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        下調(diào)硫酸乙酰肝素酶減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制

        2023-12-22 01:08:34李招兵劉雨露黃云輝
        實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2023年21期
        關(guān)鍵詞:氧化應(yīng)激水平檢測(cè)

        李招兵 劉雨露 黃云輝

        南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院附屬南華醫(yī)院心血管內(nèi)科(湖南衡陽 421002)

        心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemiareperfusion,MI/R),因其多種復(fù)雜的機(jī)制參與心肌細(xì)胞死亡,使得I/R損傷的防治變得更加棘手[1-2]。文獻(xiàn)報(bào)道,I/R損傷的機(jī)制包括ROS富集、鈣超載、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等[3-5]。通過探討其調(diào)控的病理過程的關(guān)鍵靶標(biāo)分子,為臨床篩選潛在的心臟保護(hù)藥物提供依據(jù)。

        硫酸乙酰肝素酶(Heparanase,HPSE)是能降解細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì)中的硫酸肝素的內(nèi)切葡萄糖醛酸酶,調(diào)控細(xì)胞黏附、增殖和遷移[6-7]。NODA等[8]研究發(fā)現(xiàn),低表達(dá)HPSE介導(dǎo)NF-κB信號(hào)途徑,從而抵抗肺I/R。也有文獻(xiàn)報(bào)道,HPSE抑制劑可以減輕胰島細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)及氧化應(yīng)激,減輕細(xì)胞的凋亡[9]。因此,筆者推測(cè)下調(diào)HPSE基因可以保護(hù)心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞的損傷。本研究旨在探討下調(diào)HPSE抑制UPRmt信號(hào)通路對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞的影響,為MI/R的治療提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 MI/R動(dòng)物模型及分組60只健康成年SD雄性大鼠,10~12周齡,280~320 g,購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司,使用許可證號(hào)SYXK(湘)2020-0002,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過南華大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。飼養(yǎng)于溫度為25~28 ℃,濕度為40%~50%的SPF級(jí)環(huán)境。

        大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,利用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為對(duì)照組、I/R組、I/R+shRNA-NC組和I/R+Heparanase-shRNA組,每組15只。對(duì)照組開胸后僅穿線但不結(jié)扎,其他各組大鼠均采用結(jié)扎冠脈左前降支的手術(shù)方式制備MI/R模型[10],大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液(50 mg/kg)麻醉,并用動(dòng)物呼吸器通氣,潮氣量(6~8 mL/kg),呼吸機(jī)頻率(80次/min)。夾趾無退縮后于左心耳根部下方2 mm進(jìn)針,肺動(dòng)脈圓錐旁出針結(jié)扎左前降支,當(dāng)心尖處變蒼白、心臟搏動(dòng)減弱,完全結(jié)扎時(shí)于針線上方墊一直徑為1.0 mm適當(dāng)長(zhǎng)度的棉線并打活結(jié),30 min后解開結(jié)扎線,然后再灌注3 h,逐層縫合后關(guān)胸,術(shù)后注意保溫。動(dòng)脈結(jié)扎后使用心電圖檢測(cè)結(jié)果顯示ST段上抬0.1 mV以上,持續(xù)30 min后打開結(jié)扎線,恢復(fù)血流灌注,心電圖顯示結(jié)扎后ST段下降1/2以上視為造模成功。

        1.2 藥物與試劑白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α) ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司;肌紅蛋白(myohemoglobin,Mb)試劑盒子、肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB,CK-MB)和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin,cTnI)試劑盒均購(gòu)自上海基免實(shí)業(yè)有限公司;Caspase-3/鼠抗(美國(guó)CST公司)、Bax/鼠抗(上海碧云天生物科技有限公司)、Bcl-2/鼠抗(Proteintech Technology,Inc)、Heparanase/兔抗(GeneTex,Inc)、HSP70/兔抗(武漢華美生物工程有限公司)、LonP1/兔抗(Proteintech Technology,Inc)和ACTIN/兔抗(Proteintech Technology,Inc);蘇木素、伊紅(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司);中性甲醛、乙醇、二甲苯(上海聯(lián)邁生物工程有限公司);丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司;二抗抗鼠和抗兔(Proteintech Technology,Inc)。

        1.3 主要儀器超速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Optima公司,型號(hào):MAX-130K)、-20 ℃冰箱(德國(guó)Siemens公司)、-80 ℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Scientific公司,型號(hào):Forma 900)、Synergy? HT多功能酶標(biāo)儀(USA Bio-Tek Instruments,Inc.,型號(hào):iMark)、微型垂直電泳槽及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(上海天能科技有限公司,型號(hào):VE 180)、凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司,型號(hào):2500R,1600R)。

