＊楊文瑞 路迎雪 顏妍 陳彥博 薛慧 胡善文

（福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 福建 350122）

H2O2是一種重要的氧化劑，廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥消毒、工業(yè)漂白等領(lǐng)域[1]。它能有效殺滅病原微生物，并可分解生成水與氧氣，對環(huán)境影響很小。我國GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中允許在食品加工中使用H2O2作為加工助劑[2]。但是，過量的H2O2也會對人體健康和食品安全造成危害。H2O2作為活性氧自由基的重要前體之一，可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，損傷細(xì)胞膜脂雙層[3]、核酸和蛋白質(zhì)[4]，殘留在食物中的H2O2也可引發(fā)消化道疾病。因此，快速準(zhǔn)確檢測食品及生物樣本中H2O2殘留量，監(jiān)控其在工業(yè)、醫(yī)藥及日常生活中的使用，對保護公共健康和食品安全非常必要。

當(dāng)前對H2O2的分析方法主要有滴定法、分光光度法、電化學(xué)法、色譜法和比色傳感法[5]等。例如Klassen,Normal V.等人[6]探討和比較了碘離子法和高錳酸鉀滴定法兩種測定溶液中過H2O2濃度的方法。Qixin Liu等人[7]通過TMB-Fe3O4@AuNPs合成了一種以四甲基聯(lián)苯胺氧化為顯色反應(yīng)的H2O2雙傳感器。這些方法靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，但對儀器要求高，操作復(fù)雜，不適用于現(xiàn)場快速篩查[8]。因此，亟需研發(fā)一種簡便快速的H2O2檢測方法，用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)的現(xiàn)場監(jiān)測。

沉淀法是一種簡便經(jīng)典的分析檢測方法，利用發(fā)生沉淀反應(yīng)產(chǎn)生的顏色變化實現(xiàn)可視化的定性或定量分析。本文旨在采用4-CN作為顯色試劑，研究建立H2O2的快速檢測方法。通過系統(tǒng)優(yōu)化實驗條件，考察反應(yīng)機理，建立檢測模式，并擴展至實際樣品檢測，為H2O2的快速監(jiān)測提供一種新的可選途徑。

1.試驗部分

（1）試驗試劑。試劑：30% H2O2、4-CN（純度≥99%）、HRP、無水乙醇（純度≥99.7%）、1mg/mL羧基化石墨烯量子點、磷酸緩沖液。所有的化學(xué)試劑通過上海麥克林生化科技有限公司購買的，無需進一步提純就可以使用。

（2）試驗儀器。多功能微孔板酶標(biāo)儀（Infinite 200 PRO，Tecan）。

（3）實驗原理。HRP含有血紅素類的活性中心，可催化各種化合物的氧化還原反應(yīng)。4-CN為HRP的一種典型底物，在HRP催化下，4-CN被H2O2氧化，生成一個自由基中間產(chǎn)物，該自由基迅速偶聯(lián)形成不溶性的紫色聚合物。因此，溶液的顏色由無色變?yōu)樽仙?，顏色深淺和H2O2濃度呈正比。

（4）標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的檢測。本實驗使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2存儲液，通過系數(shù)稀釋的方法配制成12.5μM、25μM、50μM、75μM、100μM 5個不同濃度的H2O2溶液，再分別添加0.2mM 4-CN溶液和0.1mg/mL的HRP溶液，充分混勻后靜置于室溫條件下反應(yīng)10min。顯色結(jié)束后，在光學(xué)拍照箱中使用手機進行拍攝，圖片使用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0讀取色度值。

（5）可視化試紙檢測。利用羧基化石墨烯量子點和HRP修飾硝酸纖維素試紙步驟如下：取1mg/mL羧基化石墨烯量子點和0.1mg/mL的HRP溶液制備石墨烯-HRP混合液，超聲處理使其充分吸附。取硝酸纖維素濾紙，裁剪成小片（1cm×5cm），將石墨烯-HRP混合液涂布在濾紙片上，自然晾干。加入等量的4-CN溶液后按上節(jié)所述完成檢測，使用智能手機記錄濾紙顏色。

（6）實際樣品分析。取新鮮牛奶樣品，配制一系列濃度分別為12.5μM、30μM、45μM、60μM、90μM的H2O2溶液，按上述步驟在紙上完成檢測后拍照。

2.結(jié)果與討論

（1）反應(yīng)動力學(xué)和穩(wěn)定性。啟動反應(yīng)后，使用多功能微孔板酶標(biāo)儀測試混合液在540nm波長下的吸光度變化，如圖1（a）、（b）所示。每60s記錄一次吸光度值，連續(xù)測試35min，獲取反應(yīng)動力學(xué)曲線，如圖1（c）。從結(jié)果曲線可以看出，前5min吸光度快速升高，5～10min吸光度緩慢升高，10min后基本達(dá)吸光平臺期。這表明反應(yīng)體系在前10min內(nèi)“-C-H”基團被H2O2不斷氧化生成著色產(chǎn)物，10min后反應(yīng)基本完成。綜合反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律，確定該體系的最佳反應(yīng)時間為10min。另外對反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進行考察，結(jié)果如圖1（d）所示，在2h內(nèi)色度值基本保持一致。實驗結(jié)果表明，在給定反應(yīng)時間內(nèi)，該體系的RGB值變化很小，反應(yīng)穩(wěn)定，驗證了方法的穩(wěn)定性和可靠性，為后續(xù)樣品分析奠定了基礎(chǔ)。

