黎藝璇，房 林，陳 紅，李 琳，吳坤林，曾宋君,3*

兜蘭屬植物菌根真菌研究進展

黎藝璇1,2，房 林1，陳 紅1，李 琳1，吳坤林1，曾宋君1,3*

1. 中國科學院華南植物園華南農(nóng)業(yè)植物分子分析和遺傳改良重點實驗室，廣東廣州 510650；2. 中國科學院大學，北京 100049；3. 中國科學院華南植物園廣東省應用植物學重點實驗室，廣東廣州 510650

蘭科兜蘭屬植物因其奇特的外觀，觀賞價值極高，具有良好的市場前景。但兜蘭生長慢，生長環(huán)境要求高，又遭到人們持續(xù)采集，野生兜蘭數(shù)量稀少，現(xiàn)已成為世界上最瀕危的物種之一。通過人工繁殖出的大量種苗能應用于遷地保護、自然回歸和商品化生產(chǎn)。但兜蘭的人工繁殖難度大，存在種子萌發(fā)率低、生長速度慢、回歸自然的種苗適應性差等問題。菌根是植物長期在自然界生存中與真菌形成的一種共生關系。內(nèi)生真菌在兜蘭的生活史中扮演著重要的角色，對種子萌發(fā)、植株生長和環(huán)境適應性均有極大幫助。研究內(nèi)生真菌有助于兜蘭的人工繁殖、商品化育苗及產(chǎn)業(yè)化推廣，也有利于兜蘭屬植物的自然回歸和保護。本文對兜蘭內(nèi)生真菌特點、分離鑒定方法、內(nèi)生真菌種類和作用等研究進行綜述，提出了內(nèi)生真菌在兜蘭屬中的應用前景和未來研究方向等，以期為兜蘭屬植物內(nèi)生真菌的研究、兜蘭種子共生萌發(fā)和商品化育苗及野生兜蘭的保護提供參考。

兜蘭；內(nèi)生真菌；研究進展

兜蘭屬（）屬于蘭科，全球共有109種，主要分布在亞洲熱帶至太平洋島嶼[1]。我國約有34種，主要分布在西南和華南地區(qū)的云南、貴州、廣西、廣東和海南等地。兜蘭的唇瓣特化成兜狀，頗似拖鞋，故又稱為“拖鞋蘭”或者“仙履蘭”等，其花型奇特，觀賞價值極高，是蘭科植物中的珍品，具有良好的市場前景。隨著花卉市場對兜蘭的需求量不斷增加，近十幾年人們對野生兜蘭持續(xù)采集，加上生境破壞，導致野生兜蘭數(shù)量急劇減少，兜蘭屬植物均被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》（CITES）附錄Ⅰ而被禁止交易[2]，在中國除帶葉兜蘭和硬葉兜蘭為國家二級保護植物外，其他種類均為一級保護植物（2021）。而兜蘭的繁殖難度大，傳統(tǒng)繁殖主要依靠分株來進行，繁殖系數(shù)低；目前兜蘭的組培快繁技術尚未完全成熟，大部分種類與品種均不能利用其進行規(guī)?；a(chǎn)；種子的無菌播種和共生萌發(fā)是目前兜蘭規(guī)模化繁殖的主要手段。蘭科植物種子細小且無胚乳，儲藏的養(yǎng)分很少，自然條件下不能自主萌發(fā)，只有通過與真菌共生獲得養(yǎng)分才能萌發(fā)[3]。真菌還有促進植物生長發(fā)育的作用，在兜蘭植物整個生活史中，共生真菌均扮演著重要的角色。對兜蘭共生菌的了解，可以應用于種子萌發(fā)并促進植株生長發(fā)育，有助于解決兜蘭人工有性繁殖的難題，并改善根際環(huán)境而促進其健康生長，對兜蘭的保護和利用均具有重要的意義。因此，越來越多專家學者開始著手于兜蘭內(nèi)生真菌的研究，但由于兜蘭材料珍稀，總體研究報道還較少[2]。本文從兜蘭內(nèi)生真菌的特點、分離鑒定方法、菌根真菌種類、兜蘭與真菌互作方式及應用前景等方面進行綜述，對兜蘭內(nèi)生真菌未來的研究方向提出建議，以期為兜蘭屬植物的就地和遷地保護、種子共生萌發(fā)和商品化生產(chǎn)提供參考。

