阿孜古力·克熱木 艾克拜爾·吾曼爾 麥伍拉尼·馬木提 買買提·依斯熱依力 王晨宇 李九智

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床檢驗中心,新疆 烏魯木齊 830001;2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院泌尿中心,新疆 烏魯木齊 830001;3.新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院泌尿外科,新疆 烏魯木齊 830028;4.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學研究與轉(zhuǎn)化中心,新疆 烏魯木齊 830001)

尿毒癥毒素是慢性腎臟病(Chronic kidney disease, CKD)患者尤其是終末期腎病患者因腎功能減退、腎清除率下降導(dǎo)致在血液中不斷蓄積的有毒物質(zhì)。硫酸吲哚酚(Indoxyl Sulfate,IS)是近年來發(fā)現(xiàn)的蛋白結(jié)合性尿毒素,不容易被透析方式排出,在尿毒癥期其血液濃度持續(xù)增高,給腎臟及血管系統(tǒng)帶來了毒性作用[1]。有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白-3(Organic anion transporter-3,OAT-3)是體內(nèi)主要的IS轉(zhuǎn)運因子[2],對其進行研究不僅可進一步了解CKD患者IS高水平的發(fā)生機制,并且可以為新型藥物研制提供一定的實驗依據(jù)。NADPH氧化酶-4(Nox-4)被認為是機體內(nèi)重要的氧化應(yīng)激指標,也是IS促進CKD發(fā)生發(fā)展的分子機制之一,能激活細胞內(nèi)多種信號傳導(dǎo)通路,其異?；罨艽龠M腎功能衰退和腎纖維化病變[3]。腎纖維化是CKD進行性發(fā)展至終末期腎功能衰竭的病理標志,其相關(guān)的分子機制仍未探明,尤其CKD中IS誘發(fā)腎纖維化的分子機制有待進一步探究。因此,本文通過體外培養(yǎng)人正常腎小管上皮(HK-2)細胞實驗,探討IS能否通過OAT-3以及氧化應(yīng)激,促進腎纖維化的發(fā)生。利用siRNA沉默OAT-3和抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理的HK-2細胞中分析氧化應(yīng)激(Nox-4)及纖維化因子(Collagen I、TGF-β1、Smad-3、α-SMA)的mRNA和蛋白表達情況,進一步明確OAT-3敲低和NAC預(yù)處理對上述指標的作用,以期為今后進一步探索提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人正常腎小管上皮細胞系HK-2購自武漢普諾賽生命科技有限公司,DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司,青鏈霉素、RIPA細胞裂解液及N-乙酰半胱氨酸(NAC)購自北京索萊寶科技有限公司,LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司,siRNA購于上海吉瑪公司,TRIzol試劑、引物及蛋白裂解液等試劑購于天根生化科技(北京)有限公司,Nox-4、Collagen I、TGF-β1、α-SMA、Smad-3等抗體均購自美國abcam公司,OAT-3、山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗均購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 參考我們前期研究[4],大體步驟:將復(fù)蘇的HK-2細胞接種于10 cm2培養(yǎng)皿,用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640高糖DMEM培養(yǎng)基放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后首次換液,以后48 h換液1次;待細胞生長達到80%～90%匯合時,進行傳代;第2～8代細胞用于后續(xù)的實驗。

1.2.2 實驗分組 HK-2細胞用0.25%胰酶消化,傳代后隨機分為兩組:①空白對照組(Control組):加入培養(yǎng)液中正常培養(yǎng)不予干預(yù)。②IS處理組(IS組):加入含250 μmoL IS培養(yǎng)。HK-2細胞貼壁生長,排列緊密,見圖1。兩組均培養(yǎng)24 h后,用PBS清洗細胞2次,加入TRIzol裂解液,取總RNA,采用RT-PCR方法檢測氧化應(yīng)激(Nox-4)及纖維化因子指標的mRNA相對表達水平。

圖1 Control組和IS組HK-2細胞鏡下觀察(200×)

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 HK-2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640高糖DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng),以5×106/孔的密度接種于6孔板中,待細胞密度達到70%～90%時準備轉(zhuǎn)染;將LipofectamineTM3000與siRNA(OAT-3基因序列為5′-CACCTTTGTGCCCTTGGAUdTdT-3′,OAT-3 siRNA終濃度為10 nmol/L)稀釋于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,混勻后靜置5 min,再將兩者混合并室溫靜置20 min,使之充分混勻;最后將上述混合液加入6孔板,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h進行后續(xù)實驗,進一步分為Control組、IS組、陰性對照組(si-OAT-3組)、si-OAT-3+IS組(si-OAT-3+IS組)均培養(yǎng)24 h后,用PBS清洗細胞2次,加入TRIzol裂解液,取總RNA,采用RT-PCR方法做后續(xù)檢測。

