徐 言，陳之光，徐玉鳳，葛 紅，楊樹華，趙 鑫，寇亞平，于曉南，賈瑞冬*

基于SSR標(biāo)記的西南地區(qū)野生帶葉兜蘭資源遺傳多樣性分析

徐 言1,2，陳之光2，徐玉鳳2，葛 紅2，楊樹華2，趙 鑫2，寇亞平2，于曉南1*，賈瑞冬2*

1. 北京林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院/花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家花卉工程技術(shù)研究中心/城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京市實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部花卉生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（北方），北京 100081

帶葉兜蘭[(Lindl. ex Hook. f.) Stein]具有較高的觀賞價(jià)值，是中國(guó)珍稀瀕危保護(hù)植物。為了研究中國(guó)西南地區(qū)野生帶葉兜蘭資源的遺傳特性，促進(jìn)野生帶葉兜蘭資源的保護(hù)和利用，本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)中國(guó)西南地區(qū)廣西、云南、貴州3?。▍^(qū)）收集的6個(gè)居群190份帶葉兜蘭資源進(jìn)行遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明：從115對(duì)引物中共篩選出10對(duì)擴(kuò)增效果好的引物，10對(duì)SSR引物在190份帶葉兜蘭中共檢測(cè)到50個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因（N）為5個(gè)，平均有效等位基因數(shù)（N）為2.4835個(gè)；平均Shannon信息指數(shù)（）為0.8592，平均觀測(cè)雜合度（H）為0.4518；平均期望雜合度（H）為0.4387，平均Nei’s基因多樣性指數(shù)（）為0.4370，平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.3996。6個(gè)野生帶葉兜蘭居群的N為2.8000～4.3000，N為1.9655～2.4060， H為0.3891～0.4839，H為0.3795～0.4683，Shannon信息指數(shù)（）為0.6584～0.8369，Nei’s基因多樣性指數(shù)（）為0.3648～0.4382。廣西雅長(zhǎng)（GYC）和貴州萬峰湖（QWF）居群具有較高的遺傳多樣性（=0.4382,=0.4276），廣西木論（GML）居群具有最低的遺傳多樣性（=0.3648）。分子方差分析（AMOVA）結(jié)果表明，遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi)個(gè)體間（94%），而居群內(nèi)遺傳分化很小（6%）。基于遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，6個(gè)居群遺傳距離較小，居群間遺傳距離和地理位置不完全相關(guān)。Structure和主坐標(biāo)分析結(jié)果表明，居群間存在均質(zhì)化現(xiàn)象，無明顯類群劃分。綜上，帶葉兜蘭資源遺傳多樣性較為豐富，研究結(jié)果可為中國(guó)西南地區(qū)野生帶葉兜蘭資源的保護(hù)和利用提供理論依據(jù)。

帶葉兜蘭；野生居群；SSR標(biāo)記；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)

帶葉兜蘭[(Lindl. ex Hook. f.) Stein]為蘭科（Orchidaceae），杓蘭亞科（Subfam. Cypripedioideae）兜蘭屬（Pfitz.）植物，自然花期3—5月，主要分布于中國(guó)、印度東北部、越南、老撾和泰國(guó)，其中在中國(guó)分布于廣西北部至西部、貴州西南部、云南東南部等地[1]。由于生境破壞、過度采集和非法貿(mào)易等情況嚴(yán)重，使帶葉兜蘭野生資源遭受嚴(yán)重的威脅。目前帶葉兜蘭野生種已被列入《野生動(dòng)植物瀕危物種國(guó)際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅰ的保護(hù)范圍，絕對(duì)禁止在國(guó)際上貿(mào)易[2-4]。它還被收錄于《中國(guó)高等植物紅色名錄》，評(píng)估等級(jí)為易危（VU），且有野生帶葉兜蘭居群呈現(xiàn)破碎化現(xiàn)象的報(bào)道[5-6]。此外帶葉兜蘭是一個(gè)變異幅度很大的種，在花的結(jié)構(gòu)上有很多變化[1]。因此，利用分子技術(shù)對(duì)帶葉兜蘭野生資源及其遺傳狀況進(jìn)行研究具有重要的意義。

