楊小芳,鄧揚(yáng)嘉

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué),貴州 貴陽 550002;2.重慶市中醫(yī)院,重慶 400021)

呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎( ventilator-associated pneumonia,VAP) 是 ICU中最為普遍的一種醫(yī)院感染[1]。根據(jù)資料顯示[2-3],重癥監(jiān)護(hù)室中出現(xiàn) VAP的風(fēng)險(xiǎn)在9%到27%之間,死亡率高達(dá)70%以上。當(dāng)病人出現(xiàn)VAP時(shí),極易導(dǎo)致病人脫機(jī)困難,從而提高其死亡率。研究表明[4-6],發(fā)生VAP時(shí),多種炎性細(xì)胞及炎性因子(如中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及TNF-a、MPO等)均參與了其發(fā)病過程,因此減少炎癥因子的釋放對(duì)縮短VAP患者的縮短住院時(shí)間,改善患者的癥狀具有一定的作用。西醫(yī)主要側(cè)重于使用抗感染藥物進(jìn)行治療,然而,廣泛應(yīng)用廣譜抗生素導(dǎo)致細(xì)菌耐藥問題日益嚴(yán)峻,從而影響了對(duì)VAP的治療效果[7]。近年來,中醫(yī)藥對(duì)VAP治療的研究進(jìn)展迅速,針灸被認(rèn)為是一種安全有效的輔助治療方法[8-9],電針療法能夠減少肺組織和血漿中炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的分泌,從而減輕肺纖維化。研究[10-11]表明,針灸可顯著改善患者的鼻癥狀和肺功能,證實(shí)了針灸的抗炎作用。美國臨床實(shí)踐指南等臨床指南推薦針灸治療變應(yīng)性鼻炎和急性咽炎[12-13]。然而,在預(yù)防和治療呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎方面,針灸并沒有得到廣泛運(yùn)用。因此,本研究通過建立呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎大鼠模型,并檢測大鼠血清ET、TNF-α、IL-1β、MPO水平,來評(píng)估針灸對(duì)呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎大鼠肺組織中發(fā)生的炎癥反應(yīng)程度的影響,以期為VAP治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性SD大鼠36只,體重 200～300 g,成都藥康生物科技有限公司提供,許可證號(hào):SCXK(川)2020-034。實(shí)驗(yàn)細(xì)菌:銅綠假單胞菌,菌種編號(hào):CCTCCAB202053,來源:中國典型培養(yǎng)物保藏中心。實(shí)驗(yàn)儀器 超低溫冰箱 (Sanyo-382AT,日本)、電子分析天平(Precisa12A,瑞士)、小動(dòng)物呼吸機(jī)(成都市新津事豐醫(yī)療器械有限公司)、高壓滅菌鍋(上海賽洋,中國)、顯微外科手術(shù)器械包(SSW-3型,上海手術(shù)器械廠)、純水儀(Millipore,德國)、酶聯(lián)免疫檢測儀(美國ThermoFisher儀器有限公司)、BX43光學(xué)顯微鏡(日本Olympus 公司)。實(shí)驗(yàn)試劑 酶聯(lián)免疫吸附法內(nèi)毒素( ET,試劑批號(hào)JL 13330-96T)、腫瘤壞死因子 ( TNF-α,試劑批號(hào)E-EL-H0109e)、白介素1β(IL-1β,試劑批號(hào)E-EL-R0012e)、髓過氧化物酶(MPO,試劑批號(hào)E0BC-KD74-M)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。生理鹽水(黑龍江齊泰動(dòng)物保健品有限公司)。細(xì)艾條(直徑7 mm,時(shí)時(shí)康艾灸堂;0.30 mm× 25 mm一次性無菌針灸針(無錫佳健醫(yī)療器械股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及構(gòu)建VAP大鼠模型 建立大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎模型[14]:取健康雄性大鼠36只用隨機(jī)數(shù)字表法機(jī)分為對(duì)照組、模型組、針灸組,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。除對(duì)照組外,其余各組在進(jìn)行氣管插管前禁食12h,然后腹腔注射4%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,固定在動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上,取仰臥位,將自制備的氣管導(dǎo)管在喉鏡的幫助下插入聲門,首先,要根據(jù)聽診大鼠的雙肺呼吸音來判斷導(dǎo)管是否已經(jīng)插入到了氣管中。之后,將氣管導(dǎo)管的外側(cè)與大鼠的上唇進(jìn)行縫合并固定,再與小動(dòng)物的呼吸機(jī)相連,從而進(jìn)行呼吸。呼吸機(jī)設(shè)置為:潮氣量(V)12 mL/kg,呼吸頻率70次/min,吸入的氧氣濃度(FiO2)100%。為了預(yù)防姿勢所致的肺不張,應(yīng)在30 min內(nèi)進(jìn)行2～3次大 VT換氣。3～5 mL/h的5%葡萄糖鹽水經(jīng)股靜脈插入導(dǎo)管注入。機(jī)械通氣持續(xù)24 h后,進(jìn)行肺部感染:使用微量注射器經(jīng)氣管導(dǎo)管快速注入0.2mL銅綠假單胞菌(PA)菌液和0.5 mL的無菌氣體,并保持體位并持續(xù)5 min,對(duì)照組同法給予等量生理鹽水。注射完畢后豎起大鼠保持體位5 min使菌液均勻進(jìn)入肺組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,進(jìn)行了逐層的肌肉和皮膚縫合。