        1.4 構(gòu)建Heparanase-shRNA的載體本實(shí)驗(yàn)中使用的Heparanase-shRNA和NC-shRNA均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因生物有限公司。設(shè)計(jì)靶向硫酸乙酰肝素酶RNA干擾序列,合成靶序列的雙鏈DNA,接入pGCL-GFP載體,PCR篩選陽性克隆,測(cè)序鑒定。包裝產(chǎn)生具備感染能力的慢病毒:(1)293T細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù),細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng),將細(xì)胞放于37 ℃(含5℅CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔24 h給細(xì)胞換1次培養(yǎng)基,每當(dāng)細(xì)胞密度為70%~80%時(shí),將細(xì)胞傳代,分瓶培養(yǎng)。(2)用pHelper1.0和pHelper2.0質(zhì)粒與相應(yīng)體積的轉(zhuǎn)染試劑混勻,室溫下靜置15 min。293T細(xì)胞用PBS洗3遍,加入含10%血清的DMEM培養(yǎng)基15 mL。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中,充分混勻后,將細(xì)胞放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6~12 h后,給細(xì)胞換液,加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。(3)檢測(cè)病毒的滴度(1 × 108TU/mL)后,I/R+Heparanase-shRNA組大鼠通過尾靜脈注射含50 μg Heparanase-shRNA的生理鹽水0.2 mL,I/R+shRNA-NC組大鼠尾靜脈注射含50 μg NC-shRNA的生理鹽水0.2 mL,其余兩組大鼠經(jīng)尾靜脈注射等量生理鹽水。

        1.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平取上述處死的大鼠心肌組織,剪取0.025 g組織,用冰預(yù)冷PBS洗組織,加入300 μL RIPA裂解液于生物樣品均質(zhì)儀中反復(fù)研磨組織直至看不見組織塊;冰上,裂解10 min;4 ℃,12 000 r/min離心 15 min;將離心后的上清轉(zhuǎn)至1.5 mL的離心管中;取200 μL蛋白上清,加入50 μL 5×loading buffer混勻,沸水煮5 min,放入冰盒中速冷備用。用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白,用1×TBST將PVDF膜置搖床上洗凈麗春紅,隨后將放入5%的脫脂牛奶中,使PVDF膜全部浸入牛奶中,在常溫下封閉2 h,按照蛋白抗體說明書稀釋一抗,將膜置于4 ℃冰箱孵育過夜。次日用TBST洗滌PVDF膜3~5次。洗完后室溫下孵育相應(yīng)種屬的二抗1 h,TBST洗滌4~5次,每次20 min。打開全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng),將PVDF膜置于成像板上,滴加適量的超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑,檢測(cè)蛋白含量。用AlphaImager2200-灰度掃描軟件統(tǒng)計(jì)灰度值,以ACTIN為內(nèi)參蛋白,對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

        1.6 大鼠心臟功能及心肌損傷標(biāo)記物檢測(cè)使用DW-T6彩色多普勒超聲儀連接小動(dòng)物Medlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠心率(heart rate,HR)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室壁厚度(left ventricular wall thickness,LVWT)及再灌注末經(jīng)腹主動(dòng)脈取血100 μL,靜置后以3 000 r/min離心15 min,分離血清,ELISA檢測(cè)血清MB、CK-MB和cTnI水平。

        1.7 氧化應(yīng)激物質(zhì)檢測(cè)完成大鼠心臟功能檢測(cè)后從頸總動(dòng)脈插管接取0.5 mL 大鼠血液,離心(1 000 ×g,20 min),取上清液留存在-20 ℃冰箱。以ELISA法檢測(cè)血清SOD、MDA的含量(具體操作依據(jù)該使用說明書)。

        1.8 大鼠心肌病理情況觀察完成大鼠心肌損傷標(biāo)記物檢測(cè)后斷脖法處死大鼠,取大鼠心肌組織,使用二甲苯浸泡后使用梯度乙醇脫水,蘇木精浸泡后鹽酸乙醇分化、氨水沖洗,分別使HE染色和TUNEL染色中性樹膠封片,在400倍鏡觀察大鼠心肌細(xì)胞狀態(tài),并隨機(jī)選取5個(gè)視野統(tǒng)計(jì)心肌細(xì)胞凋亡率。

        1.9 炎癥因子檢測(cè)取上述大鼠外周血,在低溫離心機(jī)中以 3 000 r/min離心15 min,取上清液嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)IL-6和TNF-α含量水平。

        1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究數(shù)據(jù)分析采用軟件為SPSS 22.0,本研究作圖采用軟件為GraphPad Prism5,多組間比較使用單因素方差分析,組間兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水平α=0.05。

        2 結(jié)果

        2.1 大鼠Heparanase蛋白相對(duì)表達(dá)的檢測(cè)Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,I/R組大鼠Heparanase蛋白相對(duì)表達(dá)顯著升高(t=24.03,P<0.01);與I/R+shRNA-NC組比較,I/R+HeparanaseshRNA組Heparanase蛋白相對(duì)表達(dá)顯著降低(t=13.18,P<0.01),見圖1。

