章楊婷，張燕萍，黃靜妍，王文君，童 妍，趙 凱，周育真*

一心維納斯蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成相關基因RT-qPCR內(nèi)參基因篩選

章楊婷1，張燕萍1，黃靜妍1，王文君1，童 妍1，趙 凱2，周育真1*

1. 福建農(nóng)林大學風景園林與藝術學院/蘭科植物保護與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，福建福州 350002；2. 福建師范大學生命科學學院，福建福州 350117

一心維納斯蝴蝶蘭（I-Hsin Venus）花型優(yōu)雅、花期持久、花香馥郁，是優(yōu)良的香花品種，具有較高的園林觀賞價值和經(jīng)濟價值。為篩選適用于一心維納斯蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成相關基因表達分析的內(nèi)參基因，本研究以一心維納斯蝴蝶蘭不同花期（中蕾期、初開期、盛開前期、盛開中期、盛開后期、衰敗期）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎，選取了、、、、、、和共8個管家基因作為候選內(nèi)參基因，利用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術檢測候選內(nèi)參基因在花朵不同發(fā)育時期的表達情況，并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper三個內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析軟件對候選內(nèi)參基因進行分析。綜合分析結(jié)果表明，的穩(wěn)定性最高，可作為一心維納斯蝴蝶蘭相關基因表達分析的最適內(nèi)參基因。

一心維納斯蝴蝶蘭；內(nèi)參基因；實時熒光定量PCR；表達穩(wěn)定性

實時熒光定量PCR技術（quantitative real-time PCR, RT-qPCR）是指在PCR反應體系中添加熒光基團（探針或者染料），在PCR擴增進程中借助熒光信號的積累進行實時監(jiān)測[1]。RT-qPCR目前已普遍應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域[2]。因RT-qPCR的特異性強、無污染性和準確性高，其被廣泛應用于基因表達驗證方面的研究[3]。但是，RNA的質(zhì)量或試驗操作的偏差等因素會影響最終結(jié)果的精準度[4]。使用內(nèi)參基因?qū)Y(jié)果進行校對并糾正，可以大大降低目標基因與數(shù)據(jù)表達水平之間的差異，從而提高試驗的準確性。

內(nèi)參基因通常選用管家基因，這類基因以穩(wěn)定表達著稱，但目前并沒有哪個內(nèi)參基因能確保在所有情況下都能穩(wěn)定表達[5]。理想的內(nèi)參基因在不同條件不同組織中均會穩(wěn)定表達，而試驗研究中內(nèi)參基因的恒定表達僅僅是在一定的試驗環(huán)境下和一定的組織中才會實現(xiàn)[6]。在特定試驗條件下或給特定組織或品種進行RT-qPCR表達穩(wěn)定分析前，應該選擇合適的內(nèi)參基因。目前常用的內(nèi)參基因主要包括肌動蛋白基因（）、18S核糖體RNA（）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（）、多聚泛素酶基因（）、α微管和β微管蛋白基因（、）以及親環(huán)蛋白基因（）等。

蝴蝶蘭（spp.）因花朵形態(tài)像蝴蝶而得名，又稱蝶蘭，其花色艷麗，花姿嬌俏，花期長，廣泛分布于中國、泰國、菲律賓、馬來西亞等地，屬熱帶亞熱帶氣生蘭，被稱為“蘭花皇后”。蝴蝶蘭的原生種數(shù)量少，市場上廣泛栽培與應用的品種部分是雜交種，在花卉市場上頗受歡迎[7]。隨著市場的不斷變化和消費者需求的多樣化，品種的不斷創(chuàng)新及改良是必要手段，蝴蝶蘭香花品種的培育是目前重要的育種目標之一。一心維納斯蝴蝶蘭（I-Hsin Venus）是以金龍蝴蝶蘭（Dragon’s Gold）和I-Hsin Viola Tria為親本雜交選育而成的香花品種，具有花香濃郁、花色絢麗多彩、花型輕盈、花期持久等特性，是研究蝴蝶蘭花香的理想材料。前期研究表明，一心維納斯蝴蝶蘭隨著花朵開放，花香物質(zhì)逐漸增加而產(chǎn)生花香，其香氣成分主要為萜類物質(zhì)，且成分復雜。目前還需對其花香合成與釋放相關的分子機制進行更深入地挖掘。