1 兜蘭菌根的特點

在自然界，共生菌廣泛存在于動植物中，幾乎所有的蘭科植物均與真菌共生形成菌根。植物的菌根分為外生菌根和內(nèi)生菌根。外生菌根一般是指真菌在蘭科植物體外生存，不侵害植物體組織，菌絲體緊密包裹著幼嫩的根，代替根毛的作用，擴大根系吸收面積。而內(nèi)生菌根的菌絲體侵入細胞內(nèi)部，主要存在于根的皮層區(qū)域。內(nèi)生菌根又可以分為菌絲圈型和叢枝泡囊型。研究發(fā)現(xiàn)，蘭科菌根通常是內(nèi)生菌根菌絲圈型，在植株根內(nèi)形成共生結(jié)構(gòu)即菌絲團，這使蘭科菌根比其他類型的菌根有更高的菌根專一性[4]。蘭科菌根形成的標志就是皮層薄壁細胞中胞內(nèi)菌絲團的出現(xiàn)。菌絲團是共生結(jié)構(gòu)，用于儲存菌根真菌的菌絲卷，在代謝和營養(yǎng)化合物的交換中起著至關重要的作用[5]。菌絲團可以在共生體之間交換營養(yǎng)，通常被植物細胞消化和吸收，提供碳、礦物質(zhì)營養(yǎng)和水。因此，菌絲團是菌根異養(yǎng)器官，對蘭科植物生長中的營養(yǎng)供給起著關鍵作用[6]。

雖然蘭科菌根比其他類型的菌根有更高的菌根專一性，但其專一性也并不絕對[7]，很多因素均會影響其專一性。蘭科與菌根真菌的專一性廣義上指宿主植物可以與多種特定真菌類群共生，宿主植物對共生真菌具有一定偏好性；狹義上指植物具有排他性，只與一種真菌共生[8]。蘭科植物的營養(yǎng)類型、生態(tài)類型和地理環(huán)境分布等因素均會影響其與共生真菌的專一性。蘭科植物營養(yǎng)類型分為光合自養(yǎng)型、完全真菌異養(yǎng)型和部分真菌異養(yǎng)型。光合自養(yǎng)型往往專一性較低。菌根異養(yǎng)型蘭比光合自養(yǎng)型蘭對菌根真菌專一性更高，具有更少種類的共生菌[4, 8]。地理分布上，大陸菌根真菌專一性較低。熱帶地區(qū)由于真菌種類豐富，該地區(qū)蘭科植物菌根真菌專一性也較低。而島嶼的菌根菌專一性較高[9]。兜蘭屬植物生長在大陸偏熱帶的地方，因此推測，兜蘭屬的菌根真菌專一性較低，可以與多種真菌共生。兜蘭在其原球莖階段專一性程度最高，在植物成年階段時，營養(yǎng)需求增加，共生真菌種類也有所增加。這與紅門蘭屬植物相同[10]，與羊耳蒜屬植物情況相反[11]。

蘭科的生態(tài)類型分為地生、附生和腐生三大類。有研究表明大部分地生蘭根被較薄，外皮層無通道細胞，蘭科菌根真菌菌絲通過破壞根被或外皮層進入蘭科植物皮層細胞，如建蘭、墨蘭和虎頭蘭；而附生蘭根被較厚，外皮層具有通道細胞，蘭科菌根真菌菌絲通過通道細胞進入蘭科植物皮層細胞，如卡特蘭、長蓮羊耳、蒜萬代蘭以及石斛等[12-13]。兜蘭屬植物有地生型和附生型，屬于地生蘭的紫紋兜蘭、硬葉兜蘭和麻栗坡兜蘭3種兜蘭的外皮層均不具通道細胞，屬于石上附生型的長瓣兜蘭具有通道細胞。半附生型的帶葉兜蘭也不具有通道細胞[14]。

對于兜蘭菌根真菌的空間分布特征研究發(fā)現(xiàn)，在多種兜蘭的根部，共生菌菌絲團通常在靠近外皮層3～5層的皮層細胞中，而紅旗兜蘭中菌絲團在6～7層細胞中[4]。菌絲在菌根中的分布不是平均分布于整個根的橫截面，而是集中在某一區(qū)域。菌絲團有多種不同形態(tài)，新生菌絲較為疏松，成熟的菌絲團緊密至不能辨別出菌絲，相鄰皮層細胞中的菌絲團通過菌絲相連進行營養(yǎng)與信息交流。當菌絲團衰老消解時，會在皮層細胞觀察到大量淀粉粒，這些淀粉粒為植株提供養(yǎng)分[15-16]。衰老的菌絲會被植物的根細胞慢慢消化和吸收，在衰老菌絲被吸收后又會形成新的菌絲團。在植株整個生長發(fā)育過程中，菌絲不斷被消化吸收又重新形成，這也是蘭科植物和內(nèi)生真菌相互作用的證據(jù)之一。