        2.2 大鼠心臟功能和心肌損傷標(biāo)記物的檢測(cè)檢測(cè)大鼠心臟功能以及心肌損傷標(biāo)記物,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Control組比較,I/R組大鼠HR、LVEF、LVWT均顯著降低,CK-Mb、cTnI、Mb水平均顯著升高(P<0.05);與I/R+shRNA-NC組比較,I/R+HeparanaseshRNA組HR、LVEF、LVWT均顯著升高,CK-Mb、cTnl、Mb水平均顯著降低(P<0.05),見圖2。

        圖2 大鼠心臟功能以及心肌損傷標(biāo)記物的檢測(cè)Fig.2 Detection results of cardiac function and myocardial injury markers in rat myocardium

        2.3 TUNEL及HE染色觀察大鼠心肌病理改變TUNEL染色觀察大鼠心肌組織發(fā)現(xiàn),與Control組比較,I/R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(t=55.51,P<0.01);與I/R+shRNA-NC組比較,I/R+Heparanase-shRNA組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(t=32.66,P<0.01),見圖3A。由HE染色觀察大鼠心肌組織可以看出,Control組大鼠心肌組織、肌外膜、心肌纖維均正常且完整;I/R組大鼠和I/R+shRNA-NC組大鼠心肌纖維彎曲,肌紅蛋白溶解,同時(shí)心肌肌細(xì)胞核固縮、溶解,肌束膜破裂;I/R+Heparanase-shRNA組大鼠心肌組肌外膜較為完整、心肌纖維彎曲顯著改善,見圖3B。

        圖3 TUNEL及HE染色觀察大鼠心肌病理改變(400 ×)Fig.3 Observation the pathological changes of rat myocardium by TUNEL and HE staining in rat myocardium(400 ×)

        2.4 大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)據(jù)Western blot方法檢測(cè)各組凋亡蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),與Control組比較,I/R組大鼠Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(t=8.61,P<0.01)、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(t=9.04,P<0.01),Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(t=14.51,P<0.01);與I/R+shRNA-NC組比較,I/R+Heparanase-shRNA組Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(t=7.27,P<0.01)、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(t=15.85,P<0.01),而Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(t=11.86,P<0.01),見圖4。

        圖4 大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)Fig.4 Detection of apoptosis-related proteins in rat myocardium

        2.5 大鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)記物及炎癥因子檢測(cè)檢測(cè)大鼠氧化應(yīng)激標(biāo)記物及炎癥因子,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Control組比較,I/R組大鼠MDA、IL-6、TNF-α水平顯著升高,SOD水平顯著降低(P<0.05);與I/R+shRNA-NC組比較,I/R+Heparanase-shRNA組MDA、IL-6、TNF-α水平顯著降低,SOD水平顯著升高(P<0.05),見圖5。

        圖5 大鼠血清氧化應(yīng)激標(biāo)記物及炎癥因子檢測(cè)Fig.5 Detection the serum oxidative stress markers and inflammatory factors in rat myocardium

        2.6 大鼠心肌組織UPRmt標(biāo)志蛋白檢測(cè)據(jù)Western blot方法檢測(cè)凋亡蛋白發(fā)現(xiàn),與Control組比較,I/R組大鼠HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著上升(P<0.05);LonP1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著下降(P<0.05);與I/R+shRNA-NC組比較,I/R+Heparanase-shRNA組大鼠HSP70、LonP1蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著上升(P<0.01),見圖6。

        圖6 大鼠心肌組織UPRmt標(biāo)志蛋白檢測(cè)Fig.6 Detection the UPRmt marker proteins in rat myocardium

        3 討論

        及時(shí)恢復(fù)堵塞冠脈的血流是實(shí)現(xiàn)挽救缺血心肌細(xì)胞的最有效方法[11-13]。然而,再灌注是一把“雙刃劍”,除了挽救缺血心肌外,還會(huì)引起新的心肌細(xì)胞死亡,即再灌注損傷[14-16]。到目前為止,臨床上較好的預(yù)防或治療再灌注損傷的方法和藥物還亟待解決。

