吳德建，楊秋，謝桂丹，彭鑫△

肝癌是常見的惡性腫瘤，肝細胞癌（HCC）是肝癌的主要組織學亞型，約占原發(fā)性肝癌的90%，是癌癥相關(guān)死亡的第二大原因［1］。盡管對肝癌手術(shù)治療和分子靶向治療的研究已有較多報道［2］，但由于該病復發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高、預后差，近30年的生存率仍然相對較低［3］。因此，迫切需要尋找新的肝癌治療靶點并探索可能的相關(guān)分子機制。紫草素（SHI）是一種天然萘醌，富含于中草藥紫草中，對癌癥的治療有積極效果［4］。Bao 等［5］研究顯示，SHI 可以通過抑制癌細胞侵襲、遷移以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）來抑制三陰性乳腺癌的發(fā)展。SHI還可抑制宮頸癌細胞增殖、遷移［6］。近期研究發(fā)現(xiàn)SHI 治療HCC 有積極作用［7］。Notch 信號傳導在肝臟穩(wěn)態(tài)和肝癌發(fā)生中起關(guān)鍵作用，Notch信號的持續(xù)失調(diào)會對肝臟炎癥和腫瘤發(fā)展產(chǎn)生重要影響［8］。Shi 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，抑制Notch信號通路可以促進肝卵圓細胞分化為肝細胞，進而減輕肝損傷。Xu等［6］的研究表明抑制Notch 信號通路中hairy相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（HEY）1的表達可以抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移。本研究旨在探討SHI是否可以通過抑制Notch信號通路，降低肝癌細胞惡性生物學活性，進而發(fā)揮抗癌作用。

1 材料與方法

1.1 組織標本 收集2018 年1 月—2022 年1 月在儋州市人民醫(yī)接受腹腔鏡精準切除術(shù)的20例肝癌患者的癌組織及癌旁組織標本，所有患者均有慢性乙型肝炎病史，術(shù)前均未接受經(jīng)導管動脈化療栓塞術(shù)、免疫治療或靶向抗癌治療。本研究取得患者及其家屬同意，且經(jīng)我院倫理審查委員會批準（批號：2017-10-007）。

1.2 細胞及主要材料 SHI 購自南京賽泓瑞生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自上海廣銳生物科技有限公司；Notch通路激活劑丙戊酸（VPA）、Notch 信號抑制劑DAPT 均購自MedChemExpress LLC；正常肝細胞HL-7702 細胞及肝癌HepG2、Hep3B、HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721 細胞均購自上海名勁生物科技有限公司；Notch、內(nèi)參蛋白GAPDH 兔抗人一抗、辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG 二抗購自英國Abcam 公司；發(fā)狀分裂相關(guān)增強子-1（HES1）兔抗人一抗購自NSJ Bioreagents；HEY1兔抗人一抗購自Biotrend；B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、活化的胱天蛋白酶-3（cleaved-Caspase-3）、鈣黏蛋白E（E-Cadherin）、神經(jīng)性鈣黏素（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）兔抗人一抗購自Cell Signaling Technology；NovoCyte 流式細胞儀購自廣州柏賽柯生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自北京達科為生物技術(shù)有限公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及分組 將肝癌細胞（HepG2、Hep3B、HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721）及正常肝細胞（HL-7702）用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合物的DMEM培養(yǎng)基（37 ℃，5%CO2）培養(yǎng)。將Notch、HES1及HEY1蛋白表達最高的肝癌細胞用于后續(xù)實驗，分為對照組（未做任何處理）、LSHI 組（1 μmol/L SHI 處理）、M-SHI 組（2 μmol/L SHI 處理）、H-SHI 組（4 μmol/L SHI 處理）［10］、DAPT 組（50 μmol/L DAPT 處理［11］）、H-SHI+VPA 組（4 μmol/L SHI 和8 mmol/L VPA［12］共同處理），培養(yǎng)48 h。

1.4 Western blot 檢測Notch、EMT 相關(guān)蛋白、凋亡蛋白表達 將組織或各組肝癌細胞與裂解液混合，30 min后抽取蛋白通過BCA法定量，隨后加入緩沖液進行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜，成功后用脫脂牛奶封閉，加入一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、cleaved-Caspase-3（1∶2 000）、Notch（1∶2 000）、（1∶2 000）、HEY1（1∶2 000）、E-cadherin（1∶2 000）、Ncadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）和GAPDH（1∶1 000），4 ℃下孵育過夜，加入二抗（1∶1 000），ECL試劑染色后，對目的條帶拍照，以GAPDH 作為內(nèi)參，用Image J 軟件分析蛋白質(zhì)條帶。