分子標(biāo)記技術(shù)在蘭科植物研究中已被廣泛使用。在兜蘭屬植物研究中，有基于ITS序列[7-8]、RAPD[9]和SRAP[10]標(biāo)記的種間親緣關(guān)系及其分類歸屬研究，有基于cpDNA[11]分子標(biāo)記的系統(tǒng)進(jìn)化研究，有基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)SSR引物[12-13]的研究，以及基于SRAP[14-16]、ISSR[16-18]和SSR[12]標(biāo)記的遺傳多樣性研究，其中關(guān)于帶葉兜蘭的研究報(bào)道較少，僅見基于SRAP標(biāo)記對(duì)廣西木論自然保護(hù)區(qū)的40份野生帶葉兜蘭資源[14]和基于SSR標(biāo)記對(duì)廣西雅長(zhǎng)自然保護(hù)區(qū)的32份野生帶葉兜蘭資源進(jìn)行遺傳多樣性研究的報(bào)道[12]。中國(guó)西南地區(qū)的云南、貴州和廣西3個(gè)省（區(qū)）均為中國(guó)帶葉兜蘭的主要分布地區(qū)，而只有以上2篇研究廣西地區(qū)帶葉兜蘭單居群遺傳多樣性的文獻(xiàn)，涉及的采集樣本均有一定的地域局限性，且未涵蓋多居群和群體結(jié)構(gòu)研究，不足以反映中國(guó)帶葉兜蘭資源的遺傳水平。

SSR簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）又稱為微衛(wèi)星（microsatellites）或者串聯(lián)重復(fù)序列（STR），由1～6個(gè)堿基為重復(fù)單位組成的短串聯(lián)重復(fù)序列，它廣泛、豐富且隨機(jī)地分布于真核生物基因組中[19]。SSR標(biāo)記具有數(shù)量多、分布廣、多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性和易檢測(cè)等特點(diǎn)，已經(jīng)成為研究種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的最有效分子標(biāo)記之一[20]。

本研究以云南、貴州和廣西的6個(gè)野生帶葉兜蘭居群為研究材料，在已發(fā)表的帶葉兜蘭表型多樣性研究的基礎(chǔ)上[21]，利用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析和群體結(jié)構(gòu)分析，并綜合分析表型數(shù)據(jù)和分子數(shù)據(jù)，以期為中國(guó)西南地區(qū)野生帶葉兜蘭的資源保護(hù)工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)網(wǎng)上搜索、相關(guān)文獻(xiàn)記載和實(shí)地踏查情況，采集來源于帶葉兜蘭天然分布區(qū)內(nèi)廣西、云南和貴州3?。▍^(qū)）的6個(gè)野生居群，共計(jì)190份樣品，具體采樣信息見表1和圖1。其中在廣西木論（GML）和云南柳井（YDZ）居群帶葉兜蘭分布范圍較窄，數(shù)量較少，因此采集到的樣本數(shù)量也相對(duì)較少。采樣標(biāo)準(zhǔn)為居群間的地理距離大于10 km，株間距大于10 m，且無病蟲害。每個(gè)單株采集新鮮葉片放入裝有變色硅膠的塑料自封袋中，干燥備用。

表1 6個(gè)居群的采樣信息

圖1 樣品采集點(diǎn)分布圖

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 基因組DNA的提取參照本實(shí)驗(yàn)室改良后的亨利兜蘭基因組CTAB提取方法進(jìn)行[22]。獲取的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度和完整性，并用Nanodrop 2000微量分光光度計(jì)（Thermo，美國(guó)）檢測(cè)濃度和質(zhì)量，將合格的DNA樣品保存于?20 ℃，備用。

1.2.2 SSR引物篩選 參考本實(shí)驗(yàn)室基于亨利兜蘭轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的引物[22]，從115對(duì)引物中共篩選出10對(duì)擴(kuò)增效果好的SSR引物（表2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司北京分公司合成。