本研究基于蝴蝶蘭一心維納斯品種的花朵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出、、、、、、和這8個候選內(nèi)參基因，分別對其進行引物設計，并通過RT-qPCR得到在蝴蝶蘭6個不同花期中的表達量。利用軟件評估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，篩選出理想的內(nèi)參基因。為后期開展一心維納斯蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成和釋放相關功能基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以福建農(nóng)林大學森林蘭苑溫室大棚中的蝴蝶蘭一心維納斯品種的花朵為材料，于2021年3—6月花朵集中開放時期的10：00—14：00采集，采集包括中蕾期（ZL）、初開期（CK，0 d）、盛開前期（S7，7 d）、盛開中期（S15，15 d）、盛開后期（S30，30 d）、衰敗期（SB，45 d及以上）6個時期，設置3個生物學重復。采集后的樣品迅速放入液氮中，迅速轉(zhuǎn)移至?80 ℃冰箱里備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 使用RNA提取試劑盒（Plant RNA Kit, OMEGA）提取一心維納斯蝴蝶蘭不同花期的總RNA。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的完整性，超微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，TaKaRa）將檢測合格的樣品RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將得到的cDNA樣品放于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 候選內(nèi)參基因篩選 根據(jù)已測序完成的一心維納斯蝴蝶蘭不同花期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未發(fā)表），F(xiàn)PKM值為92.61以上并且各基因樣品表達量較為一致的情況下[8]，通過網(wǎng)站（http://orchi-db-a-se.itps.ncku.edu.tw/）[9]查找小蘭嶼蝴蝶蘭（）基因組數(shù)據(jù)進入NCBI的Blast P程序進行同源基因比對，初步篩選出8個內(nèi)參基因（表1）。

1.2.3 RT-qPCR 通過Primer 3（https://primer3.ut. ee/）在線網(wǎng)站和DNAMAN 9.0軟件，基于已知的內(nèi)參基因的核苷酸序列來設計引物（表2），引物由福州白鯨生物科技有限公司合成。使用TB Green Premix ExⅡ試劑盒（TaKaRa公司）進行RT-qPCR，反應體系為：10 μL TB Green Premix ExⅡ、正反引物各0.8 μL、0.4 μL ROX Reference DyeⅡ、6 μL滅菌水、2 μL cDNA溶液，反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40個循環(huán)。溶解曲線溫度設置為60～95 ℃，升溫速度為0.2 ℃/s。每個基因每個時期3次技術重復，得出的數(shù)據(jù)計算△Ct值后使用2?△△Ct公式運算。

表1 根據(jù)FPKM值及Blast P比對篩選到的8個候選內(nèi)參基因

表2 候選內(nèi)參基因的引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

將一心維納斯蝴蝶蘭6個花期的cDNA等量混合，設置5個濃度梯度（5?1、5?2、5?3、5?4、5?5），每個濃度梯度設置3個重復，對樣品進行RT-qPCR。以獲得的5個梯度下各個內(nèi)參基因的Ct值為縱坐標，稀釋倍數(shù)的對數(shù)值為橫坐標制作標準曲線，并利用公式計算各候選內(nèi)參基因的擴增效率（）[10]，=(10?1/k?1)′100%。

參考當前已有的試驗中對內(nèi)參基因穩(wěn)定性的分析方法[11]，通過geNorm、NormFinder和BestKeeper三個分析軟件對各候選內(nèi)參基因在一心維納斯蝴蝶蘭6個不同花期中的穩(wěn)定性進行分析，綜合3個軟件得出的穩(wěn)定性排名，篩選出最適的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因RT-qPCR分析