1.5 CCK-8法檢測Huh-7細胞增殖以及平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力 將Huh-7 細胞按5×103個/孔的密度接種在96 孔板，培養(yǎng)2 d 后，將Huh-7 細胞與10 μL CCK8 一起孵育2 h。使用酶標儀測定450 nm波長處的光密度（OD）值。

將Huh-7 細胞以1×105個/孔的密度接種到6 孔板中，培養(yǎng)15 d 后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察菌落。

1.6 流式細胞術(shù)檢測Huh-7 細胞凋亡以及細胞周期 收集Huh-7 細胞，用PBS 沖洗2 次后，將Huh-7 細胞置于預冷的70%乙醇中固定2 h，隨后以1 000×g離心5 min，與25 μL PI和10 μL RNase A避光孵育30 min，使用NovoCyte流式細胞儀進行細胞周期分析。將肝癌細胞配置成2.5×105個/mL懸浮液，取100 μL 細胞懸液與5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI 孵育，使用NovoCyte流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 細胞劃痕實驗和Transwell 侵襲實驗分別檢測Huh-7細胞遷移和侵襲情況 （1）遷移。取各組肝癌細胞接種在6孔板，在37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)，待細胞生長密度達70%，用移液器槍頭制造人工劃痕，隨后加入無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)0、12 h置于顯微鏡下拍照。用Image J軟件分析遷移率，遷移率（%）=［（0 h劃痕面積-12 h劃痕面積）/0 h劃痕面積］×100%。（2）侵襲。用無血清培養(yǎng)基將肝癌細胞調(diào)整為5×104個/mL，Transwell 下室加入600 μL DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），Transwell上室先鋪滿基質(zhì)膠，再加入200 μL無血清細胞懸液，Transwell小室置于37 ℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，PBS洗滌后，擦拭上室未侵襲的肝癌細胞，于顯微鏡下計算穿膜細胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0 軟件處理數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗后以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Notch、HES1、HEY1 在組織和細胞中的表達 癌組織較癌旁組織Notch、HES1、HEY1 蛋白水平均升高（P＜0.01）；與HL-7702細胞相比，HepG2、Hep3B、HCCLM3、Huh-7、SMMC-7721 細胞中Notch、HES1、HEY1 蛋白水平均升高（P＜0.05），且Huh-7細胞升高最明顯，見表1、2，圖1、2。以Huh-7細胞為研究對象。

Fig.1 Western blot detection of Notch,HES1 and HEY1 protein expression in liver cancer tissue and adjacent tissue圖1 Western blot檢測肝癌組織及癌旁組織中Notch、HES1、HEY1蛋白表達

Fig.2 Western blot detection of Notch,HES1 and HEY1 protein levels in normal hepatocytes and hepatoma cells圖2 Western blot檢測正常肝細胞及肝癌細胞中Notch、HES1、HEY1蛋白水平

Tab.1 Expression of Notch,HES1 and HEY1 proteins in liver cancer tissue and adjacent tissue表1 Notch、HES1、HEY1蛋白在癌組織及癌旁組織中的表達（n=20，±s）

Tab.1 Expression of Notch,HES1 and HEY1 proteins in liver cancer tissue and adjacent tissue表1 Notch、HES1、HEY1蛋白在癌組織及癌旁組織中的表達（n=20，±s）

＊＊P＜0.01。

組別癌旁組織癌組織t Notch 0.78±0.09 1.41±0.13 17.819＊＊HES1 0.63±0.07 1.24±0.11 10.633＊＊HEY1 0.39±0.05 1.37±0.14 29.481＊＊

Tab.2 Expression of Notch,HES1 and HEY1 proteins in normal liver cells and liver cancer cells表2 Notch、HES1、HEY1蛋白在正常肝細胞及肝癌細胞中的表達（n=6，±s）

Tab.2 Expression of Notch,HES1 and HEY1 proteins in normal liver cells and liver cancer cells表2 Notch、HES1、HEY1蛋白在正常肝細胞及肝癌細胞中的表達（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與HL-7702細胞比較，P＜0.05。