1.2.4 抗氧化劑預(yù)處理實驗 HK-2細胞進一步分為Control組、IS組以及NAC+IS組。NAC+IS組需要加入1 mmol/L抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)并孵育4 h后,加入IS刺激HK-2細胞孵育24 h。3組棄去培養(yǎng)液,用PBS清洗細胞2次,加入TRIzol裂解液,取總RNA,采用RT-PCR方法檢測氧化應(yīng)激(Nox-4)及纖維化因子指標的mRNA相對表達水平。

1.2.5 實時定量RT-PCR檢測OAT-3、Nox-4、Collagen I等mRNA表達水平 參考我們前期研究[5],采用實時定量(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)測定空白對照組、IS組、siOAT-3組以及NAC與處理組HK-2細胞中OAT-3、Nox-4、Collagen I、TGF-β1、α-SMA、Smad-3的mRNA表達。目的基因和GAPDH管家基因引物序列見表1。RT-PCR反應(yīng)嚴格按照試劑盒操作說明進行,應(yīng)用2-△△CT計算出目標基因的相對表達水平。

表1 基因引物序列

1.2.6 Western blot檢測OAT-3、Nox-4、Collagen I等蛋白表達水平 參考我們前期研究[4],各組HK-2細胞培養(yǎng)皿中加入蛋白裂解液(50 mmol/L PIPA)裂解細胞,提取蛋白質(zhì),其濃度測定使用采用BCA試劑盒。上樣每孔加入20 μg蛋白,聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移至聚偏二佛乙烯(PVDF)膜上,封閉,洗膜后加一抗(1∶1000)4 ℃過夜,然后用1×TBST洗膜3次 5 min,再與二抗(1∶10000)室溫孵育1 h,在用1×TBST洗膜3次 5 min,β-actin作為內(nèi)參照。置于凝膠成像儀中照相并應(yīng)用Image J軟件對目的蛋白質(zhì)條帶灰度進行分析。

2 結(jié)果

2.1 IS誘導(dǎo)HK-2細胞氧化應(yīng)激及纖維化因子的高表達 與Control組比較,IS顯著增加氧化應(yīng)激(Nox-4)及纖維化因子(Collagen I、TGF-β1、Smad-3、α-SMA)的mRNA表達水平(t分別為3.778、4.649、7.677、7.677、3.929,均P<0.05),見圖2。提示IS顯著誘導(dǎo)HK-2細胞氧化應(yīng)激及纖維化指標的高表達。

圖2 IS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及纖維化因子指標mRNA水平的高表達

2.2 敲低OAT-3阻斷IS誘導(dǎo)HK-2細胞氧化應(yīng)激及纖維化因子的高表達 為了檢測OAT-3轉(zhuǎn)染效率,我們將si-RNA陰性對照和si-OAT-3轉(zhuǎn)染到HK-2細胞,培養(yǎng)48 h后,加入IS刺激24 h后分別提取總RNA進行分析。結(jié)果顯示,HK-2細胞中敲低OAT-3抑制其mRNA表達(F=112.6,P<0.05),見圖3;si-OAT-3組和si-OAT-3+IS組均顯著降低氧化應(yīng)激(Nox-4)及纖維化因子(Collagen I、TGF-β1、Smad-3、α-SMA)的mRNA以及蛋白表達水平顯著低于IS組(F分別為61.21、75.02、93.99、65.04、126.20,均P<0.05),見圖4。提示敲低OAT-3阻斷IS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及纖維化因子的高表達。

圖3 敲低OAT-3抑制其mRNA及蛋白表達水平

圖4 敲低OAT-3阻斷IS誘導(dǎo)HK-2細胞氧化應(yīng)激及纖維化因子的高表達

2.3 抗氧化劑NAC抑制HK-2細胞氧化應(yīng)激及纖維化因子的高表達 最終HK-2細胞以抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理后,加入250 μmoL濃度的IS刺激24 h后,分別采用RT-PCR及Western blot方法檢測上述指標的mRNA和蛋白表達水平。結(jié)果顯示,NAC顯著抑制IS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激(Nox-4)及纖維化因子(Collagen I、TGF-β1、Smad-3、α-SMA)的mRNA及蛋白的表達水平(F分別為16.83、171.40、49.61、62.12、45.25,均P<0.05),見圖5。提示NAC有效抑制IS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及纖維化因子的高表達。

