分別孵育caspase-3、caspase-9、SIRT1、NF-κB、p-NF-κB、IκBα及β-actin抗體,稀釋比均為1∶1 000,4 ℃下?lián)u床過夜,次日取出洗膜5次(8 min/次),再孵育二抗,稀釋比為1∶5 000,37 ℃下?lián)u床孵育1 h,最后暗室發(fā)光顯影。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠行為學(xué)檢測數(shù)據(jù)的比較 與Sham組比較,ISO組第3至5天逃避潛伏期和物體記憶時間延長,原平臺位置穿越次數(shù)減少(P<0.05);與ISO組比較,10 Dex Iso組第4至5天逃避潛伏期和物體記憶時間縮短,原平臺位置穿越次數(shù)增加(P<0.05),且10 Dex Iso組第5天逃避潛伏期和物體記憶時間短于5 Dex Iso組,原平臺位置穿越次數(shù)多于5 Dex Iso組(P<0.05)。見表1。

表1 4組逃避潛伏期、原平臺位置穿越次數(shù)和物體記憶時間的比較

2.2 4組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)變化的比較 Sham組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則、排列整齊,細(xì)胞核染色均勻;ISO組海馬區(qū)細(xì)胞核存在不同程度的固縮深染與空泡化,排列雜亂,10 Dex Iso組病理損傷較ISO組、5 Dex Iso組輕微,見圖1。

圖1 4組大鼠海馬組織HE染色形態(tài)學(xué)變化的比較(400×)

2.3 4組大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡情況的比較 與Sham組比較,ISO組海馬組織神經(jīng)元凋亡率、caspase-3及caspase-9相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05);與ISO組比較,10 Dex Iso組神經(jīng)元凋亡率、caspase-3及caspase-9相對表達(dá)量明顯降低(P<0.05),且10 Dex Iso組上述指標(biāo)低于5 Dex Iso組(P<0.05)。見圖2、3,表2。

圖2 4組海馬組織神經(jīng)元TUNEL染色凋亡情況(200×)

圖3 4組海馬組織凋亡蛋白的表達(dá)

表2 4組海馬組織神經(jīng)元凋亡率和凋亡蛋白表達(dá)量的比較

2.4 4組大鼠海馬組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較 與Sham組比較,ISO組海馬組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高(P<0.05);與ISO組比較,10 Dex Iso組IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低(P<0.05),且10 Dex Iso組上述指標(biāo)低于5 Dex Iso組(P<0.05)。見表3。

表3 4組海馬組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較

2.5 4組大鼠海馬組織SIRT1/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)量的比較 與Sham組比較,ISO組海馬組織SIRT1和IκBα表達(dá)量明顯降低,p-NF-κB/NF-κB水平明顯升高(P<0.05);與ISO組比較,10 Dex Iso組SIRT1和IκBα表達(dá)量明顯升高,p-NF-κB/NF-κB水平明顯降低(P<0.05),且10 Dex Iso組SIRT1和IκBα表達(dá)量高于5 Dex Iso組,p-NF-κB/NF-κB水平低于5Dex Iso組(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 4組海馬組織SIRT1/NF-κB信號通路蛋白的表達(dá)

