李招兵 劉雨露 黃云輝

南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬南華醫(yī)院心血管內(nèi)科（湖南衡陽 421002）

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion，MI/R），因其多種復(fù)雜的機(jī)制參與心肌細(xì)胞死亡，使得I/R損傷的防治變得更加棘手［1-2］。文獻(xiàn)報(bào)道，I/R損傷的機(jī)制包括ROS富集、鈣超載、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等［3-5］。通過探討其調(diào)控的病理過程的關(guān)鍵靶標(biāo)分子，為臨床篩選潛在的心臟保護(hù)藥物提供依據(jù)。

硫酸乙酰肝素酶（Heparanase，HPSE）是能降解細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸肝素的內(nèi)切葡萄糖醛酸酶，調(diào)控細(xì)胞黏附、增殖和遷移［6-7］。NODA等［8］研究發(fā)現(xiàn)，低表達(dá)HPSE介導(dǎo)NF-κB信號(hào)途徑，從而抵抗肺I/R。也有文獻(xiàn)報(bào)道，HPSE抑制劑可以減輕胰島細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)及氧化應(yīng)激，減輕細(xì)胞的凋亡［9］。因此，筆者推測(cè)下調(diào)HPSE基因可以保護(hù)心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞的損傷。本研究旨在探討下調(diào)HPSE抑制UPRmt信號(hào)通路對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞的影響，為MI/R的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MI/R動(dòng)物模型及分組60只健康成年SD雄性大鼠，10～12周齡，280～320 g，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，使用許可證號(hào)SYXK（湘）2020-0002，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過南華大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。飼養(yǎng)于溫度為25～28 ℃，濕度為40%～50%的SPF級(jí)環(huán)境。

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，利用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為對(duì)照組、I/R組、I/R+shRNA-NC組和I/R+Heparanase-shRNA組，每組15只。對(duì)照組開胸后僅穿線但不結(jié)扎，其他各組大鼠均采用結(jié)扎冠脈左前降支的手術(shù)方式制備MI/R模型［10］，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液（50 mg/kg）麻醉，并用動(dòng)物呼吸器通氣，潮氣量（6～8 mL/kg），呼吸機(jī)頻率（80次/min）。夾趾無退縮后于左心耳根部下方2 mm進(jìn)針，肺動(dòng)脈圓錐旁出針結(jié)扎左前降支，當(dāng)心尖處變蒼白、心臟搏動(dòng)減弱，完全結(jié)扎時(shí)于針線上方墊一直徑為1.0 mm適當(dāng)長(zhǎng)度的棉線并打活結(jié)，30 min后解開結(jié)扎線，然后再灌注3 h，逐層縫合后關(guān)胸，術(shù)后注意保溫。動(dòng)脈結(jié)扎后使用心電圖檢測(cè)結(jié)果顯示ST段上抬0.1 mV以上，持續(xù)30 min后打開結(jié)扎線，恢復(fù)血流灌注，心電圖顯示結(jié)扎后ST段下降1/2以上視為造模成功。

1.2 藥物與試劑白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；肌紅蛋白（myohemoglobin，Mb）試劑盒子、肌酸激酶同工酶（creatine kinase MB，CK-MB）和心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin，cTnI）試劑盒均購(gòu)自上海基免實(shí)業(yè)有限公司；Caspase-3/鼠抗（美國(guó)CST公司）、Bax/鼠抗（上海碧云天生物科技有限公司）、Bcl-2/鼠抗（Proteintech Technology，Inc）、Heparanase/兔抗（GeneTex，Inc）、HSP70/兔抗（武漢華美生物工程有限公司）、LonP1/兔抗（Proteintech Technology，Inc）和ACTIN/兔抗（Proteintech Technology，Inc）；蘇木素、伊紅（購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司）；中性甲醛、乙醇、二甲苯（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司；二抗抗鼠和抗兔（Proteintech Technology，Inc）。

1.3 主要儀器超速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Optima公司，型號(hào)：MAX-130K）、-20 ℃冰箱（德國(guó)Siemens公司）、-80 ℃超低溫冰箱（美國(guó)Thermo Scientific公司，型號(hào)：Forma 900）、Synergy? HT多功能酶標(biāo)儀（USA Bio-Tek Instruments，Inc.，型號(hào)：iMark）、微型垂直電泳槽及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號(hào)：VE 180）、凝膠成像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，型號(hào)：2500R，1600R）。