表2 10對(duì)SSR引物信息

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 在C1000 Touch實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)）上進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系（20 μL）：10×buffer 2.0 μL，dNTPs 1.5 μL，上、下游引物各2.0 μL，Ex0.2 μL，DNA 3.0 μL，ddH2O 9.3 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)10次；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)15次；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環(huán)10次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，合格后送至上海天昊生物公司進(jìn)行基于二代測(cè)序技術(shù)的SSR基因分型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件統(tǒng)計(jì)并整理SSR基因分型數(shù)據(jù)。利用Genalex 6.501[23]和PopGene 1.32[24]軟件計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)比率（PPB）、等位基因數(shù)（N）、有效等位基因數(shù)（N）、Shannon信息指數(shù)（）、觀測(cè)雜合度（H）、期望雜合度（H）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（）、Nei’s遺傳距離（G）、遺傳相似性（G）和基因流（N）等。利用PIC-Calc軟件計(jì)算多態(tài)信息含量（PIC）。利用Genalex 6.501[23]軟件進(jìn)行基于遺傳距離的主成分分析（PCoA）和分子方差分析（AMOVA）。利用Mega 7.0[25]軟件的非加權(quán)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建基于遺傳距離的聚類圖。利用Structure 2.3.4[26]軟件進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，設(shè)置值為1～10，對(duì)不同的值進(jìn)行10次重復(fù)運(yùn)算。使用馬爾可夫鏈法（Markov’s Chain Monte Carlo, MCMC），設(shè)burn-in為100 000次，run-length為100 000次迭代，之后用在線軟件Structure harvester（http://taylor0.biology.ucla.edu/structure harvester/）根據(jù)?峰值位置來確定最佳分組群，并繪制群體結(jié)構(gòu)分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性

利用10對(duì)SSR引物對(duì)190份帶葉兜蘭材料進(jìn)行SSR多態(tài)性分析（表3）。由表3可知，共檢測(cè)到50個(gè)N，N在2～9之間，平均每個(gè)SSR標(biāo)記5個(gè)等位基因。N為1.0269～ 6.7468，平均值為2.4835。在0.0843～2.0272之間，平均值為0.8592。H在0.0265～0.8677之間，平均值為0.4518。H在0.0263～0.8540之間，平均值為0.4387。在0.0262～0.8518之間，平均值為0.4370。PIC在0.0260～0.8346之間，平均值為0.3996。參照BOTSTEIN等[27]提出的衡量基因變異程度高低的PIC指標(biāo)，有4個(gè)位點(diǎn)（DY383、DY687、DY716、DY800）是高度多態(tài)性位點(diǎn)（PIC>0.50），4個(gè)位點(diǎn)（DY356、DY376、DY413、DY669）是中度多態(tài)性位點(diǎn)（0.25

表3 10對(duì)SSR引物的多態(tài)性分析

2.2 居群遺傳多樣性

帶葉兜蘭各野生居群遺傳多樣性檢測(cè)結(jié)果見表4。6個(gè)居群的多態(tài)性位點(diǎn)比率（PPB）在70%～100%之間，平均值為88.33%。N在2.8000～ 4.3000之間，平均值為3.3833。N為1.9655～2.4060，平均值為2.1901。在0.6584～0.8369之間，平均值為0.7425。H在0.3891～0.4839之間，平均值為0.4465。H在0.3795～0.4683之間，平均值為0.4205。在0.3648～0.4382之間，平均值為0.4008。表明6個(gè)帶葉兜蘭居群的遺傳多樣性豐富，其中廣西木論（GML）遺傳多樣性最低，廣西雅長(zhǎng)（GYC）和貴州萬峰湖（QWF）遺傳多樣性較高。

表4 基于10對(duì)SSR引物的帶葉兜蘭6個(gè)居群的遺傳多樣性

2.3 居群遺傳分化

帶葉兜蘭居群的分子方差分析（AMOVA）結(jié)果表明，帶葉兜蘭居群間的遺傳變異僅有6%，而居群內(nèi)的遺傳變異有94%，絕大部分遺傳變異發(fā)生在各居群的內(nèi)部（表5）。說明野生帶葉兜蘭資源的遺傳多樣性以居群內(nèi)的變異為主，居群內(nèi)分化程度較高，而居群間遺傳分化較小。

2.4 聚類和主坐標(biāo)分析

遺傳距離和遺傳相似性是衡量居群親緣關(guān)系的重要指標(biāo)，6個(gè)居群間的Nei’s遺傳距離（G）和遺傳相似性（G）見表6。6個(gè)居群間G在0.0169～0.1330之間，G在0.8755～0.9832之間。其中GML和YDZ居群間的G最大（0.1330），GYC和QWF居群間的G最?。?.0169）。GYC和QWF居群間的G最大（0.9832），GML和YDZ居群間的G最小（0.8755）。