RT-qPCR分析得出的結(jié)果如圖1所示，溶解曲線均僅出現(xiàn)單一峰，表明8個內(nèi)參基因均未出現(xiàn)引物二聚體。引物二聚體會產(chǎn)生熒光信號，干擾到目的基因的定量[12]，無引物二聚體，說明引物的特異性較好，滿足RT-qPCR下一步試驗的條件。

以一心維納斯蝴蝶蘭不同發(fā)育階段的cDNA為模板進行RT-qPCR擴增，根據(jù)標準曲線得到的斜率（）、相關系數(shù)（2），計算引物擴增效率（）。結(jié)果表明（表3），和擴增效率分別為121.95%和112.23%，高于110%。其余的6個候選內(nèi)參基因的擴增效率均在90%～110%之間，且8個候選內(nèi)參基因相關系數(shù)（2）在0.9826～ 0.9998之間，表明特異性及擴增效率良好，滿足RT-qPCR操作。

圖1 候選內(nèi)參基因溶解曲線

表3 8種引物的相關系數(shù)與擴增效率

Tab.3 Amplification efficiency and correlation of eight candidate genes

候選內(nèi)參基因的Ct值越大，基因的表達量越小；反之，候選內(nèi)參基因的Ct值越小，基因的表達量越大，且同一個候選內(nèi)參基因Ct值的波動越大，說明該基因的表達穩(wěn)定性越小。對8個內(nèi)參基因在各樣本中的表達水平（Ct值）進行分析（表4），在一心維納斯蝴蝶蘭6個花期中，各候選內(nèi)參基因在不同樣本中的Ct平均值為20.789～ 27.735。其中的平均Ct值最低，其表達量最高；的平均Ct值最高，其表達水平最低；、、、、、、、的平均表達水平依次升高。的Ct值變化幅度最大，Ct差值為3.594；波動范圍最小，Ct差值為1.981。

表4 8個候選基因在6個樣本中的Ct值

2.2 候選基因表達穩(wěn)定性分析

2.2.1 geNorm軟件分析 通過geNorm軟件計算候選內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定值（表5），值與穩(wěn)定性呈負相關，<1.5時被認為是理想內(nèi)參。在本研究中，8個候選內(nèi)參基因在不同時期花序中的值均小于0.7，表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。在不同時期花序中，和2的值最低（0.207），穩(wěn)定性最好，其次是（0.257），而相對來說，表達最不穩(wěn)定（值最高，為0.663）。但由于<1.5時就能被認為是理想內(nèi)參，則8個內(nèi)參基因均有較為良好的穩(wěn)定性，表達穩(wěn)定性由大到小排序為=>>>>>>。

表5 geNorm分析候選基因的表達穩(wěn)定性

2.2.2 NormFinder軟件分析 使用NormFinder軟件計算出的表達穩(wěn)定值越小，說明該基因越穩(wěn)定，反之，值越大，該基因穩(wěn)定性就越差。如表6所示，在不同時期花序中，8個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性依次為>>>>>>>，其中，表達穩(wěn)定性最高，表達穩(wěn)定性最低。

表6 NormFinder軟件分析候選基因的表達穩(wěn)定性

2.2.3 BestKeeper軟件分析 使用BestKeeper軟件計算Ct值的標準偏差（stardand deviaton, SD）及變異系數(shù)（coefficient of variation, CV）并比較各值的大小，分析判斷該內(nèi)參基因的表達穩(wěn)定性。SD和CV越小，穩(wěn)定性越好。由表7可知，除了之外的內(nèi)參基因的SD值均小于1，表達穩(wěn)定性依次為>>>>>>，其中穩(wěn)定性最好，穩(wěn)定性較差。的SD值大于1，說明穩(wěn)定性較差，相對來說，不適合作為內(nèi)參基因。