通過對硬葉兜蘭菌根切片進行觀察分析，發(fā)現(xiàn)菌絲隨著根毛進入根被。橫向上，菌絲團數(shù)量在皮層細胞中最多，逐漸向外皮層和內(nèi)皮層減少，內(nèi)皮層和中柱無菌絲。菌絲團在細胞中多存在于細胞核附近[14]。外皮層細胞中的菌絲團活力最高，向內(nèi)逐漸降低。縱向上，硬葉兜蘭根的上中下部分均有分布真菌，真菌從根中部入侵向兩頭蔓延，根尖和根中部共生菌種類最多，根中部的共生菌數(shù)量最多。菌根真菌的種類和數(shù)量也會隨著根齡變化，在1～3年的根中，真菌數(shù)量和種類在2年生根中最多，1年生根中最少。菌絲團的活力隨著根齡的增加反而降低[17]。

2 兜蘭共生真菌分離鑒定

2.1 共生菌分離技術

進行內(nèi)生菌分離培養(yǎng)時，選擇的消毒試劑和消毒時間應根據(jù)具體的種、生長環(huán)境和材料的幼嫩等情況而定。消毒時間太短不能將表面污染雜菌消滅干凈，消毒時間太長可能對根組織及內(nèi)生真菌產(chǎn)生傷害。田凡等[18]通過單菌絲團分離法對硬葉兜蘭菌根真菌進行分離，發(fā)現(xiàn)菌絲團恒溫培養(yǎng)12 h后萌發(fā)率高且污染少，此時是進行鏡檢的最佳時間；經(jīng)升汞處理2～3 min后根段的污染最小，但還是存在26.7%的污染率。王曉國等[19]通過75%酒精和10%次氯酸鈉設定不同的消毒時間，發(fā)現(xiàn)分離出的真菌數(shù)量和種類也不完全相同，75%酒精消毒4 min，10%次氯酸鈉消毒2 min時分離得到的菌株數(shù)目最多，但只有1個屬；當75%酒精消毒8 min，10%次氯酸鈉消毒8 min后可分離得到3個屬的真菌，比較適合帶葉兜蘭的真菌分離。

菌根真菌的分離方法主要有原生地共生萌發(fā)法、組織切片分離法、菌絲團分離法、傾注混勻法和單菌絲團分離法等[20]。蘭科植物的菌根真菌與其他植物菌根真菌最大不同在于除了與成年植株根共生外，蘭科植物種子萌發(fā)必須依靠相關共生真菌才能完成。對蘭科植物種子萌發(fā)階段的共生真菌分離多采用原地共生萌發(fā)技術，即原生境種子誘捕法（seed baiting technique）。該方法將蘭科植物的種子套袋后埋在其原來生境中進行萌發(fā)試驗，待其萌發(fā)后從原球莖中定向分離菌根真菌[21]，利用此方法分離到的真菌一般只對種子萌發(fā)起作用且專一性強。在此基礎上改造而來的實驗室種子誘捕法是指將原生境的枯枝落葉、土壤等基質(zhì)取回實驗室，在實驗室內(nèi)進行種子播種誘捕[22]，此方法比原生境種子誘捕法更為方便。

對蘭科植物菌根真菌的分離，傳統(tǒng)的組織切片分離法是最早使用的方法，即將洗凈消毒后的根段切成薄片置于培養(yǎng)基上，用菌絲尖端挑取法將根皮層細胞中長出的菌株分離，不斷純化。利用這種方法常因分離到的真菌不能確定是否為菌根真菌，需通過回接實驗或共生萌發(fā)實驗才能驗證。另外，在真菌分離過程中常由于表面消毒不徹底、易污染而混入表面微生物，分離效率也較低[7]。

