葉芮含,尚 李,彭會珍,周志宏,浦仕彪

(云南中醫(yī)藥大學(xué),云南 昆明 650500)

缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是由腦供血動脈(頸動脈和椎動脈)狹窄或閉塞、腦供血不足,導(dǎo)致局部腦組織缺血缺氧進而損傷壞死,并出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損癥狀的疾病[1]。近年來,中藥制劑治療缺血性心腦血管疾病的研究已取得了實質(zhì)性進展,有研究表明,三七總皂苷[2-3]、燈盞花素[4]、天麻素[5]、水蛭[6-7]、龍血竭[8]等中藥對神經(jīng)缺失癥狀的卒中患者有明顯改善作用,并能降低出血和復(fù)發(fā)的風(fēng)險。但是,相比之下哪種藥物對血栓的作用效果更好目前尚無相關(guān)研究報道。因此本研究以上述五種藥材為研究對象,針對缺血性腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)“血栓形成”,采用多種藥效學(xué)指標(biāo)比較各中藥的抗缺血性腦卒中效果。

1 材料

1.1 樣品

1.1.1 受試物 三七總皂苷,含量>90%;燈盞花素,含燈盞乙素>90%;天麻提取物,提取率0.583%,每克約相當(dāng)于生藥171.5 g;水蛭凍干粉,收率27.1%,每克約相當(dāng)于鮮品3.7 g;龍血竭粉,西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司,國藥準(zhǔn)字Z20063472,生產(chǎn)批號220114,每聽裝250 g;均由云南中醫(yī)藥大學(xué)提供。

1.1.2 對照藥品 復(fù)方丹參片(國藥準(zhǔn)字Z53021243,0.32 g/片,60片/瓶,云南白藥集團股份有限公司生產(chǎn),批號ZFA1504),遮光、密封、陰涼處保存。實驗時,用0.5%的CMC-Na配制成濃度的混懸液供小鼠灌胃用。

阿司匹林,拜耳醫(yī)藥保健有限公司出品(國藥準(zhǔn)字H20120237,生產(chǎn)批號:8J14974),100mg/片,30片/盒;按1.5mg/mL的濃度灌胃給藥。

燈盞細辛注射液,云南生物谷藥業(yè)股份有限公司,(國藥準(zhǔn)字Z53021569,10mL/支,2支/盒,批號20211147),遮光、密封、陰涼處保存,直接使用。

1.1.3 溶媒對照 羧甲基纖維素鈉(CMC-Na),化學(xué)純,(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號F20200909),用純水加熱、煮沸、冷卻后定容配制成0.5%濃度供受試樣品配制及溶媒對照用。一次配制,使用5～7 d。

1.2 動物 SPF級ICR小鼠,雌雄兼用,4～6周齡,體重18～26 g,由昆明制藥集團動物室提供,生產(chǎn)許可證:SCXK(滇)2014-0001。發(fā)證機關(guān):昆明市科學(xué)技術(shù)局;飼養(yǎng)于IVC動物實驗室,溫度20～25℃(日溫差≤3℃),濕度40%～70%,照明12h:12h明暗交替,照度150～300lx,噪音≤60dB,實驗動物使用許可證:SCK(滇)K2013-0004,發(fā)證單位:昆明市科學(xué)技術(shù)局;PVC透明塑料盒群養(yǎng),每箱≤6只,每日喂飼鼠用配合飼料,自由飲水,視情況更換籠具和墊料,飼料來源于昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,生產(chǎn)許可證:SCXK(滇)2011-0004,發(fā)證單位:昆明市科學(xué)技術(shù)局。

1.3 主要儀器 DENVER INSTRUMENT電子分析天平,賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司,d=0.0001 g,用于稱量樣品及試藥;HX602Z型電子天平,慈溪市大東衡器廠,d=0.2 g,用于稱量動物體重;248WBJV型海爾冰箱,青島市海爾股份有限公司;容量瓶、量筒、燒杯、剪刀、秒表、小鼠固定器、毛細管及其它耗材均為國產(chǎn)。

1.4 主要試劑 水合氯醛,國藥集團化學(xué)試劑有限公司出品,批號:H37022673。使用時,用氯化鈉注射液配制成4%濃度,按10mL/kg腹腔注射麻醉小鼠。

角叉菜膠,Sigma公司,生產(chǎn)批號:C101325 g,規(guī)格:25 g,按20 mg/kg劑量腹腔注射角叉菜膠10 mL/kg。

二磷酸腺苷(C10H15N5O10P2,ADP),上海源葉生物科技有限公司出品,生產(chǎn)批號:N31M8W37078,存貯:-20℃,規(guī)格:5 g。使用時生理鹽水配制成250 mg/kg體重,按10mL/kg尾靜脈注射。

2 方法與結(jié)果

2.1 對小鼠出凝血時間的影響[9]

2.1.1 對小鼠斷尾出血時間的影響 選用20～24 g雄性ICR小鼠99只,按體重隨機分為9組:溶媒對照;陽性對照阿司匹林30 mg/kg,復(fù)方丹參480 mg/kg及燈盞細辛20 mL/kg;三七總皂苷50 mg/kg;燈盞花素20 mg/kg;天麻提取物200 mg/kg;水蛭500 mg/kg;龍血竭500 mg/kg;每組11只。各組動物每日分別按劑量經(jīng)口灌胃給藥1次,連續(xù)5 d,溶媒對照組給予0.5%CMC-Na,容積均為20 mL/kg。末次給藥后30 min,將小鼠尾尖5 mm處剪斷,從出血開始(濾紙上出現(xiàn)血跡)計時,每30秒用濾紙吸去血滴一次,直到出血自然停止(濾紙上無血跡)的時間即為出血時間。結(jié)果見圖1。