組別HL-7702細胞HepG2細胞Hep3B細胞HCCLM3細胞SMMC-7721細胞Huh-7細胞F Notch 0.60±0.06 1.41±0.13a 1.33±0.12a 1.35±0.14a 1.37±0.15a 1.60±0.17a 67.663＊＊HES1 0.51±0.05 1.05±0.09a 1.13±0.12a 1.07±0.11a 1.09±0.13a 1.23±0.14a 52.880＊＊HEY1 0.35±0.04 1.16±0.12a 1.22±0.13a 1.26±0.14a 1.24±0.16a 1.42±0.17a 81.609＊＊

2.2 SHI 對Huh-7 細胞中Notch、HES1、HEY1 蛋白表達的影響 與對照組相比，L-SHI 組、M-SHI 組、H-SHI 組、DAPT 組Notch、HES1、HEY1 蛋白表達水平下調(diào)（P＜0.05），且SHI 的作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性；H-SHI+VPA 組較H-SHI 組Notch、HES1、HEY1蛋白表達水平上調(diào)（P＜0.05），見圖3、表3。

Fig.3 Western blot detection of effects of SHI on Notch,HES1 and HEY1 proteins in Huh-7 cells圖3 Western blot檢測SHI對Huh-7細胞中Notch、HES1、HEY1蛋白的影響

Tab.3 Effects of SHI on Notch,HES1 and HEY1 proteins in Huh-7 cells表3 SHI對Huh-7細胞中Notch、HES1、HEY1蛋白表達的影響（n=6，±s）

Tab.3 Effects of SHI on Notch,HES1 and HEY1 proteins in Huh-7 cells表3 SHI對Huh-7細胞中Notch、HES1、HEY1蛋白表達的影響（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與L-SHI組比較，c與M-SHI組比較，d與H-SHI組比較，P＜0.05；表4—8同。

組別對照組L-SHI組M-SHI組H-SHI組DAPT組H-SHI+VPA組F Notch 1.63±0.19 1.31±0.15a 0.98±0.10ab 0.64±0.06abc 0.72±0.07a 1.39±0.14d 96.630＊＊HES1 1.26±0.14 1.03±0.12a 0.80±0.09ab 0.63±0.08abc 0.39±0.03a 1.11±0.14d 91.860＊＊HEY1 1.48±0.17 1.15±0.13a 0.79±0.09ab 0.38±0.04abc 0.89±0.09a 1.27±0.15d 106.778＊＊

2.3 SHI 對Huh-7 細胞增殖的影響 與對照組相比，L-SHI 組、M-SHI 組、H-SHI 組、DAPT 組OD450值及克隆數(shù)均降低（P＜0.05），且SHI 的作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性；H-SHI+VPA 組較H-SHI 組OD450值及克隆數(shù)升高（P＜0.05），見圖4、表4。

Fig.4 Effects of SHI on the formation of Huh-7 cell clone圖4 SHI對Huh-7細胞克隆形成的影響

Tab.4 Effects of SHI on OD450 value and clone number of Huh-7 cells表4 SHI對Huh-7細胞OD450值及克隆數(shù)的影響（n=6，±s）

Tab.4 Effects of SHI on OD450 value and clone number of Huh-7 cells表4 SHI對Huh-7細胞OD450值及克隆數(shù)的影響（n=6，±s）

組別對照組L-SHI組M-SHI組H-SHI組DAPT組H-SHI+VPA組F OD450值1.33±0.14 1.12±0.11a 0.89±0.09ab 0.67±0.07abc 0.70±0.06a 1.18±0.12d 69.795＊＊克隆數(shù)/個56.76±5.94 44.83±5.54a 35.37±4.65ab 24.16±2.21abc 26.73±2.02a 45.17±5.47d 32.725＊＊

2.4 SHI 對Huh-7 細胞凋亡的影響 與對照組相比，L-SHI 組、M-SHI 組、H-SHI 組、DAPT 組G1/G0期細胞比例升高，S 期和G2/M 期細胞比例降低，凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3 均升高，Bcl-2 蛋白表達水平降低（P＜0.05），且SHI 的作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性；H-SHI+VPA 組較H-SHI組G1/G0期細胞比例、凋亡率、Bax、cleaved-Caspase-3 均降低（P＜0.05），S期和G2/M期細胞比例、Bcl-2蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖5—7，表5、6。

Fig.5 Effects of SHI on cell cycle of Huh-7 cells by flow cytometry圖5 流式細胞術(shù)檢測SHI對Huh-7細胞細胞周期的影響

Fig.6 Detection of Huh-7 cell apoptosis by flow cytometry圖6 流式細胞術(shù)檢測Huh-7細胞凋亡

Fig.7 Effects of SHI on Bcl-2,Bax,cleaved-Caspase-3 protein levels in Huh-7 cells圖7 SHI對Huh-7細胞中Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-3蛋白水平的影響