表7 BestKeeper軟件分析候選基因的表達穩(wěn)定性

2.2.4 綜合評價 上述3個分析結(jié)果表明，3個軟件的結(jié)果存在相似之處，但同時也存在差異。geNorm軟件分析結(jié)果表明，和穩(wěn)定性最高；NormFinder軟件分析結(jié)果表明，穩(wěn)定性最高；BestKeeper軟件分析結(jié)果表明，穩(wěn)定性最高。因此，對3個軟件分析的結(jié)果進行幾何平均值計算并排名（表8），排名越高，幾何平均值越小，該基因表達越穩(wěn)定。在一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同發(fā)育時期中，的表達最穩(wěn)定，是一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同發(fā)育時期中最理想的內(nèi)參基因，其次是；表達最不穩(wěn)定的是，不合適用作內(nèi)參基因。

表8 Excel綜合分析候選基因的表達穩(wěn)定性排名

Tab.8 Expression stability of candidate genes was ranked by Excel comprehensive analysis

3 討論

RT-qPCR技術是被廣泛應用的基因表達分析的主要技術手段，但其結(jié)果的準確性需依靠試驗所選出的對特定物種表達穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因，未經(jīng)試驗證實而使用其他試驗中發(fā)表的內(nèi)參基因可能會導致結(jié)果出現(xiàn)偏差[13]。因此，在進行目的基因表達水平研究時，首先需要篩選在特定條件下合適的內(nèi)參基因。目前，多種觀賞花卉的內(nèi)參篩選試驗均有報道，如石蒜（）[14]、萱草（）[10]、茉莉花（）[15]等，大辣椒蝴蝶蘭（Hybrid, Big Chili）在低溫脅迫條件下的內(nèi)參基因研究已有報道[16]，但還未見蝴蝶蘭花香釋放過程中相關內(nèi)參基因的篩選研究。

本研究通過3種軟件分析了8個候選內(nèi)參基因在一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同發(fā)育時期中的穩(wěn)定性情況。3種分析軟件得出的結(jié)果有所不同，但表達比較穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因基本相同。geNorm軟件和NormFinder軟件得出的結(jié)果較為相似，BestKeeper軟件得出的結(jié)果相差較大，可能是BestKeeper軟件分析時直接使用Ct值這一原始數(shù)據(jù)，導致與geNorm和NormFinder軟件比較差異性相對大。該分析結(jié)果在其他內(nèi)參基因篩選的報道中也常有出現(xiàn)，如曹映輝等[17]在建蘭（）花香物質(zhì)合成相關基因內(nèi)參基因篩選中，geNorm和NormFinder軟件得出的結(jié)果一致性較高，均表明與表達較為穩(wěn)定，而BestKeeper卻不同；齊香玉等[15]在茉莉（）不同組織（含花朵）中內(nèi)參基因的篩選試驗中表明，在BestKeeper中的穩(wěn)定性最好，但是其在geNorm和NormFinder中的穩(wěn)定性卻較差，反之和在BestKeeper中的穩(wěn)定性不好，但其在geNorm和NormFinder中的穩(wěn)定性較好。因此，需要對3個軟件的最后結(jié)果進行幾何平均數(shù)計算并分析排名，降低誤差，以提高結(jié)果的準確性，最后根據(jù)綜合分析得到最理想的內(nèi)參基因。

基因參與真核生物細胞的許多重要生命活動，如細胞形狀的維持、胞質(zhì)環(huán)流、細胞運動、細胞分裂、細胞分化、細胞內(nèi)的物質(zhì)運輸、極性鍵成以及信號轉(zhuǎn)導等[18]。在理想狀態(tài)下，無論是細胞類型或發(fā)育階段不同，還是處理方法不同，一個理想的內(nèi)參基因都能穩(wěn)定表達。由于基因在個體各個生長階段的大多數(shù)組織中持續(xù)表達，變化小，序列高度保守，基因常作為內(nèi)參基因使用[19]。一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同發(fā)育時期的理想候選內(nèi)參基因是。在其他物種的內(nèi)參基因篩選報道中，也有被選為理想的內(nèi)參基因的情況。李晗等[20]選擇羽衣甘藍（var.）不同發(fā)育時期的柱頭作為材料通過qRT-PCR對7個候選內(nèi)參基因進行篩選，篩選出基因為最合適的內(nèi)參基因。在馬鈴薯（）中也能穩(wěn)定表達[21]。在甘草干旱條件下[22]、板藍根ABA處理條件下及冬油菜低溫脅迫條件下的表達均最為穩(wěn)定[23-24]。