1.4 構(gòu)建Heparanase-shRNA的載體本實(shí)驗(yàn)中使用的Heparanase-shRNA和NC-shRNA均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因生物有限公司。設(shè)計(jì)靶向硫酸乙酰肝素酶RNA干擾序列，合成靶序列的雙鏈DNA，接入pGCL-GFP載體，PCR篩選陽性克隆，測(cè)序鑒定。包裝產(chǎn)生具備感染能力的慢病毒：（1）293T細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，將細(xì)胞放于37 ℃（含5℅CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔24 h給細(xì)胞換1次培養(yǎng)基，每當(dāng)細(xì)胞密度為70%～80%時(shí)，將細(xì)胞傳代，分瓶培養(yǎng)。（2）用pHelper1.0和pHelper2.0質(zhì)粒與相應(yīng)體積的轉(zhuǎn)染試劑混勻，室溫下靜置15 min。293T細(xì)胞用PBS洗3遍，加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基15 mL。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，充分混勻后，將細(xì)胞放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～12 h后，給細(xì)胞換液，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。（3）檢測(cè)病毒的滴度（1 × 108TU/mL）后，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠通過尾靜脈注射含50 μg Heparanase-shRNA的生理鹽水0.2 mL，I/R+shRNA-NC組大鼠尾靜脈注射含50 μg NC-shRNA的生理鹽水0.2 mL，其余兩組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平取上述處死的大鼠心肌組織，剪取0.025 g組織，用冰預(yù)冷PBS洗組織，加入300 μL RIPA裂解液于生物樣品均質(zhì)儀中反復(fù)研磨組織直至看不見組織塊；冰上，裂解10 min；4 ℃，12 000 r/min離心 15 min；將離心后的上清轉(zhuǎn)至1.5 mL的離心管中；取200 μL蛋白上清，加入50 μL 5×loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白，用1×TBST將PVDF膜置搖床上洗凈麗春紅，隨后將放入5%的脫脂牛奶中，使PVDF膜全部浸入牛奶中，在常溫下封閉2 h，按照蛋白抗體說明書稀釋一抗，將膜置于4 ℃冰箱孵育過夜。次日用TBST洗滌PVDF膜3～5次。洗完后室溫下孵育相應(yīng)種屬的二抗1 h，TBST洗滌4～5次，每次20 min。打開全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)，將PVDF膜置于成像板上，滴加適量的超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，檢測(cè)蛋白含量。用AlphaImager2200-灰度掃描軟件統(tǒng)計(jì)灰度值，以ACTIN為內(nèi)參蛋白，對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.6 大鼠心臟功能及心肌損傷標(biāo)記物檢測(cè)使用DW-T6彩色多普勒超聲儀連接小動(dòng)物Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠心率（heart rate，HR）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左室壁厚度（left ventricular wall thickness，LVWT）及再灌注末經(jīng)腹主動(dòng)脈取血100 μL，靜置后以3 000 r/min離心15 min，分離血清，ELISA檢測(cè)血清MB、CK-MB和cTnI水平。

1.7 氧化應(yīng)激物質(zhì)檢測(cè)完成大鼠心臟功能檢測(cè)后從頸總動(dòng)脈插管接取0.5 mL 大鼠血液，離心（1 000 ×g，20 min），取上清液留存在-20 ℃冰箱。以ELISA法檢測(cè)血清SOD、MDA的含量（具體操作依據(jù)該使用說明書）。

1.8 大鼠心肌病理情況觀察完成大鼠心肌損傷標(biāo)記物檢測(cè)后斷脖法處死大鼠，取大鼠心肌組織，使用二甲苯浸泡后使用梯度乙醇脫水，蘇木精浸泡后鹽酸乙醇分化、氨水沖洗，分別使HE染色和TUNEL染色中性樹膠封片，在400倍鏡觀察大鼠心肌細(xì)胞狀態(tài)，并隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)心肌細(xì)胞凋亡率。