根據(jù)居群間的Nei’s遺傳距離采用UPGMA法進(jìn)行聚類分析（圖2），結(jié)果顯示，廣西雅長(zhǎng)（GYC）和貴州萬峰湖（QWF）首先聚為一支，再依次和貴州桔山（QJS）、云南法斗（YFD）、云南柳井（YDZ）聚集，最后和廣西木論（GML）聚集。結(jié)果表明居群間遺傳距離與地理距離無顯著相關(guān)性。

表6 帶葉兜蘭居群間的遺傳距離（Gd）和遺傳相似性（Gi）

注：對(duì)角線下方為Nei’s遺傳距離（G），對(duì)角線上方為Nei’s遺傳相似性（G）。

Note: Below diagonal is Nei’s genetic distance (G), and above diagonal is Nei’s genetic identity (G).

圖2 基于Nei’s遺傳距離的帶葉兜蘭居群的聚類圖

為進(jìn)一步研究群體間的遺傳關(guān)系，對(duì)190份帶葉兜蘭進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）。其中第一主成分和第二主成分分別可以解釋總變量的31.63%和10.07%（圖3）。主坐標(biāo)結(jié)果表明帶葉兜蘭居群間均質(zhì)化明顯，居群內(nèi)存在著種質(zhì)混雜現(xiàn)象。

2.5 居群遺傳結(jié)構(gòu)

利用Structure的貝葉斯聚類方法對(duì)6個(gè)帶葉兜蘭居群進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)EVANNO等[28]的方法用最大似然值?來確定值。Structure分析結(jié)果顯示在1～10之間，為2時(shí)，?取得最大值（圖4），表明6個(gè)居群190個(gè)個(gè)體的基因型分為2種。2種基因型在每個(gè)居群中分布比例相似，不能按照不同基因池區(qū)分（圖5），表明帶葉兜蘭居群間均質(zhì)化，可能由于較高基因流導(dǎo)致。

圖3 基于Nei’s遺傳距離的主坐標(biāo)分析圖

圖4 ?K分布圖

圖5 帶葉兜蘭居群Structure聚類結(jié)果（K=2）

3 討論

3.1 帶葉兜蘭居群的遺傳多樣性

遺傳多樣性是體現(xiàn)一個(gè)物種進(jìn)化潛力和抵抗外界環(huán)境變化的能力，遺傳多樣性水平越高，物種適應(yīng)環(huán)境變化的能力越強(qiáng)，反之越弱[29]。本研究所選的6個(gè)居群是本實(shí)驗(yàn)室從2013年開始，通過查閱文獻(xiàn)、網(wǎng)上搜索和多年實(shí)地踏查所收集到的所有居群，其中貴州萬峰湖（QWF）、貴州桔山（QJS）、云南法斗（YFD）和云南柳井（YDZ）這4個(gè)居群均是首次對(duì)其進(jìn)行研究報(bào)道。

本研究對(duì)6個(gè)帶葉兜蘭居群的SSR檢測(cè)結(jié)果表明，在物種水平（=0.8592,=0.4370）和居群水平（PPB=83.33%,=0.7425,=0.4008）上均具有豐富的遺傳多樣性。與以往的兜蘭屬植物遺傳多樣性研究相比，高于朱亞艷等[10]利用SRAP標(biāo)記分析的8種兜蘭的遺傳多樣性（PPB=80.26%,=0.4241,=0.2879），略高于李宗艷等[17]利用ISSR標(biāo)記分析的7個(gè)硬葉兜蘭居群的遺傳多樣性（PPB= 96.04%,=0.4889,=0.3244），略高于HUANG等[16]利用ISSR和SRAP標(biāo)記分析的15個(gè)硬葉兜蘭居群的遺傳多樣性（ISSR: PPB=80.28%,=0.4236; SRAP: PPB=70.67%,=0.3301），也高于秦惠珍等[18]利用ISSR標(biāo)記分析的8個(gè)白花兜蘭居群的遺傳多樣性（PPB=78.33%,=0.4191,= 0.2808）。高麗霞等[14]利用SRAP標(biāo)記分析的廣西木論自然保護(hù)區(qū)的40份野生帶葉兜蘭的遺傳多樣性（PPB=24.22%,=0.1582,=0.1282）低于本研究中同位于廣西木論縣木論自然保護(hù)區(qū)的廣西木論（GML）的遺傳多樣性（PPB=70%,=0.6584,=0.3648），推測(cè)可能與本研究采用的SSR標(biāo)記具有更高的多態(tài)性和保護(hù)區(qū)的保護(hù)有關(guān)。CHEN等[12]利用SSR標(biāo)記分析的廣西雅長(zhǎng)自然保護(hù)區(qū)的32份野生帶葉兜蘭的遺傳多樣性（N=2.9300,N=2.2200,H= 0.5313）略高于本研究中同位于廣西雅長(zhǎng)自然保護(hù)區(qū)的廣西雅長(zhǎng)（GYC）的遺傳多樣性（N= 3.9000,N=2.2820,H=0.4452）。本研究對(duì)6個(gè)帶葉兜蘭居群的研究也顯示了廣西木論（GML）的遺傳多樣性最低，廣西雅長(zhǎng)（GYC）的遺傳多樣性較高，推測(cè)可能和位于雅長(zhǎng)自然保護(hù)區(qū)的帶葉兜蘭居群較大，而位于木論自然保護(hù)區(qū)的居群較小有關(guān)。本研究與上述近緣或相同物種的多項(xiàng)指標(biāo)比較表明，帶葉兜蘭整體遺傳多樣性豐富，高于硬葉兜蘭和白花兜蘭。