1.2.2 治療方法 對(duì)照組:單純的喂養(yǎng)不予其他處理。模型組:每日灌胃生理鹽水2 mL×7 d。針灸組:于注射菌液造模后30 min后進(jìn)行針灸治療[15],選取大鼠常用穴位定位:“肺俞”:第3胸椎下兩旁肋間;“大椎”:第7頸椎與第1胸椎間,背部正中;“風(fēng)門”:第2胸椎下兩旁肋間。選用一次性毫針,“大椎”斜刺5 mm,“肺俞”、“風(fēng)門”各斜刺6 mm,留針30 min,運(yùn)用平補(bǔ)平瀉手法每10 min行針1次,每日2次,共7 d。于針刺治療結(jié)束后將點(diǎn)燃的艾條[16],距相同穴位皮膚表面2 cm處實(shí)施溫和灸,施灸15 min,每日2次,共7 d。

1.2.3 觀測指標(biāo)及檢測方法

1.2.3.1 一般情況 需要觀察大鼠的一般行為學(xué)變化,包括精神狀況、反應(yīng)能力、活動(dòng)度、攝食量、攝水量和大小便等,并注意是否出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促或口唇發(fā)紺等表現(xiàn)。

1.2.3.2 ELISA法檢測大鼠外周血中TNF-α,IL-1β,ET、MPO含量 大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血于無抗凝真空管中,將大鼠血液于4℃、3 000 r/min、半徑13.5 cm、離心15 min,取上清-80℃ 冷藏備用。取得樣本后,參照酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒指導(dǎo)說明進(jìn)行操作。

1.2.3.3 肺組織病理學(xué)觀察 ELISA檢測結(jié)束后,打開胸腔,剪取部分右肺中段組織,迅速將其浸入4%多聚甲醛固定24 h,經(jīng)乙醇脫水后,置于60℃蠟盒內(nèi)浸蠟、包埋,切片(厚4μm),分別于蘇木素和伊紅染液中染色、脫水、中性樹膠固定、封片,以觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件分析數(shù)據(jù),對(duì)所有的樣本進(jìn)行了正態(tài)性、方差齊性的檢驗(yàn),符合正態(tài)性檢驗(yàn),組間比較進(jìn)行單因素方差分析,當(dāng)方差齊的時(shí)候,可以使用LSD方法,當(dāng)方差不齊的時(shí)候,使用DunnettT3方法,當(dāng)不符合正態(tài)性的時(shí)候,使用秩和檢驗(yàn),P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中,對(duì)照組大鼠的精神狀態(tài)良好,反應(yīng)靈敏,毛發(fā)光亮有神,呼吸節(jié)律平穩(wěn)有序,二便正常,沒有出現(xiàn)異常分泌物;模型組的大鼠在注入銅綠假單胞菌菌液后,則逐漸出現(xiàn)呼吸急促、不安、口唇發(fā)青以及行動(dòng)遲緩等反應(yīng),隨著天數(shù)的增加這些大鼠逐漸出現(xiàn)精神萎靡或焦躁不安等異常表現(xiàn),并且毛色變得枯槁而無光澤;針灸組大鼠在注入銅綠假單胞菌菌液后,亦有上述反應(yīng),但整體癥狀與模型組比較明顯減輕。

2.2 大鼠血漿TNF-α、IL-1β、ET、MPO水平變化 單因素方法分析結(jié)果顯示,各組大鼠血漿ET,TNF-α、IL-1β、MPO水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠血漿的TNF-α、IL-1β、ET、MPO水平均高于正常組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較,針灸組大鼠血漿的TNF-α、IL-1β、ET、MPO水平均低于模型組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠炎癥因子的比較

2.3 肺組織病理形態(tài)學(xué)比較 對(duì)照組大鼠肺部形態(tài)正常,肺泡壁面完好,僅有極少的炎性細(xì)胞在支氣管內(nèi)的浸潤;與空白對(duì)照組比較,模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)重度異常,肺泡壁增厚,肺重度實(shí)質(zhì)化,并可見支氣管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤;與模型組比較,針灸組大鼠肺泡壁增厚情況改善明顯,支氣管周圍和肺泡組織內(nèi)部分炎癥細(xì)胞明顯減少。