Tab.5 Effects of SHI on cell cycle of Huh-7 cells表5 SHI對Huh-7細胞細胞周期的影響（n=6，%，±s）

Tab.5 Effects of SHI on cell cycle of Huh-7 cells表5 SHI對Huh-7細胞細胞周期的影響（n=6，%，±s）

組別對照組L-SHI組M-SHI組H-SHI組DAPT組H-SHI+VPA組F細胞周期分布G1/G0 44.13±4.27 51.01±5.53a 52.89±5.76a 58.34±5.65a 57.23±5.34a 50.78±5.56d 9.124＊＊S 38.45±3.56 33.65±3.16a 31.92±3.03a 26.53±2.45a 27.96±2.67a 33.12±3.32d 20.200＊＊G2/M 17.42±1.69 15.34±1.79a 15.19±1.57a 15.13±1.35a 14.81±1.23a 16.10±1.37d 7.609＊＊

Tab.6 Effects of SHI on apoptosis rate and apoptoticprotein of Huh-7 cells表6 SHI對Huh-7細胞凋亡率和凋亡蛋白的影響（n=6，±s）

Tab.6 Effects of SHI on apoptosis rate and apoptoticprotein of Huh-7 cells表6 SHI對Huh-7細胞凋亡率和凋亡蛋白的影響（n=6，±s）

組別對照組L-SHI組M-SHI組H-SHI組DAPT組H-SHI+VPA組F凋亡率/%2.43±0.27 5.35±0.52a 8.65±0.98ab 11.65±1.23abc 9.97±0.96a 4.78±0.46d Bcl-2 1.45±0.17 1.11±0.12a 0.82±0.09ab 0.53±0.05abc 0.46±0.04a 1.17±0.12d Bax 0.32±0.02 0.73±0.06a 1.04±0.11ab 1.36±0.14abc 1.30±0.13a 0.67±0.07d cleaved-Caspase-3 0.33±0.03 0.69±0.07a 0.99±0.09ab 1.37±0.14abc 1.28±0.12a 0.57±0.06d 187.108＊＊129.293＊＊168.904＊＊197.238＊＊

2.5 SHI 對Huh-7 細胞侵襲、遷移以及EMT 相關(guān)蛋白的影響 與對照組相比，L-SHI 組、M-SHI 組、HSHI 組、DAPT 組遷移率、侵襲細胞數(shù)目以及Ncadherin、Vimentin 水平降低（P＜0.05），E-cadherin水平升高（P＜0.05），且SHI 的作用效果呈現(xiàn)劑量依賴性；H-SHI+VPA 組較H-SHI 組遷移率、侵襲細胞數(shù)目以及N-cadherin、Vimentin水平升高（P＜0.05），E-cadherin水平降低（P＜0.05），見圖8—10，表7、8。

Fig.8 Effects of SHI on the number of invasive cells of Huh-7 cells（×200）圖8 SHI對Huh-7細胞侵襲細胞數(shù)量的影響（×200）

Fig.9 Effects of SHI on the migration rate of Huh-7 cells圖9 SHI對Huh-7細胞遷移率的影響

Fig.10 Western blot detection of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin protein levels in Huh-7 cells圖10 Western blot檢測Huh-7細胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白水平

Tab.7 Effects of SHI on migration rate and number of invasive cells of Huh-7 cells表7 SHI對Huh-7細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)目的影響（n=6，±s）

Tab.7 Effects of SHI on migration rate and number of invasive cells of Huh-7 cells表7 SHI對Huh-7細胞遷移率和侵襲細胞數(shù)目的影響（n=6，±s）

組別對照組L-SHI組M-SHI組H-SHI組DAPT組H-SHI+VPA組F遷移率/%30.22±3.32 23.94±2.37a 16.74±1.70ab 10.86±1.23abc 12.13±1.26a 25.48±2.76d 121.414＊＊侵襲細胞數(shù)目/（個/視野）205.43±20.25 183.35±19.48a 166.33±16.46ab 141.57±15.13abc 150.73±15.97a 199.87±20.42d 20.769＊＊

Tab.8 Effects of SHI on levels of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin in Huh-7 cells表8 SHI對Huh-7細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達水平的影響（n=6，±s）

Tab.8 Effects of SHI on levels of E-cadherin,N-cadherin and Vimentin in Huh-7 cells表8 SHI對Huh-7細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達水平的影響（n=6，±s）