表4 4組大鼠海馬組織SIRT1/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)量比較

3 討論

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展與進(jìn)步,全身麻醉或監(jiān)測麻醉下手術(shù)、有創(chuàng)檢查的病例越來越多,雖然麻醉的介入大幅提高患者的舒適度與配合度,但麻醉藥物導(dǎo)致其行為異常也時有發(fā)生。研究表明,異氟醚可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[8]、氧化應(yīng)激[9]、細(xì)胞凋亡[10]等多種途徑損害腦組織,影響腦功能。地塞米松屬于長效糖皮質(zhì)激素,除具有強(qiáng)效的抗炎作用外,還可逆轉(zhuǎn)空間記憶障礙、減輕神經(jīng)元細(xì)胞病理變化:馮安琪等[11]對300例接受單側(cè)全髖/膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的老年患者予以不同劑量的地塞米松,發(fā)現(xiàn)0.15 mg/kg地塞米松可降低患者術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率,可能與改善血清TNF-α、中樞神經(jīng)特異蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶水平有關(guān);Jeong等[12]發(fā)現(xiàn),過度和長期的神經(jīng)炎癥會導(dǎo)致創(chuàng)傷性腦損傷后的神經(jīng)元細(xì)胞死亡,水凝膠介導(dǎo)的地塞米松局部注射可減輕創(chuàng)傷性腦損傷后的神經(jīng)炎癥。本研究采用Morris水迷宮實驗和物體位置識別實驗評估實驗動物空間學(xué)習(xí)能力與記憶能力,發(fā)現(xiàn)異氟醚持續(xù)吸入會延長大鼠逃避潛伏期和物體記憶時間,并減少大鼠穿越原平臺的次數(shù),表明異氟醚會減弱大鼠空間學(xué)習(xí)能力和參考記憶力。與ISO組比較,5 Dex Iso組各指標(biāo)無明顯差異,10 Dex Iso組第4至5天逃避潛伏期和物體記憶時間縮短,原平臺位置穿越次數(shù)增加,且10 Dex Iso組第5天逃避潛伏期和物體記憶時間短于5 Dex Iso組,原平臺位置穿越次數(shù)多于5 Dex Iso組,提示地塞米松作用與其濃度有關(guān),10 mg/kg地塞米松可部分逆轉(zhuǎn)異氟醚麻醉引起的大鼠認(rèn)知功能損傷。本研究在明確地塞米松可提升動物高級腦功能的基礎(chǔ)上,對其分子作用機(jī)制作進(jìn)一步分析。

有文獻(xiàn)報道,地塞米松可改善腦組織病理損傷[13-14]。本研究通過對海馬組織進(jìn)行HE染色結(jié)果顯示,與Sham組比較,吸入異氟醚后大鼠海馬區(qū)細(xì)胞核存在不同程度的固縮深染與空泡化,排列雜亂,而注射10 mg/kg地塞米松干預(yù)后,上述病理損傷明顯減輕。TUNEL染色結(jié)果顯示,地塞米松可減輕異氟醚所致海馬神經(jīng)元凋亡,通過檢測海馬組織內(nèi)caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,異氟醚暴露前給予地塞米松可顯著降低caspase-3和caspase-9表達(dá),抑制神經(jīng)元凋亡,與Skelly等[15]報道地塞米松可抑制腦神經(jīng)元凋亡,從而改善記憶功能障礙的作用相符,這可能是地塞米松對異氟醚致大鼠認(rèn)知功能障礙的治療作用機(jī)制之一。

SIRT1在細(xì)胞生長、代謝、應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程中均有重要的調(diào)控作用,主要依賴對底物的去乙酰化修飾作用[16-17]。研究顯示,SIRT1可去乙酰化修飾NF-κB亞基P65的Lys310殘基,抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性,負(fù)向調(diào)控炎癥反應(yīng),減少IL-6、IL-1β和TNF-α等炎性因子和促凋亡基因表達(dá)[18-19]。Tang等[20]研究發(fā)現(xiàn),通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞SIRT1/NF-κB通路可改善七氟醚暴露小鼠的認(rèn)知功能損害。還有研究[6]顯示,地塞米松可能通過促進(jìn)SIRT1表達(dá),維持線粒體正常代謝,實現(xiàn)對七氟烷麻醉致新生大鼠神經(jīng)元損傷的保護(hù)。本研究觀察到ISO組大鼠海馬組織中SIRT1和IκBα表達(dá)量明顯減少,p-NF-κB/NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高,5 Dex Iso組和ISO組各指標(biāo)無明顯差異,而10 Dex Iso組較ISO組和5 Dex Iso組SIRT1和IκBα表達(dá)量增加,p-NF-κB/NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低,表明10 mg/kg地塞米松可能通過上調(diào)SIRT1和IκBα表達(dá),抑制NF-κB磷酸化,從而抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

4 結(jié)論

10 mg/kg地塞米松可改善異氟醚麻醉所致大鼠認(rèn)知功能障礙,減輕神經(jīng)元凋亡,可能與調(diào)節(jié)SIRT1/NF-κB信號通路有關(guān)。本研究結(jié)果為地塞米松在術(shù)后認(rèn)知功能障礙中的應(yīng)用提供了實驗依據(jù),未來將深入分析地塞米松在腦神經(jīng)元保護(hù)中的作用機(jī)制。