3.2 帶葉兜蘭居群的遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳分化是反映遺傳結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)。本研究通過AMOVA分析顯示，94%的遺傳分化發(fā)生在居群內(nèi)，居群間遺傳分化很?。?%），即帶葉兜蘭主要遺傳變化來自居群內(nèi)的個(gè)體間變異。李宗艷等[17]利用ISSR標(biāo)記對(duì)7個(gè)硬葉兜蘭居群進(jìn)行AMOVA分析顯示，硬葉兜蘭居群內(nèi)（60.4%）的遺傳變異大于居群間（39.60%）。HUANG等[16]利用ISSR和SRAP標(biāo)記對(duì)15個(gè)硬葉兜蘭居群進(jìn)行AMOVA分析，ISSR標(biāo)記結(jié)果顯示硬葉兜蘭居群內(nèi)（69%）遺傳變異大于居群間（31%），SRAP標(biāo)記結(jié)果也顯示硬葉兜蘭居群內(nèi)（75%）遺傳變異大于居群間（25%）。秦惠珍等[18]利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)8個(gè)白花兜蘭居群進(jìn)行AMOVA分析顯示白花兜蘭居群內(nèi)（87.53%）遺傳變異大于居群間（12.47%）。多項(xiàng)指標(biāo)表明多數(shù)兜蘭屬植物的遺傳變異均以居群內(nèi)的遺傳變異為主。這一結(jié)果可能與兜蘭具有欺騙性授粉的特征有關(guān)，欺騙性授粉的物種比向傳粉者提供回報(bào)的物種具有更高的基因流動(dòng)，且兜蘭種子細(xì)小也有利于遠(yuǎn)距離傳播[11]。此外，評(píng)價(jià)居群的遺傳結(jié)構(gòu)需要結(jié)合物種的繁育系統(tǒng)和傳粉方式等因素進(jìn)行綜合分析，目前尚無帶葉兜蘭繁育和傳粉的相關(guān)報(bào)道，后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這方面的研究來進(jìn)一步闡明其遺傳結(jié)構(gòu)的形成原因。

遺傳結(jié)構(gòu)是評(píng)價(jià)遺傳資源的關(guān)鍵。本研究通過UPGMA聚類、PCoA分析和Structure群體結(jié)構(gòu)分析對(duì)帶葉兜蘭資源進(jìn)行劃分，3種分析方法得到的結(jié)果相似，均顯示6個(gè)野生帶葉兜蘭居群無明顯的類群劃分，居群間存在基因漸滲的現(xiàn)象且均質(zhì)化明顯。這可能會(huì)降低物種的長(zhǎng)期適應(yīng)性進(jìn)化能力，增加在不斷變遷的環(huán)境中因隨機(jī)事件而滅絕的風(fēng)險(xiǎn)。推測(cè)很可能因?yàn)楝F(xiàn)存的各個(gè)居群起源于相同的祖先居群，由于在歷史中發(fā)生生境片段化，造成這一連續(xù)分布的祖先居群殘留成目前多個(gè)分散的居群。