1.9 炎癥因子檢測(cè)取上述大鼠外周血，在低溫離心機(jī)中以 3 000 r/min離心15 min，取上清液嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)IL-6和TNF-α含量水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究數(shù)據(jù)分析采用軟件為SPSS 22.0，本研究作圖采用軟件為GraphPad Prism5，多組間比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 大鼠Heparanase蛋白相對(duì)表達(dá)的檢測(cè)Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，I/R組大鼠Heparanase蛋白相對(duì)表達(dá)顯著升高（t=24.03，P＜0.01）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+HeparanaseshRNA組Heparanase蛋白相對(duì)表達(dá)顯著降低（t=13.18，P＜0.01），見圖1。

2.2 大鼠心臟功能和心肌損傷標(biāo)記物的檢測(cè)檢測(cè)大鼠心臟功能以及心肌損傷標(biāo)記物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠HR、LVEF、LVWT均顯著降低，CK-Mb、cTnI、Mb水平均顯著升高（P＜0.05）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+HeparanaseshRNA組HR、LVEF、LVWT均顯著升高，CK-Mb、cTnl、Mb水平均顯著降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 大鼠心臟功能以及心肌損傷標(biāo)記物的檢測(cè)Fig.2 Detection results of cardiac function and myocardial injury markers in rat myocardium

2.3 TUNEL及HE染色觀察大鼠心肌病理改變TUNEL染色觀察大鼠心肌組織發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高（t=55.51，P＜0.01）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低（t=32.66，P＜0.01），見圖3A。由HE染色觀察大鼠心肌組織可以看出，Control組大鼠心肌組織、肌外膜、心肌纖維均正常且完整；I/R組大鼠和I/R+shRNA-NC組大鼠心肌纖維彎曲，肌紅蛋白溶解，同時(shí)心肌肌細(xì)胞核固縮、溶解，肌束膜破裂；I/R+Heparanase-shRNA組大鼠心肌組肌外膜較為完整、心肌纖維彎曲顯著改善，見圖3B。

圖3 TUNEL及HE染色觀察大鼠心肌病理改變（400 ×）Fig.3 Observation the pathological changes of rat myocardium by TUNEL and HE staining in rat myocardium（400 ×）

2.4 大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)據(jù)Western blot方法檢測(cè)各組凋亡蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高（t=8.61，P＜0.01）、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高（t=9.04，P＜0.01），Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（t=14.51，P＜0.01）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（t=7.27，P＜0.01）、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低（t=15.85，P＜0.01），而Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高（t=11.86，P＜0.01），見圖4。

圖4 大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)Fig.4 Detection of apoptosis-related proteins in rat myocardium

2.5 大鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)記物及炎癥因子檢測(cè)檢測(cè)大鼠氧化應(yīng)激標(biāo)記物及炎癥因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠MDA、IL-6、TNF-α水平顯著升高，SOD水平顯著降低（P＜0.05）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組MDA、IL-6、TNF-α水平顯著降低，SOD水平顯著升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 大鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)記物及炎癥因子檢測(cè)Fig.5 Detection the serum oxidative stress markers and inflammatory factors in rat myocardium

2.6 大鼠心肌組織UPRmt標(biāo)志蛋白檢測(cè)據(jù)Western blot方法檢測(cè)凋亡蛋白發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05）；LonP1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠HSP70、LonP1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01），見圖6。

圖6 大鼠心肌組織UPRmt標(biāo)志蛋白檢測(cè)Fig.6 Detection the UPRmt marker proteins in rat myocardium

3 討論

及時(shí)恢復(fù)堵塞冠脈的血流是實(shí)現(xiàn)挽救缺血心肌細(xì)胞的最有效方法［11-13］。然而，再灌注是一把“雙刃劍”，除了挽救缺血心肌外，還會(huì)引起新的心肌細(xì)胞死亡，即再灌注損傷［14-16］。到目前為止，臨床上較好的預(yù)防或治療再灌注損傷的方法和藥物還亟待解決。