目前，蘭科菌根的分離大多依靠單菌絲團分離法，該方法是根據(jù)蘭科菌根真菌在原球莖細胞內(nèi)或根部皮層細胞中形成的特殊菌絲團結(jié)構(gòu)而設計出的方法，通過該方法能夠得到真正的菌根真菌。首先將根段進行表面消毒，刮取細胞內(nèi)部菌絲團，配制成菌絲團懸液，將懸液轉(zhuǎn)入離心管孵育4～24 h，然后在顯微鏡下用移液槍吸取50 μL包含萌發(fā)的菌絲團懸液至培養(yǎng)皿。這種方法可以盡量避免根部表面真菌以及根內(nèi)真菌的污染，但需要嚴格的無菌條件和熟練的挑取菌絲的技術和合適的工具，孵育時菌絲團容易結(jié)合到一起而很難分開。針對這些缺點，孫曉穎[14]利用帶葉兜蘭對該方法進行了改良，無需菌絲團孵育和顯微鏡下操作，同時減少了菌絲團懸液滴加量，控制了細菌生長。研究結(jié)果顯示用菌絲團分離法比單菌絲團分離法簡單，無需恒溫培養(yǎng)并減少了污染，效果較好，分離得到較多的純菌株數(shù)和較少的伴有細菌的菌株數(shù)。孫曉穎[14]用1/5 PDA培養(yǎng)基、FIM培養(yǎng)基、POA培養(yǎng)基培養(yǎng)帶葉兜蘭菌根真菌時，發(fā)現(xiàn)在相對貧瘠的1/5 PDA培養(yǎng)基上菌根真菌分離效果最好。

由于單菌絲團分離法操作復雜，目前兜蘭屬植物菌根真菌的分離多使用組織切片法。另外，并非所有菌根真菌均能在體外條件下生長[23]，在無菌條件下鑒定兜蘭菌根真菌菌根生態(tài)具有限制性。因此，兜蘭菌根相互作用的研究還需要通過非培養(yǎng)依賴性方法鑒定菌根真菌[7]。

2.2 共生真菌鑒定技術

共生真菌鑒定的傳統(tǒng)方法是形態(tài)學方法，根據(jù)培養(yǎng)出來的菌落特征和顯微形態(tài)，結(jié)合文獻資料，綜合對比真菌特征，進行初步地分析、分類和鑒定，但此方法大多只能鑒定到屬，而不能鑒定到種，雖已被普遍認同但存在較大局限性。另外，兜蘭菌根真菌多數(shù)是膠膜菌科，人工培養(yǎng)下難以生長出孢子，使鑒定更加困難。目前，共生真菌的鑒定除形態(tài)學方法外，分子生物學技術的應用也成為真菌分類鑒定的主要發(fā)展方向。目前r?DNA-ITS序列分析與傳統(tǒng)形態(tài)學相結(jié)合的方法已成為主流，并成功鑒定出多種兜蘭的菌根真菌。即通過提取菌根真菌的DNA，采用ITS引物，PCR擴增后測序，測序結(jié)果在GenBank中利用BLAST與已知序列比對，從而鑒定出真菌[14, 24-25]。但r?DNA-ITS序列分析方法也存在一定局限性，其結(jié)果只能將大部分的菌株鑒定到屬也不能鑒定出種，其原因是因為GenBank中蘭科菌根真菌的已知序列少，比對時相似序列較多。但隨著數(shù)據(jù)庫的不斷豐富，將來相似的序列會越來越多，結(jié)合其他序列進行比對鑒定是將來的發(fā)展趨勢[26]。另外，其他一些分子生物學技術也應用于蘭科植物共生菌的分類鑒定上，如DNA分析、同工酶圖譜分析、核酸雜交和雜交瘤等技術[27]，未來也可以應用于兜蘭植物菌根鑒定分類研究上。另外，宏基因組學已成為目前國際上微生物研究的前沿和熱點領域[28]，但這項技術在蘭科植物菌根真菌的研究上尚未報道。

3 兜蘭共生真菌的主要類群

已報道與蘭科植物形成菌根的共生真菌有50多個屬，絕大多數(shù)已報道的蘭科菌根真菌屬于半知菌亞門、絲核菌類（Rhizoctonia）和擔子菌類（Basidiomycetes），包括膠膜菌科（Tulasnellaceae）、角擔菌科（Ceratobasidiaceae）、臘殼耳科（Sebacinaceae）、紅菇科（Russulaceae）等[8]，主要的屬有伏革菌屬（）、干菌屬（）、杯菌屬（）、亡革菌屬（）、膠膜菌屬（）、皮傘菌屬（）、角擔菌屬（）、密環(huán)菌屬（）、假密環(huán)菌屬（）、層孔菌屬（、蠟殼菌屬（）和絲核菌屬（）等[1, 29-31]。根據(jù)生態(tài)類型，不同種類其優(yōu)勢共生菌群也不完全相同，地生蘭主要以膠膜菌科和角擔菌科真菌占優(yōu)勢。大多數(shù)的附生綠色蘭科植物的共生真菌屬于角擔菌科、膠膜菌科和蠟殼耳目。腐生蘭共生菌類群具有高度專一性，且與地生蘭和附生蘭共生菌種類不同，其中珊瑚蘭屬植物僅與革菌屬真菌共生[4]。