3.3 表型多樣性和遺傳多樣性關(guān)聯(lián)分析

本研究與本實(shí)驗(yàn)室王文曉等[21]的帶葉兜蘭表型多樣性分析結(jié)果相比，其中有5個(gè)居群采樣地點(diǎn)均與王文曉等文中相對(duì)應(yīng)（王文曉等文中的YDZ居群采樣地由云南省馬關(guān)縣斗嘴鄉(xiāng)更正為云南省文山縣柳井彝族鄉(xiāng)斗咀村，居群字母簡(jiǎn)稱YDZ不變）。王文曉等根據(jù)18個(gè)表型性狀變異系數(shù)分析顯示，5個(gè)野生居群內(nèi)變異系數(shù)由高到底為云南法斗（YFD）＞貴州萬峰湖（QWF）＞廣西雅長(zhǎng)（GYC）＞云南柳井（YDZ）＞廣西木論（GML），本研究根據(jù)遺傳多樣性分析結(jié)果顯示，6個(gè)野生居群遺傳多樣性由高到低為廣西雅長(zhǎng)（GYC）＞貴州萬峰湖（QWF）＞云南法斗（YFD）＞貴州桔山（QJS）＞云南柳井（YDZ）＞廣西木論（GML），二者結(jié)果部分相似；但王文曉等根據(jù)巢氏方差分析表型分化系數(shù)顯示，居群間的表型分化大于居群內(nèi)，而本研究根據(jù)AMOVA分析遺傳分化系數(shù)顯示，居群內(nèi)的遺傳分化遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于居群間；聚類結(jié)果也不同，王文曉等按照表型性狀Q型聚類將居群劃分為3類，云南法斗（YFD）和云南柳井（YDZ）為一類群，廣西雅長(zhǎng)（GYC）和廣西木論（GML）為一類群，貴州萬峰湖（QWF）為一類群，其結(jié)果大致同地理位置及生境相符。這種利用表型性狀檢測(cè)植物遺傳變異和多樣性的方法簡(jiǎn)便易行，能夠短期內(nèi)基本了解植物的遺傳變異水平[30]。但植物形態(tài)學(xué)特征受環(huán)境影響較大，在不同生境下營(yíng)養(yǎng)和生殖性狀均會(huì)出現(xiàn)差異，因此存在一定的局限性[31]。而利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)是從DNA水平上反映個(gè)體間的遺傳變異現(xiàn)象，不受生長(zhǎng)發(fā)育和時(shí)間的制約，避免環(huán)境干擾，成本低，檢測(cè)效率高，能更準(zhǔn)確地反映類群間的親緣關(guān)系[32]?；赟SR技術(shù)，本研究聚類結(jié)果表明，不同居群的帶葉兜蘭的遺傳結(jié)構(gòu)未嚴(yán)格按照地理距離劃分，這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室硬葉兜蘭13個(gè)居群遺傳多樣性分析結(jié)果類似，廣西木論（GML）居群和其他居群遺傳距離最遠(yuǎn)（數(shù)據(jù)尚未發(fā)表）。其原因可能是：（1）由于貴州萬峰湖（QWF）居群位于5個(gè)居群的中間位置，與其他居群有相對(duì)較大的基因流交流，基因重組的空間和機(jī)會(huì)更大，更容易擴(kuò)大種群的遺傳多樣性水平；（2）貴州萬峰湖（QWF）和廣西雅長(zhǎng)（GYC）居群分別位于紅水河水系的上下游，通過紅水河水系增加了這2個(gè)居群間的基因交流，因此這2個(gè)居群間關(guān)系最近。

3.4 帶葉兜蘭資源保護(hù)

遺傳多樣性是種質(zhì)資源保護(hù)與評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[33]。通過對(duì)中國(guó)西南地區(qū)的6個(gè)帶葉兜蘭居群的遺傳多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果表明帶葉兜蘭具有相對(duì)豐富的遺傳多樣性，但居群間存在均質(zhì)化現(xiàn)象。在6個(gè)居群中，貴州萬峰湖（QWF）居群和位于廣西雅長(zhǎng)自然保護(hù)區(qū)的廣西雅長(zhǎng)（GYC）居群遺傳多樣性較高，應(yīng)作為核心種群重點(diǎn)保護(hù)，可見選擇在廣西雅長(zhǎng)作為全國(guó)唯一一個(gè)國(guó)家級(jí)蘭科植物自然保護(hù)區(qū)，在帶葉兜蘭的保護(hù)上其意義重大。由于帶葉兜蘭居群內(nèi)個(gè)體間的遺傳變異較高，因此也要加強(qiáng)對(duì)居群內(nèi)部每個(gè)個(gè)體的保護(hù)，以保持最大遺傳變異基因庫(kù)為目標(biāo)。