圖5 NAC抑制HK-2細胞氧化應(yīng)激及纖維化因子的mRNA及蛋白水平的高表達

3 討論

尿毒癥期患者體內(nèi)各種尿毒素的蓄積可加速腎衰并引起腎和心血管系統(tǒng)的并發(fā)癥。依據(jù)尿毒素與蛋白質(zhì)結(jié)合的能力,尿毒素可分為蛋白質(zhì)結(jié)合型毒素和非蛋白質(zhì)結(jié)合型毒素。現(xiàn)有的透析方法能除去大部分非蛋白質(zhì)結(jié)合型毒素,卻對蛋白質(zhì)結(jié)合型毒素無能為力[6-7]。近些年來在尿毒癥領(lǐng)域被廣泛關(guān)注的IS是一種由色氨酸衍生物代謝生成的蛋白結(jié)合型毒素,由吃下的食物分解出的色氨酸在腸道中被腸內(nèi)菌如大腸桿菌的色氨酸酶分解為吲哚,再被腸黏膜吸收,經(jīng)門靜脈系統(tǒng)進入肝臟,在肝細胞中經(jīng)羥化作用和硫酸鹽化形成IS[8]。正常人體中IS主要通過尿液排出體外,腎臟腎小管細胞上高表達的有機陰離子轉(zhuǎn)運體(OATs)能介導(dǎo)IS的攝取。當腎實質(zhì)性損傷時,功能性腎小管細胞急劇減少,于是IS大量蓄積于人體血液中;隨著CKD進展,患者血液中IS的含量持續(xù)增加[9-10]。不管是血液透析還是腹膜透析都無法有效地去除IS,原因在于大部分IS都以蛋白結(jié)合形式存在于血液中,而結(jié)合后的化合物直徑大于透析膜孔徑,從而難以清除。

研究發(fā)現(xiàn),在5/6切除的小鼠腎衰模型中IS是誘導(dǎo)腎功能衰竭及腎纖維化加重的尿毒素,而腎衰的同時使得IS在體內(nèi)進一步蓄積,其水平上升,兩者相互促進形成惡性循環(huán)[11-12]。OAT-3主要分布于腎臟、心血管及腦組織,但在腎臟中的分布量最多[12]。IS在腎臟中的排泄與腎近端小管上皮細胞中OAT-3密切有關(guān)。IS經(jīng)OAT-3進入細胞內(nèi)并引起細胞內(nèi)氧化和抗氧化平衡的失衡,使得氧化應(yīng)激過量產(chǎn)生在腎小管和腎小球的基質(zhì)細胞中升高轉(zhuǎn)化生長因子β1以及膠原蛋白等的表達,加速腎小球硬化從而加速腎衰竭[13-15]。在大鼠腎衰竭模型中IS通過OAT-3攝取進入平滑肌細胞內(nèi)并引導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生,激活芳香烴受體和NF-κB等細胞信號傳導(dǎo)系統(tǒng),從而誘導(dǎo)血管平滑肌細胞的增殖以及血管鈣化等病變[16]。本研究中,IS刺激體外培養(yǎng)HK-2細胞中氧化應(yīng)激及纖維化因子的高表達;敲低OAT-3能夠阻斷IS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及纖維化因子的高表達,提示阻斷IS經(jīng)OAT-3攝取入腎小管上皮細胞能夠抑制纖維化的發(fā)生。

纖維化作為許多慢性炎癥性疾病最終的病理變化,其主要的改變?yōu)槔w維結(jié)締組織過度積累于炎癥或損傷的組織內(nèi)或周圍,引起永久性瘢痕、器官結(jié)構(gòu)破壞及功能不全,乃至死亡[17-20]。纖維化的發(fā)生與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、TGF-β/Smad信號通路、Wnt/β-catenin信號通路及脂代謝相關(guān),其中與TGF-β/Smad信號通路之間的關(guān)系較為密切[21]。IS在細胞和組織內(nèi)通過不同途徑影響機體氧化/抗氧化系統(tǒng),并導(dǎo)致該系統(tǒng)的紊亂,從而引起氧化應(yīng)激的產(chǎn)生[22]。NADPH為細胞內(nèi)一組具有氧化活性的酶復(fù)合體,并由六種不同的亞基構(gòu)成,其中Nox-4是與活性氧關(guān)系最密切的氧化酶[23-25]。氧化應(yīng)激與TGF-β在促進組織纖維化中的相互作用亦得到證實,即TGF-β的活化引起細胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生;同時,氧化應(yīng)激同樣刺激潛在的TGF-β形成纖維化[26-27]。本研究結(jié)果顯示,NAC有效抑制IS誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及纖維化因子的高表達,提示IS經(jīng)OAT-3攝取到HK-2細胞內(nèi),進而增加氧化應(yīng)激,最終促進纖維化因子的高表達。

IS是蛋白質(zhì)結(jié)合型的尿毒素,透析治療使其排出體外十分困難,因此加深對IS的認識及其作用機制至關(guān)重要。本研究探討了IS在HK-2細胞中通過OAT-3和氧化應(yīng)激促進纖維化發(fā)生的分子機制,然而其更深入機制以及相關(guān)的阻斷IS的毒性作用和尋找有效的抑制劑方面(如OAT-3抑制劑或抗氧化劑)的研究有待進一步探索。

4 結(jié)論

IS經(jīng)OAT-3攝取到HK-2細胞內(nèi),進而增加氧化應(yīng)激,促進纖維化因子的高表達;敲低OAT-3和抗氧化劑NAC的使用能有效阻斷IS誘導(dǎo)腎小管上皮纖維化的發(fā)生。