基因在一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同時期中表達的穩(wěn)定性最差，而仇志浪等[25]在甜櫻桃（）花芽不同時期的內(nèi)參基因篩選中得出的最佳內(nèi)參基因是；NICOT等[26]在馬鈴薯植株不同脅迫條件下的內(nèi)參基因篩選中得出的最穩(wěn)定基因也是。說明并不存在理想的內(nèi)參基因適用于所有植物，在不同植物不同條件下，需要根據(jù)實際情況篩選合適的內(nèi)參基因。

在聚寶紅玫瑰蝴蝶蘭（cultivar, Jiuhbao Red Rose）內(nèi)參基因的研究中，基于geNorm和NormFinder分析，在蝴蝶蘭的大多數(shù)測試樣本中表現(xiàn)出高度穩(wěn)定性，表明是蝴蝶蘭qRT-PCR分析的合適參考基因[27]。CHUANG等[28]在研究貝麗娜蝴蝶蘭（）花香物質(zhì)合成相關功能基因時，選用作為內(nèi)參基因。本研究則著重篩選出蝴蝶蘭花朵花香釋放時期所適用的內(nèi)參基因，為今后蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成相關基因功能及分子機制的研究提供更有針對性的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究利用qRT-PCR技術，通過3個分析軟件（geNorm、NormFinder、BestKeeper）來分析評估一心維納斯蝴蝶蘭的8個候選內(nèi)參基因（,,,,,,,）在不同花期中的穩(wěn)定性，經(jīng)過綜合分析表明，內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序為>>>=>>>，得出為最為理想的內(nèi)參基因，次之。在一心維納斯蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成與釋放的研究過程中，對相對基因表達量進行分析時，可用基因作為內(nèi)參基因進行校正。

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Selection of Suitable RT-qPCR Reference Genes for Floral Scent Biosynthesis inI-Hsin Venus

ZHANG Yangting1, ZHANG Yanping1, HUANG Jingyan1, WANG Wenjun1, TONG Yan1, ZHAO Kai2, ZHOU Yuzhen1*

1. College of Landscape Architecture and Art, Fujian Agricultural and Forestry University / Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration for Orchid Protection and Utilization, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou, Fujian 350117, China

I-Hsin Venus is an excellent variety of fragrant flowers, with elegant flower types, long flowering period and rich floral fragrance, which has high garden ornamental value.,,,,,,and, were selected as the candidate internal reference genes based on the transcriptome data of different flower development stages in. I-Hsin Venus to select the appropriate reference genes for RT-qPCR analysis of the correlated genes in the biosynthesis pathway of the floral scent inI-Hsin Venus. The expression of the candidate internal reference genes in inflorescences at different stages was detected by RT-qPCR. The candidate internal parameter genes were analyzed by combining three internal parameter gene stability analysis software: geNorm, NormFinder and BestKeeper. The results of comprehensive analysis showed thatwas the most stable and could be used as the best internal reference gene for the expression analysis of. I-Hsin Venus.

I-Hsin Venus; reference genes; RT-qPCR; expression stability

S682.31

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.006

2022-06-05；

2022-09-15

福建省自然科學基金項目（No. 2023J01283）；福建農(nóng)林大學優(yōu)秀碩士論文基金項目（No. 1122YS01009）。

章楊婷（1998—），女，碩士研究生，研究方向：園林植物與應用。*通信作者（Corresponding author）：周育真（ZHOU Yuzhen），E-mail：zhouyuzhen@163.com。