此外，通過全基因組重測(cè)序和簡(jiǎn)化基因組測(cè)序等高通量測(cè)序技術(shù)開發(fā)分子標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于大田作物和蔬菜中，這也給蘭科植物起源和進(jìn)化帶來新的研究方向[34]。如簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)有不參考基因組就可以進(jìn)行大量SNPs開發(fā)的優(yōu)勢(shì)，目前在蘭科植物中石斛屬[35]、蝴蝶蘭屬[36]上已有應(yīng)用，但尚無新型分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于兜蘭屬植物的報(bào)道。為了更好地保護(hù)兜蘭屬植物，今后可以利用新型高通量測(cè)序技術(shù)開發(fā)新的標(biāo)記技術(shù)，加強(qiáng)與鄰國(guó)的交流，增加越南、老撾、印度、泰國(guó)等國(guó)家野生居群采樣，以全面了解帶葉兜蘭資源的遺傳狀況。

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Genetic Diversity of WildPopulations in Southwest China with SSR Markers

XU Yan1,2, CHEN Zhiguang2, XU Yufeng2, GE Hong2, YANG Shuhua2, ZHAO Xin2, KOU Yaping2, YU Xiaonan1*, JIA Ruidong2*

1. College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University / Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation & Molecular Breeding / National Engineering Research Center for Floriculture / Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment, Beijing 100083, China; 2. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Flower Crops (North China), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081, China

(Lindl. ex Hook. f.) Stein is a rare and endangered plant in China with high ornamental value.In order to explore the genetic characteristics of wildresources in Southwest China, and contribute to the protection and utilization of the wild resources, this study used SSR molecular marker to analyze the genetic diversity and population genetic structure of 190resources which collected from six populations in Guangxi, Yunnan and Guizhou provinces in Southwest China. In this study, the results showed thatten pairs of primers with good amplification effect were selected from 115 pairs of primers, and 50 alleles were detected by 10 pairs of SSR primers of 190.The average number of alleles (N) was five and the average number of effective alleles (N) was 2.4835. The average Shannon information index () was 0.8592. The average observed heterozygosity (H) was 0.4518 and the average expected heterozygosity (H) was 0.4387. The average polymorphic information content (PIC) was 0.3996 and the average Nei’s expected heterozygosty () was 0.4370.In this six wildpopulations,the number of alleles (N) was from 2.8000 to 4.3000. The number of effective alleles (N) was from 1.9655 to 2.4060. The observed heterozygosity (H) was from 0.3891 to 0.4839. The expected heterozygosity (H) was from 0.3795 to 0.4683. The Shannon information index () was from 0.6584 to 0.8369, and the Nei’s expected heterozygosty () was from 0.3648 to 0.4382.In the six wild populations, the genetic diversity of Guangxi Yachang (GYC) and Guizhou Wanfeng Lake (QWF) populations was generally higher (=0.4382,=0.4276), while the genetic diversity of Guangxi Mulun (GML) population was relatively low (=0.3648).Analysis of molecular variance (AMOVA) results showed that genetic variation mainly occurred among individuals within the population (94%),while genetic differentiation within populations was very small (6%).UPGMA cluster analysis based on genetic distance showed that the genetic distance of the sixpopulations was very small, there was no obvious group division and the genetic distance was not completely related to the geographical location.The results of Structure and principal coordinate analysis were consistent with those of UPGMA cluster analysis. Structure and principal coordinate analysis results showed that there was homogenization among the populations, and there was no obvious group division. In summary, the genetic diversity ofresources is relatively rich, which can provide a theoretical basis for the protection and utilization of wildresources in Southwest China.

; wild populations; SSR; genetic diversity; genetic structure

S682.31

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.009

2022-12-20；

2023-01-31

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2021YFD1200200）。

徐 言（1998—），女，碩士研究生，研究方向：蘭花種質(zhì)資源與遺傳育種。*通信作者（Corresponding author）：于曉南（YU Xiaonan），E-mail：yuxiaonan626@126.com；賈瑞冬（JIA Ruidong），E-mail：jiaruidong@caas.cn。