圖1 各樣品對小鼠出血時間的影響

由圖1可見,除天麻提取物外,其余所有給藥組均能顯著延長小鼠的出血時間,與ASP作用一致,其作用順序為:ASP>燈盞花素>龍血竭>水蛭凍干>燈盞細辛>復(fù)方丹參>三七總皂苷>天麻素提取物。

2.1.2 對小鼠凝血時間的影響 分組及給藥同2.1.1試驗。末次給藥后30min,取內(nèi)徑0.5mm、長10cm毛細玻管自小鼠一側(cè)眼球內(nèi)眥插入球后靜脈叢,至血液流入毛細玻管內(nèi)開始計時,血液注滿后將毛細玻管取出平放于桌上,每隔30秒折斷二端毛細管約0.5cm,至血凝絲出現(xiàn)為止的時間即為凝血時間。結(jié)果見圖2。

圖2 各樣品對小鼠凝血時間的影響

由圖2可見,與溶媒對照組相比各給藥組均能顯著延長小鼠的凝血時間,其作用順序為:三七總皂苷>龍血竭粉>天麻提取物>水蛭凍干粉>復(fù)方丹參片>燈盞細辛>燈盞花素。

2.2 對小鼠體內(nèi)血栓形成的影響

2.2.1 對ADP誘導(dǎo)小鼠肺血栓的影響 分組及給藥同2.1.1試驗。末次給藥后30 min,按文獻[10]方法于小鼠尾靜脈注射250 mg/kg的二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)生理鹽水溶液10 mL/kg,觀察并記錄15min內(nèi)各組動物的死亡數(shù),按下式計算存活率。結(jié)果見圖3。

圖3 各樣品對樣品對ADP誘導(dǎo)小鼠肺血栓的影響

存活率(%)=(動物總數(shù)-死亡數(shù))/動物總數(shù)

由圖3可見,所有給藥組均能明顯提高ADP誘導(dǎo)肺血栓形成小鼠的存活率,其作用順序為:燈盞細辛>水蛭凍干粉 = 復(fù)方丹參片>三七總皂苷=燈盞花素=龍血竭粉>天麻提取物>ASP。

2.2.2 對角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓形成的影響 選用18～20 g雄性ICR小鼠144只,按體重隨機分為12組:溶媒對照;陽性對照阿司匹林30 mg/kg;三七總皂苷50、200 mg/kg;燈盞花素20、80 mg/kg;天麻提取物200、800 mg/kg;水蛭500、2000 mg/kg;龍血竭500、2000 mg/kg;每組12只。各組動物每日分別按劑量經(jīng)口灌胃給藥1次,連續(xù)5 d,溶媒對照組給予0.5%CMC-Na,容積均為20 mL/kg。末次給藥后30 min,每鼠按20 mg/kg劑量腹腔注射角叉菜膠10 mL/kg,造模24 h后觀察每鼠尾部血栓形成情況,計算各組小鼠的血栓形成率,并按下式計算血栓形成抑制率[11]。結(jié)果見表1。

表1 系列樣品對角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓形成的影響

抑制率(%)=(對照組形成率-給藥組形成率)/對照組形成率

由表1可見,所有給藥組均能不同程度抑制角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠的尾部血栓形成率,除燈盞花素高劑量和水蛭凍干的高低劑量組僅有作用趨勢外,其余各組與對照組相比均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異;作用順序為:三七總皂苷低劑量=天麻提取物低劑量=龍血竭低劑量>ASP =三七總皂苷劑高量=燈盞花素低劑量=天麻提取物高劑量=龍血竭高劑量>水蛭低劑量=燈盞花素高劑量>水蛭高劑量;各樣品低劑量組作用強于高劑量。

2.3 對急性腦缺血的影響

2.3.1 對斷頭腦缺血小鼠張口喘息時間的影響[12]選擇20-22 g雄性ICR小鼠144只,分組及給藥按2.2.2試驗。末次給藥后30 min,用利器將小鼠快速斷頭,觀察并記錄小鼠斷頭后張口喘息的持續(xù)時間為耐受腦缺血缺氧時間。結(jié)果見圖4。

圖4 各樣品對斷頭小鼠張口喘氣時間的影響

由圖4可見,除ASP組僅有一定作用趨勢(P>0.05)外,其余給藥組均能顯著延長斷頭小鼠的張口喘息時間(P<0.05/0.01),提示對急性腦缺血缺氧有一定的保護作用;作用順序為:天麻提取物高劑量>水蛭高劑量>天麻提取物低劑量>三七總皂苷劑高量>三七總皂苷低劑量>燈盞花素低劑量>燈盞花素高劑量>水蛭低劑量>龍血竭低劑量>龍血竭高劑量>ASP。

3 結(jié)論

中藥用于抗缺血性腦卒中治療已有多年,本研究檢測的中藥在臨床應(yīng)用中也有較多報道。本文運用臨床治療缺血性腦卒中的5種藥材的6個樣品進行抗凝、抗血栓及抗腦缺血缺氧作用初步比較實驗,結(jié)果表明各樣品均有抗血栓及腦保護作用,但側(cè)重點有所差異。在抗凝及抗血栓對比實驗中,三七總皂苷的活性最好,而藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)是發(fā)揮其藥理作用的關(guān)鍵,三七總皂苷是三七主根或根莖中的主要成分,包括三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rd[13],但對其有效成分在缺血性腦卒中的干預(yù)機制缺乏系統(tǒng)性研究。并且是否是由于各中藥的有效成分不同,才使其治療效果有所差異有待進一步研究。因此認(rèn)為,若主要針對抗凝及抗血栓的單一藥物治療可以首選三七,若要組方治療下一步可以考慮對其進行組方配比研究評價。