目前，已從兜蘭屬植物中分離出20多個屬的共生真菌。菌根組合的特異性受環(huán)境條件、相鄰植物物種以及土壤中菌根真菌的豐度和分布的影響[32]，所以同種兜蘭在不同地區(qū)的菌根真菌組成也可能不完全一致。其中YUAN等[33]等利用分子系統(tǒng)學方法，發(fā)現(xiàn)兜蘭屬菌根真菌均屬于膠膜菌科真菌，該研究得出，膠膜菌科菌種為硬葉兜蘭的優(yōu)勢菌種。孫曉穎等[34]為了獲得種子萌發(fā)階段的共生真菌，利用原地共生萌發(fā)技術從帶葉兜蘭中分離出瘤菌根菌（sp.），并且驗證了分離得到的瘤菌根菌能促進帶葉兜蘭的種子萌發(fā)；還從5種野生成年兜蘭根部分離得到16株類絲核菌，均屬于膠膜菌屬[14]。田凡等[35]利用形態(tài)學特征從硬葉兜蘭分離出6株菌根真菌，已鑒定出的5株屬于膠膜菌屬、瘤菌根菌屬和鐮刀菌屬（），1種未鑒定。田凡等[17]利用傳統(tǒng)形態(tài)學結(jié)合rDNA-ITS序列分析從硬葉兜蘭中分離出29株菌根真菌，共鑒定出23株，屬于15個屬，有6株未鑒定出屬，鑒定出的14個屬為膠膜菌屬、瘤菌根菌屬、鐮刀菌屬、絲核菌屬、栓菌屬（）、附毛菌屬（）、擬迷孔菌屬（）、小脆柄菇屬（）、擬層孔菌屬（）、毛殼屬（）、側(cè)耳屬（）、輪枝菌屬（）、彎孢聚殼屬（）和；分離到的優(yōu)勢菌株中，有11株是膠膜菌科（Tulasnellaceae）的瘤菌根菌屬和膠膜菌屬，1株為無孢科（Agonomycetaceae）的絲核菌屬。李明等[36]從杏黃兜蘭根內(nèi)分離到13株真菌，經(jīng)鑒定為鐮刀菌屬、組絲核菌屬（）、青霉屬（）、木霉屬（）和接臺菌綱毛霉屬（），其中鐮刀菌和組絲核菌為優(yōu)勢菌。ATHIPUNYAKOM等[37]從同色兜蘭、邊遠兜蘭、古德兜蘭和紫毛兜蘭中分離得到6株瘤菌根菌，包括瘤菌根菌屬中的和，絲核菌屬中的sp.和角菌根菌屬中的，以及從白花兜蘭中還分離到sp和，其中同色兜蘭、邊遠兜蘭和紫毛兜蘭中均分離到瘤菌根菌屬中的。NONTACHAIYAPOOM等[38]從兜蘭屬中的邊遠兜蘭、紫毛兜蘭、胼胝兜蘭、紅旗兜蘭和蘇氏兜蘭中分離得到14株類絲核菌屬（like）菌株；在3個種中均分離到瘤菌根菌屬的，只在兜蘭中分離到；膠膜菌屬的和另外4個菌種也在兜蘭中分離到。YUAN等[33]證明硬葉兜蘭、杏黃兜蘭和長瓣兜蘭的菌根真菌為膠膜菌科。王曉國等[19]從廣西樂業(yè)縣的野生從帶葉兜蘭中分離到63株真菌，未鑒定出種類的有8株，其余屬于鐮刀菌屬、膠膜菌屬、輪層菌屬（）、碳團菌屬（）、毛殼菌屬，得到的優(yōu)勢菌群為鐮刀菌屬和輪層菌屬，其中分離到的輪層菌是在兜蘭中首次報道，可能是共生菌，也有可能是潛伏的致病菌。