對(duì)照組

3 討論

VAP在重患者室患者進(jìn)行侵襲性機(jī)械通氣后,大部分容易導(dǎo)致肺部感染,伴有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病和免疫低下患者,與細(xì)菌大分化及病毒感染引起的肺損傷及細(xì)胞因子不均衡有關(guān)。機(jī)械通氣等異物回到呼吸器官后,暴露在細(xì)菌和內(nèi)毒素等外部熱源的情況增加,因此分泌細(xì)胞因子,肺部受損,引發(fā)肺部炎癥。炎癥反應(yīng)會(huì)增加細(xì)胞因子的分泌,從而加劇炎癥反應(yīng)[17-18]。當(dāng) VAP患者受到細(xì)菌和真菌感染時(shí),會(huì)釋放內(nèi)毒素,激活單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞系統(tǒng),導(dǎo)致TNF-α和IL-1β 的產(chǎn)生,產(chǎn)生炎癥介質(zhì)引起炎癥反應(yīng),破壞組織。內(nèi)毒素對(duì)人有害,當(dāng)細(xì)菌死亡并通過人工方法溶解或消滅時(shí),內(nèi)毒素的釋放會(huì)引起發(fā)熱和白細(xì)胞反應(yīng)[19]。TNF-α是一種多效應(yīng)的細(xì)胞因子,主要由激活的單核-巨噬細(xì)胞分泌,參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答[20-21]。TNF-α同樣也是引發(fā)炎性介質(zhì)連鎖反應(yīng)的第一個(gè)因素,它可以將人體內(nèi)的IL-1β等炎性介質(zhì)進(jìn)行活化。IL-1β主要由活化的單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,經(jīng)常出現(xiàn)在血液中,在發(fā)熱和炎癥反應(yīng)中扮演重要角色。TNF-α和IL-1β炎癥或細(xì)胞因子在細(xì)胞中的產(chǎn)生可由體內(nèi)的相互作用引發(fā),從而對(duì)肺組織造成損害[22-23]。MPO是一種過氧化物酶,存在于中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中。它在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,并具有強(qiáng)大的抗菌和抗病毒功能。因此,監(jiān)測TNF-α、IL-1β、MPO、ET水平可以幫助評(píng)估VAP大鼠的炎癥反應(yīng)程度、嚴(yán)重程度以及預(yù)后情況等方面提供指導(dǎo)意義。

在中醫(yī)學(xué)理論中并沒有對(duì)VAP的描述,但根據(jù)其致病特點(diǎn)及氣急、喘息、膿痰等臨床表現(xiàn),多歸屬于“喘證”、“肺脹”、“痰飲”、“傷寒”等范疇[24]。本病病位在肺,與脾、腎密切相關(guān),基本病機(jī)為 "氣虛邪盛"。肺主氣,肺氣虛弱是本病發(fā)病的主要原因。接受機(jī)械通氣的患者,病情嚴(yán)重,體質(zhì)下降,五臟功能不全,肺的通氣能力下降。外邪入肺,郁遏肺氣,宣發(fā)無力,痰濁阻肺,呼吸困難,是本病的病因。針刺是利用特定的針刺手法,將針刺入人體特定部位以達(dá)到療效,具有舒經(jīng)活絡(luò)、理筋止痛等功能。艾灸是一種中醫(yī)特色治療方法,可以溫補(bǔ)肺氣、活血化瘀。據(jù)研究表明,艾灸還能夠調(diào)節(jié)腸道菌群,減少炎癥反應(yīng)等作用[25]。肺俞是背部的一個(gè)穴位,對(duì)于清熱解表、止咳平喘有很好的效果。大椎則是三陽督脈之會(huì),具有益衛(wèi)固表、振奮全身陽氣和止咳平喘的功效。風(fēng)門也能夠起到清熱、止咳平喘的作用。Li J等[26]發(fā)現(xiàn),在針刺大鼠的肺俞、腎俞和定喘穴進(jìn)行治療時(shí),可以降低IL-8和TNF-α水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠血漿的TNF-α、IL-1β、ET、MPO水平明顯高于空白對(duì)照組,提示VAP模型大鼠肺組織呈高炎癥反應(yīng),證實(shí)上述炎癥因子與VAP炎性反應(yīng)有著密切的內(nèi)在聯(lián)系。與模型組比較,針灸組大鼠血漿的TNF-α、IL-1β、ET、MPO水平均下降,肺臟中炎性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量通過針灸治療后而減少,原因可能與針灸減輕VAP大鼠組織損傷、抗炎等作用有關(guān)系,但具體調(diào)控機(jī)制尚未明確,后續(xù)實(shí)驗(yàn)仍需進(jìn)一步研究。