        心肌缺血再灌注發(fā)生前會(huì)導(dǎo)致氧自由基及炎癥因子的大量釋放,從而引起心肌僵硬和損傷,心臟功能障礙[17-19]。因此,早期精準(zhǔn)清除氧自由基和炎癥因子能夠有效緩解心肌損傷和心臟功能障礙。崔勤濤等[20]研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注大鼠血清Mb、CK-MB和cTnI水平明顯升高,SOD和GSH含量降低,MDA含量升高,經(jīng)下調(diào)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA核內(nèi)富集轉(zhuǎn)錄物1預(yù)處理后,其心肌損傷明顯好轉(zhuǎn),氧化應(yīng)激和炎癥水平顯著降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)Heparanase的表達(dá)后,心肌缺血再灌注大鼠心臟功能明顯好轉(zhuǎn),心肌病理損傷得到改善,心肌氧化應(yīng)激水平降低。同時(shí)與I/R+shRNA-NC組比較,I/R+Heparanase-shRNA組大鼠MDA、IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著下降,而SOD水平顯著升高,說明下調(diào)HPSE基因的表達(dá)后,炎癥因子水平顯著降低,提示大鼠體內(nèi)的炎癥和氧化應(yīng)激水平得到有效的抑制,與WANG等[21]研究結(jié)果相一致。因此,下調(diào)Heparanase可降低心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng),從而緩解大鼠心肌損傷。

        前期研究結(jié)果顯示:心肌缺血再灌注損傷組大鼠心肌病理損傷程度、心肌損傷標(biāo)記物、氧化應(yīng)激和炎癥因子含量水平明顯升高,而大鼠EF、LVSP、FS明顯低下,心肌病理損傷嚴(yán)重,CK-MB、Mb和cTnI升高明顯[22]。通過檢測(cè)大鼠心肌血流動(dòng)力學(xué)情況發(fā)現(xiàn):與I/R+shRNA-NC組比較,I/R+Heparanase-shRNA組大鼠HR、LVEF、LVWT均顯著升高,而CK-Mb、cTnI、Mb表達(dá)水平均顯著降低,說明下調(diào)HPSE后,大鼠心臟跳動(dòng)能力增強(qiáng)同時(shí)心臟收縮能力增強(qiáng),表明大鼠心臟功能明顯改善;也表明了下調(diào)HPSE后,大鼠心肌細(xì)胞得到了有效的保護(hù),細(xì)胞破裂顯著減少,使得細(xì)胞中的相關(guān)酶進(jìn)入血液減少,緩解心肌組織受損,與PEI等[23]研究結(jié)果一致。

        氧化應(yīng)激與炎癥因子之間的惡性循環(huán)直接攻擊損傷的心肌細(xì)胞導(dǎo)致膜通透性顯著增加,最終破壞促凋亡與抑凋亡之間的穩(wěn)態(tài),進(jìn)一步加重心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷。本研究發(fā)現(xiàn),與I/R+shRNA-NC組比較,I/R+Heparanase-shRNA組大鼠Caspase-3、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低,Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高。說明下調(diào)HPSE基因的表達(dá)后,心肌細(xì)胞中凋亡基因受到抑制,抗凋亡基因受到了促進(jìn),心肌細(xì)胞凋亡得到了明顯的改善,保護(hù)MI/R,與NGUYUEN等[24]研究結(jié)果一致。

        眾所周知,不良應(yīng)激刺激可誘發(fā)線粒體未折疊蛋白反應(yīng)(UPRmt),UPRmt的分子伴侶蛋白HSP70水平不足則可促進(jìn)未折疊蛋白過度富集誘導(dǎo)線粒體損傷,而UPRmt的標(biāo)志蛋白LonP1不足則不能很好地介導(dǎo)蛋白降解途徑識(shí)別、降解未折疊蛋白,從而導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜顯著畸形、超極化及凋亡[25]。文獻(xiàn)[26]報(bào)道,HSP70與LonP1之間的穩(wěn)態(tài)遭到破壞則導(dǎo)致未折疊蛋白過度富集,造成未折疊蛋白反應(yīng)信號(hào)系統(tǒng)不能對(duì)抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的線粒體損傷。本研究發(fā)現(xiàn),與Control組比較,I/R組大鼠HSP70蛋白相對(duì)表達(dá)顯著上升,而LonP1蛋白相對(duì)表達(dá)下降;與I/R+shRNA-NC組比較,I/R+Heparanase-shRNA組大鼠HSP70、LonP1蛋白相對(duì)表達(dá)顯著上升,表明下調(diào)Heparanase促線粒體折疊系統(tǒng)和識(shí)別降解功能的恢復(fù)。

        本研究?jī)H對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損失模型作了較多探索,但小動(dòng)物生理學(xué)結(jié)構(gòu)及功能與人體差異較大,應(yīng)該更進(jìn)一步尋找臨床證據(jù)和結(jié)合與之對(duì)應(yīng)的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),提升該研究的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

        綜上所述,下調(diào)HPSE通過介導(dǎo)UPRmt信號(hào)途徑抑制氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡從而減輕缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞的損傷。最近研究發(fā)現(xiàn),HPSE抑制劑抑制人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬發(fā)生[27],是否下調(diào)HPSE減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷是通過抑制自噬途徑也值得我們進(jìn)一步探討。

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