從上述研究中可以看出，在多種兜蘭中經(jīng)常分離到膠膜菌屬、鐮刀菌屬、瘤菌根菌屬和絲核菌屬，常見優(yōu)勢菌種有膠膜菌屬和鐮刀菌屬，部分兜蘭的優(yōu)勢菌種還有瘤菌根菌屬、絲核菌屬、組絲核菌屬、輪層菌屬，這說明膠膜菌屬和其對應的無性態(tài)瘤菌根菌屬、鐮刀菌屬、絲核菌屬很可能都是兜蘭植物的共生菌根真菌，有些已接回兜蘭中試驗證明了其與兜蘭的共生互作關系。其中鐮刀菌在多種兜蘭屬植物中分離到，甚至成為優(yōu)勢菌株，說明鐮刀菌與兜蘭植物的生長有著密切關系。鐮刀菌在大多植物中是致病菌，但有研究表明，從蘭科分離到的鐮刀菌可以促進鐵皮石斛種子的萌發(fā)和生長，RASMUSSEN[39]也認為鐮刀菌是蘭科的菌根真菌。從表1可以看出，同種兜蘭在不同生長時期（種子萌發(fā)階段和成年階段）和不同地區(qū)的菌根真菌不一定相同，杏黃兜蘭在種子萌發(fā)階段只分離到瘤菌根菌屬真菌，一般認為，促進蘭花種子早期萌發(fā)的共生真菌只有一種，具有嚴格的專一性[34]；成年階段時，采自廣西樂業(yè)縣的蘭花可以分離出膠膜菌屬、鐮刀菌屬、輪層菌屬、碳團菌屬、毛殼菌屬[19]，但采自貴州省興義市的蘭花只分離出膠膜菌屬真菌[14]。

真菌的分類鑒定困難，還存在很多問題有待解決。有些子囊菌門和擔子菌門真菌在人工培養(yǎng)下難以形成孢子，選擇合適的誘導孢子形成的培養(yǎng)基是菌種鑒定的一個難點。還有許多無性型絲核菌屬真菌的有性種未被鑒定。

表1 兜蘭菌根真菌種類

4 兜蘭和共生真菌互作

菌根共生關系幾乎伴隨著兜蘭屬植物的整個生活史。蘭科植物的種子是所有開花植物中最小的種子之一，其特征是一個小而未發(fā)育的胚胎，未被胚乳包圍。兜蘭種子在野外生境下萌發(fā)率極低，紫紋兜蘭在自然條件下的萌發(fā)率為1.06×10?4，帶葉兜蘭的自然萌發(fā)率為3.8×10?5[15]，紅旗兜蘭萌發(fā)率為0.139%[15]。在自然條件下，蘭花種子需要被兼容的菌根真菌定殖才能使其種子發(fā)芽[41]。在這個發(fā)育階段屬于完全真菌異養(yǎng)，蘭花直接從定殖菌絲獲得水分和礦物質(zhì)營養(yǎng)來促進胚胎發(fā)育和植物形態(tài)建成[40]，因此，菌根真菌對蘭花至關重要，尤其是在實驗室和田間條件下實現(xiàn)種子萌發(fā)時。一般認為，蘭花種子萌發(fā)時，前期的共生菌是專一的，即在早期的蘭花原球莖中只能分離到一種共生菌，盡管同一種類在不同環(huán)境下所獲得的促進萌發(fā)的共生真菌可能不同。但是隨著原球莖的發(fā)育，共生的真菌會越來越多，有關蘭花種子萌發(fā)共生菌專一性的機制尚不清楚，需進一步研究。孫曉穎等[34]在帶葉兜蘭幼苗中分離篩選出共生菌瘤菌根菌，利用該菌與帶葉兜蘭種子在實驗室內(nèi)進行共生萌發(fā)試驗發(fā)現(xiàn)，接菌的種子胚明顯膨大，平均萌發(fā)率近60%，而對照組無種子萌發(fā)。YANG等[40]利用原生地的土壤作萌發(fā)基質(zhì)，在實驗室利用非原地共生萌發(fā)技術，從白旗兜蘭中分離到能促進種子萌發(fā)的2株膠膜菌科（Tula-snellaceae）共生真菌GYBQ01和GYBQ02，利用這2株真菌和白旗兜蘭進行共生培養(yǎng)時，萌發(fā)率分別為34.9%和50.8%，而對照及采用從竹葉蘭中分離的共生菌則不能促進白旗兜蘭的種子萌發(fā)。一些蘭花物種中能夠促進種子萌發(fā)的菌根真菌可能在進一步的發(fā)育階段中不起作用，這表明蘭科植物生命周期中存在真菌轉(zhuǎn)變[42-43]。在室內(nèi)共生萌發(fā)試驗中，登錄號為FJ7866676的膠膜菌科真菌能促進紅旗兜蘭和同色兜蘭萌發(fā)至第2階段，接下來可能還需要其他真菌參與[15]。