心肌缺血再灌注發(fā)生前會(huì)導(dǎo)致氧自由基及炎癥因子的大量釋放，從而引起心肌僵硬和損傷，心臟功能障礙［17-19］。因此，早期精準(zhǔn)清除氧自由基和炎癥因子能夠有效緩解心肌損傷和心臟功能障礙。崔勤濤等［20］研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI水平明顯升高，SOD和GSH含量降低，MDA含量升高，經(jīng)下調(diào)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA核內(nèi)富集轉(zhuǎn)錄物1預(yù)處理后，其心肌損傷明顯好轉(zhuǎn)，氧化應(yīng)激和炎癥水平顯著降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Heparanase的表達(dá)后，心肌缺血再灌注大鼠心臟功能明顯好轉(zhuǎn)，心肌病理損傷得到改善，心肌氧化應(yīng)激水平降低。同時(shí)與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠MDA、IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著下降，而SOD水平顯著升高，說明下調(diào)HPSE基因的表達(dá)后，炎癥因子水平顯著降低，提示大鼠體內(nèi)的炎癥和氧化應(yīng)激水平得到有效的抑制，與WANG等［21］研究結(jié)果相一致。因此，下調(diào)Heparanase可降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，從而緩解大鼠心肌損傷。

前期研究結(jié)果顯示：心肌缺血再灌注損傷組大鼠心肌病理損傷程度、心肌損傷標(biāo)記物、氧化應(yīng)激和炎癥因子含量水平明顯升高，而大鼠EF、LVSP、FS明顯低下，心肌病理損傷嚴(yán)重，CK-MB、Mb和cTnI升高明顯［22］。通過檢測(cè)大鼠心肌血流動(dòng)力學(xué)情況發(fā)現(xiàn)：與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠HR、LVEF、LVWT均顯著升高，而CK-Mb、cTnI、Mb表達(dá)水平均顯著降低，說明下調(diào)HPSE后，大鼠心臟跳動(dòng)能力增強(qiáng)同時(shí)心臟收縮能力增強(qiáng)，表明大鼠心臟功能明顯改善；也表明了下調(diào)HPSE后，大鼠心肌細(xì)胞得到了有效的保護(hù)，細(xì)胞破裂顯著減少，使得細(xì)胞中的相關(guān)酶進(jìn)入血液減少，緩解心肌組織受損，與PEI等［23］研究結(jié)果一致。

氧化應(yīng)激與炎癥因子之間的惡性循環(huán)直接攻擊損傷的心肌細(xì)胞導(dǎo)致膜通透性顯著增加，最終破壞促凋亡與抑凋亡之間的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)一步加重心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠Caspase-3、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高。說明下調(diào)HPSE基因的表達(dá)后，心肌細(xì)胞中凋亡基因受到抑制，抗凋亡基因受到了促進(jìn)，心肌細(xì)胞凋亡得到了明顯的改善，保護(hù)MI/R，與NGUYUEN等［24］研究結(jié)果一致。

眾所周知，不良應(yīng)激刺激可誘發(fā)線粒體未折疊蛋白反應(yīng)（UPRmt），UPRmt的分子伴侶蛋白HSP70水平不足則可促進(jìn)未折疊蛋白過度富集誘導(dǎo)線粒體損傷，而UPRmt的標(biāo)志蛋白LonP1不足則不能很好地介導(dǎo)蛋白降解途徑識(shí)別、降解未折疊蛋白，從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜顯著畸形、超極化及凋亡［25］。文獻(xiàn)［26］報(bào)道，HSP70與LonP1之間的穩(wěn)態(tài)遭到破壞則導(dǎo)致未折疊蛋白過度富集，造成未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)不能對(duì)抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的線粒體損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，I/R組大鼠HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)顯著上升，而LonP1蛋白相對(duì)表達(dá)下降；與I/R+shRNA-NC組比較，I/R+Heparanase-shRNA組大鼠HSP70、LonP1蛋白相對(duì)表達(dá)顯著上升，表明下調(diào)Heparanase促線粒體折疊系統(tǒng)和識(shí)別降解功能的恢復(fù)。

本研究?jī)H對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損失模型作了較多探索，但小動(dòng)物生理學(xué)結(jié)構(gòu)及功能與人體差異較大，應(yīng)該更進(jìn)一步尋找臨床證據(jù)和結(jié)合與之對(duì)應(yīng)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，提升該研究的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，下調(diào)HPSE通過介導(dǎo)UPRmt信號(hào)途徑抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡從而減輕缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞的損傷。最近研究發(fā)現(xiàn)，HPSE抑制劑抑制人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬發(fā)生［27］，是否下調(diào)HPSE減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷是通過抑制自噬途徑也值得我們進(jìn)一步探討。