組別對照組L-SHI組M-SHI組H-SHI組DAPT組H-SHI+VPA組F E-cadherin 0.22±0.02 0.39±0.04a 0.57±0.06ab 0.78±0.09abc 0.72±0.07a 0.36±0.03d 148.635＊＊N-cadherin 0.90±0.09 0.71±0.07a 0.52±0.05ab 0.30±0.02abc 0.35±0.03a 0.79±0.09d 143.108＊＊Vimentin 1.18±0.21 0.98±0.09a 0.74±0.08ab 0.52±0.05abc 0.58±0.06a 1.04±0.13d 52.235＊＊

3 討論

由于腫瘤復發(fā)率高且常發(fā)生轉(zhuǎn)移，HCC 患者的預后并不理想［13］。針對腫瘤細胞的惡性表型包括細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的治療是緩解HCC 進展的重要策略。SHI 是細胞分裂周期25（Cdc25）磷酸酶的抑制劑，可誘導細胞周期停滯［3］。研究報道，SHI 可抑制多種人類癌細胞系的生長，可誘導前列腺癌細胞發(fā)生壞死性凋亡，進而抑制前列腺癌的發(fā)展［14］。Tsai 等［15］發(fā)現(xiàn)SHI可以誘導腎癌細胞程序性死亡。SHI 還可以促進HCC 細胞凋亡，抑制其增殖［7］。Li 等［16］也發(fā)現(xiàn)SHI 可以誘導結(jié)腸癌細胞周期停滯，抑制細胞增殖，表明SHI 具有廣泛的抗癌作用。本研究發(fā)現(xiàn)，SHI 處理后Huh-7 細胞活力、S 期和G2期細胞比例、Bcl-2蛋白水平均降低，G1/G0期細胞比例、細胞凋亡率、Bax 和cleaved-Caspase-3 蛋白水平升高，表明SHI 可能通過上調(diào)促凋亡基因（Bax、cleaved-Caspase-3），下調(diào)抗凋亡基因（Bcl-2），來調(diào)節(jié)細胞周期，進而加速Huh-7細胞凋亡。研究報道，EMT是肝癌細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵原因，上皮標志物E-cadherin 表達量降低以及間充質(zhì)標志物N-cadherin、Vimentin表達量升高可以使肝癌細胞獲得間充質(zhì)細胞的特性，從而促進肝癌細胞的運動性，導致肝癌的發(fā)展［17］。本研究發(fā)現(xiàn)SHI處理后Huh-7細胞遷移和侵襲數(shù)目、N-cadherin、Vimentin 蛋白水平均降低，E-cadherin 蛋白水平升高，表明SHI 可能通過使肝癌上皮細胞保持上皮特征，阻止其獲得間質(zhì)表型，進而抑制肝癌細胞擴散到其他鄰近組織。

Notch 信號通路在癌癥進展中的作用已經(jīng)得到證實。Li 等［18］研究發(fā)現(xiàn)通過抑制結(jié)腸癌細胞中的Notch-HES1信號傳導可抑制EMT，進而抑制結(jié)腸癌進展。Zhang 等［19］發(fā)現(xiàn)上調(diào)Notch 可促進乳腺癌細胞遷移。Xiang 等［11］發(fā)現(xiàn)抑制Notch 信號可促進肝癌細胞凋亡，從而起到抗癌作用。本研究結(jié)果與Xiang 等［11］的研究一致。在本研究中，Notch、HES1、HEY1在肝癌組織和肝癌細胞中高表達，且SHI處理后Huh-7 細胞中Notch、HES1、HEY1 蛋白表達水平下調(diào)，提示SHI可能通過抑制Notch信號通路發(fā)揮降低肝癌細胞惡性生物學行為的作用，為了進一步證實該結(jié)論，本研究用Notch 信號抑制劑DAPT 處理Huh-7細胞，SHI和Notch通路激活劑VPA共同處理Huh-7 細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DAPT 組效果與H-SHI 組相似，而VPA削弱了H-SHI抑制Huh-7細胞惡性生物學行為的作用，進一步證實SHI可能通過抑制Notch信號通路發(fā)揮抗肝癌作用。

綜上所述，SHI 可能通過下調(diào)Notch 信號通路，抑制肝癌細胞惡性生物學行為，從而發(fā)揮抗肝癌作用，且SHI 的治療效果呈現(xiàn)劑量依賴性。本研究不足之處是未觀察其他與肝癌相關(guān)的通路是否也起到相同效果，后續(xù)將進行通路比較，完善相關(guān)治療機制的研究。