共生菌也促進蘭科植物的生長，菌根中菌絲團用于儲存蘭科菌根真菌的菌絲，在代謝和營養(yǎng)化合物的交換中起著至關重要的作用。菌絲團可以在共生體之間交換營養(yǎng)，通常被植物細胞消化和吸收，提供碳、礦物質(zhì)營養(yǎng)和水。完整和降解的菌絲團都是蘭科植物的營養(yǎng)來源。YODER等[44]認為植物鮮重的增加是因為富含水分的菌絲團被消化，即直接利用水分，或者是菌絲與土壤接觸起水分運輸管道的作用而增加植物對水分的吸收。CAMERON等[45-46]利用同位素證實蘭菌能分解植物體外碳、氮、磷源，并由菌絲運輸至小葉斑蘭（）根部及植株。絲核菌（）能將色氨酸（tryptophan）分解形成大量的IAA及IAA前驅(qū)物tryptophol[47]，有報道指出與絲核菌（）共同培養(yǎng)的原球體內(nèi)具有較高濃度的IAA[48]。吳靜萍等[49-50]從采自福建的密花石斛（）根中的鐮孢菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)含有赤霉素，赤霉素能促進根的生長；還發(fā)現(xiàn)菌絲內(nèi)含有B2、B6，分泌物中含有B2、B6和Bc（葉酸），這些B族維生素有利于蘭花種子的發(fā)芽和苗的正常生長。

兜蘭生長速度緩慢，成苗慢，嚴重限制了兜蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。利用菌根真菌與兜蘭共生，促進兜蘭生長具有重要意義。朱鑫敏等[16]用菌株PM-1對2種兜蘭進行共同培養(yǎng)，接菌苗的生物量以及Ca、Mn元素含量比對照組顯著增加；菌株PA-1也對杏黃兜蘭干物重增長有一定的促進作用；培養(yǎng)基養(yǎng)分水平能顯著影響內(nèi)生真菌與兜蘭的共生關系，在營養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基上真菌能促進杏黃兜蘭生長，而在營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，兜蘭生長緩慢，菌絲生長速度快至纏繞植物，導致真菌對兜蘭有毒害作用，保持真菌和兜蘭適當?shù)臓I養(yǎng)平衡對于二者的共生十分重要。王才義等[51]從7種兜蘭根部分離出8株菌，侵染2種兜蘭幼苗，觀察到8株菌中Pwar-1和Ppri-1對德氏兜蘭白花變種（fma.）的根數(shù)與鮮重均有促進效果；Ppri-1對兜蘭雜交種[In-Charm Rainbow ×(Green Heron × Makuli)]的葉寬、根數(shù)、鮮重與干重有促進效果，且葉色較濃綠，可能是由于共生菌促進葉綠素含量提高導致葉色較深，其余菌株對2種兜蘭的生長無顯著影響。陳寶玲等[52]用從野生兜蘭根中分離出的4種真菌與帶葉兜蘭共生，篩選出和sp.對帶葉兜蘭的促進生長作用和生理效應最佳，鮮重增量、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）3種保護酶活性及葉綠素總量增長顯著。

共生菌還能降低蘭科發(fā)病率，增強對其他病菌和不利生存環(huán)境的抵抗能力，間接提高幼苗的成活率。菌根形成后，菌根真菌會釋放拮抗物質(zhì)，能夠有效阻止其他病原菌侵入蘭根。菌根相互作用是動態(tài)的，所有變化均指向基因組和共生水平的復雜代謝調(diào)節(jié)[53]。目前在蘭科與菌根真菌互作的內(nèi)在機制方面的研究還較少。FAVRE-GODAL等[54]推測它們互作的可能機制是：真菌通過分泌效應物（如小抑制蛋白）來克服植物的防御機制，真菌還分泌多種細胞壁降解酶，有助于其在蘭科植物皮層細胞內(nèi)定殖[55]。蘭科植物通過分泌多種植物激素，幫助真菌定殖。蘭科植物還會分泌植物信號分子，如獨腳金內(nèi)酯和類黃酮等；作為回應菌根真菌會分泌菌根因子（mycorrhizal factors），來激活植物的共同共生基因（common symbiosis genes）。以上推測內(nèi)容為在分子水平研究共生機制提供了思路。