圖1 檢測方法性能分析

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線。在最優(yōu)條件下，按實驗部分1.4的方法分別測定不同濃度的H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液，讀取RGB數(shù)值對H2O2的濃度建立定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用圖像分析軟件讀取各樣品瓶中溶液的RGB色值，以藍(lán)色色度值（色度值越低代表顏色越深）為計數(shù)依據(jù)，樣品瓶檢測結(jié)果如圖2（a）、（c）、（e）所示。對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與對應(yīng)的RGB值進行線性擬合，如圖2（b）所示，其呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性方程為y=122.8-0.84x，R2=0.992，在優(yōu)化條件下，該體系可檢測到濃度最低達(dá)到5μM的H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液，如圖2（d）所示。

圖2 不同濃度H2O2在樣品瓶中的顯色結(jié)果與對應(yīng)的RGB數(shù)值

（3）試紙性能檢測。試紙上檢測不同濃度H2O2結(jié)果如圖3（a），讀取的RGB數(shù)值如圖3（b）所示。另外取新鮮牛奶樣品進行測定，并與空白對照樣品同時檢測。結(jié)果顯示，牛奶樣品與空白對照樣品的檢測結(jié)果無明顯差異，均未檢出H2O2如圖3（c），讀取的RGB數(shù)值如圖3（d）所示。為驗證方法有效性，對牛奶樣品進行標(biāo)準(zhǔn)溶液的加標(biāo)回收實驗。向牛奶樣品中分別加入濃度已知的H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定加標(biāo)樣本中的H2O2含量如圖3（e），讀取的RGB數(shù)值如圖3（f）所示。將檢測值與加標(biāo)量進行比較，計算加標(biāo)回收率在90.0%～105.0%之間如表1所示。表明在食品樣本中，該方法可以準(zhǔn)確檢測H2O2。

表1 牛奶樣品加標(biāo)回收率計算結(jié)果

圖3 方法檢測性能表征結(jié)果

3.結(jié)論

（1）方法檢驗性能及實際樣品檢測。標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果顯示，在12.5～100μmol/L的范圍內(nèi)，該沉淀反應(yīng)的色度與H2O2濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（R2＞0.99），因此可用于建立的半定量檢測模型。重復(fù)性實驗結(jié)果顯示，在最佳反應(yīng)條件下，同一濃度樣品的RGB數(shù)值相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，說明方法具有良好的重現(xiàn)性。動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，隨反應(yīng)時間延長，樣品顏色逐漸加深，吸光值持續(xù)增加，約5min達(dá)到穩(wěn)定值。樣品穩(wěn)定性研究表明，色度穩(wěn)定后，2h內(nèi)變化不大。

（2）根據(jù)以上參數(shù)制作的H2O2可視化檢測試紙，可以有效完成對標(biāo)準(zhǔn)溶液、牛奶樣品、加標(biāo)牛奶樣品的H2O2檢測。本實驗中，在牛奶樣品中未檢測到H2O2殘留，對加標(biāo)樣品均有明顯的顯色反應(yīng)，加標(biāo)回收實驗中回收率在90.0%～105.0%范圍內(nèi)，表明該方法可以用于食品中H2O2可視化快速檢測。對于其他顏色的樣品，可以采用對照線對比的方式扣除基質(zhì)顏色干擾。

（3）本研究采用的4-CN沉淀法具有操作簡便、快速、試劑易得等優(yōu)點，可在短時間內(nèi)指示樣品中H2O2的大致含量，尤其適用于高濃度H2O2的快速篩查。但作為一種半定量分析手段，該方法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性還需要其他標(biāo)準(zhǔn)定量方法如電化學(xué)、色譜等進行驗證。另外該法靈敏度有限，僅適用于高濃度樣品快速檢測，對低濃度H2O2檢測靈敏度有待提高。因此，建議該方法作為一種快速現(xiàn)場預(yù)篩工具，與其他標(biāo)準(zhǔn)定量分析方法聯(lián)用，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，以獲得準(zhǔn)確可靠的H2O2定量結(jié)果。本研究為快速檢測食品樣品中H2O2殘留提供了一種簡便有效的方法，具有一定的應(yīng)用前景和推廣價值。