5 兜蘭共生真菌的應用前景

在自然條件下蘭科植物種子只有通過與相應真菌共生，從真菌中獲取營養(yǎng)才可使種子萌發(fā)；而菌根化育苗有利于改善根際環(huán)境，加快蘭科植物生長速度，增加植株的抗病能力，對野生兜蘭種群保護與恢復也具有重要意義。

蘭花菌劑是利用蘭科植物菌根的真菌孢子、菌絲等經(jīng)過人工繁殖，加工配制而成，可以直接用于植株接種。李明等[36]初步探究了兜蘭菌根真菌菌劑的應用，將3種組絲核菌制成菌劑，施入杏黃兜蘭根部，對杏黃兜蘭產(chǎn)生了一定的促生長效果，植株的重量得到了提高；特別是從萌發(fā)的原球莖中分離出共生萌發(fā)真菌制成真菌菌劑直接拌種，能加快兜蘭繁殖速度并降低無菌播種的成本。

另外，在其他蘭科植物種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育的原位調(diào)查中，通過將種子“包”埋在離成體植物相鄰或不同距離的地方，對研究蘭科植物菌根真菌接種量和微生境特異性非常有效[56]。WANG等[57]建立了一種對鐵皮石斛（）和金釵石斛（）進行原位種子誘捕的新方法，利用種子包來評估蘭花種子在土壤中的發(fā)芽情況，可定位、收集，并確定在野生環(huán)境中與蘭花生命周期有關的特定真菌，研究它們在自然野外條件下與蘭花的關系。這些信息將對未來蘭科植物生產(chǎn)和重新引入至關重要，應用此類技術對兜蘭野生種群的保護與恢復具有重要意義。

目前關于兜蘭菌根真菌的研究還處于初級階段，對兜蘭的共生真菌研究主要集中在分離與鑒定，而對共生萌發(fā)體系的建立研究與菌根育苗研究還較少，還有很多問題有待解決，如兜蘭菌根真菌多為人工培養(yǎng)下難以生長出孢子的膠膜菌屬，對于菌根真菌有效的分離方法、分離出的真菌的準確鑒定方法還需進一步優(yōu)化。另外，真菌入侵機制、真菌種子共生萌發(fā)真菌的高度專一性機制、兜蘭共生菌的特異性以及兜蘭的共生萌發(fā)比大部分蘭科植物難度更大的原因等，這些均還需專家學者不斷地深入研究。

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Research Advance in Mycorrhiza of

LI Yixuan1,2, FANG Lin1, CHEN Hong1, LI Lin1, WU Kunlin1, ZENG Songjun1,3*

1. Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Gene Improvement, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, Guangdong 510650, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou, Guangdong 510650, China

In the Orchidaceae family,exhibits extraordinary ornamental value and promising market prospects due to its unique appearance. However,is at risk of extinction worldwide due to slow growth rate, high environmentaldemands, and continuous collection by humans. Artificial seedlings can serve as a potential solution forconservation, reintroduction and commercial production. Unfortunately, artificial propagation is challenged due to low seed germination rate, slow growth rate, and limited resistance to ecological environments. Mycorrhizal symbiosis between plants and fungi has played a crucial role in the natural development of, particularly endophytic fungi, which significantly contribute to seed germination and plant growth. This article presents an analysis of features of endophytic fungi of, methods of endophytic fungi separation, types and functions of research, and the application prospects, while also outlining future research direction for the conservation of wild, seed germination and commercialization. This study aims to provide a comprehensive reference for future research onconservation, seed germination and commercialization.

;endophytic fungi; research advance

S682.31

B

10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.003

2023-04-10；

2023-04-23

廣東省重點領域研發(fā)計劃項目（No. 2022B1111040003，No. 2022B1111230001）；廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系花卉創(chuàng)新團隊項目（No. 2022KJ121）。

黎藝璇（1998—），女，碩士研究生，研究方向：蘭花共生菌。*通信作者（Corresponding author）：曾宋君（ZENG Songjun），E-mail：zengsongjun@scib.ac.cn。