劉居理 陳勝輝 李琳 姚文亮 楊麗娟 饒研文

江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬生殖醫(yī)院（南昌市生殖醫(yī)院）（南昌 330004）

目前，精液常規(guī)分析仍然是臨床用來(lái)評(píng)估男性生育力最為主要的手段，也是最為常規(guī)的檢測(cè)。據(jù)估計(jì)，精液常規(guī)分析評(píng)價(jià)生育力僅有70%的準(zhǔn)確性。其主要原因在于常規(guī)精液分析只檢測(cè)了精液的理化性質(zhì)、精子濃度、數(shù)量、活力等。而這些指標(biāo)只能反映精液的基本情況，并不能對(duì)精子內(nèi)在功能進(jìn)行評(píng)估。由于導(dǎo)致男性不育的因素眾多，而且存在個(gè)體差異，外加精液參數(shù)參考范圍較廣，因此除了無(wú)精子癥或嚴(yán)重少、弱、畸形精子癥外，僅僅通過(guò)精液分析對(duì)男性生育力進(jìn)行評(píng)估是很不準(zhǔn)確的。有研究［1］表明，臨床上大約有1/3的男性不育患者常規(guī)精液分析結(jié)果均正常和接近正常，因此有必要進(jìn)一步完善精子功能評(píng)估的方法。

近年來(lái)，隨著研究的深入及技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一些新的評(píng)估精子功能的方法，如精子核DNA完整性、線粒體膜電位、誘發(fā)精子頂體反應(yīng)、精子活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)等。已有研究［2］表明，精子ROS對(duì)精子質(zhì)膜損傷所導(dǎo)致的受精能力喪失是造成男性不育的主要原因之一。研究［3］發(fā)現(xiàn)，適量ROS對(duì)精子受精具有重要的生理作用，但如果ROS過(guò)量則可造成精子損傷，導(dǎo)致精子活力下降、死亡率增高，從而引起男性不育。有研究表明，在25%～40%的不育男性的精液中檢測(cè)到高水平的ROS。因此，ROS對(duì)男性生育力的影響越來(lái)越受到生殖醫(yī)學(xué)工作者的重視。而采用體外受精-胚胎移植技術(shù)進(jìn)行助孕過(guò)程中，需要對(duì)精液進(jìn)行優(yōu)化處理。由于精漿中含有抗氧化酶，對(duì)精子具有保護(hù)作用，而精液處理通常需要去除精漿，從而使精子更易受到ROS的損傷。另外，在精液處理過(guò)程中，往往需要進(jìn)行離心，而精液多次離心會(huì)顯著增加ROS水平［4］。高水平的ROS可能會(huì)增加精子DNA斷裂率，而已有研究將精子DNA損傷與胚胎死亡增加聯(lián)系起來(lái)。因此，ROS是影響男性生育力及輔助生殖技術(shù)成功的一個(gè)重要病因和病理因素，其在生殖醫(yī)學(xué)的地位是不容忽視的。

以往許多研究［5-6］都是針對(duì)精漿中的ROS進(jìn)行的，而精漿ROS水平受精液中白細(xì)胞的干擾非常大［7］，導(dǎo)致結(jié)果與實(shí)際可能存在較大偏差，影響了研究結(jié)論的準(zhǔn)確性，也限制了其在臨床的應(yīng)用。近年來(lái)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展以及生殖領(lǐng)域?qū)Σ∫蛱剿鞯倪M(jìn)一步需求，準(zhǔn)確評(píng)估精子膜及線粒體ROS水平顯得更具意義，因?yàn)榫颖旧鞷OS更能反映其內(nèi)在功能。而目前對(duì)精子膜及線粒體ROS在生殖領(lǐng)域的應(yīng)用研究甚少，因此有必要明確精子膜及線粒體中ROS對(duì)男性生育力的影響及其在輔助生殖技術(shù)中的應(yīng)用價(jià)值，以期為男性不育患者提供一個(gè)新的生育力評(píng)估手段及病因治療方向，為輔助生殖助孕患者受孕時(shí)機(jī)的選擇提供一個(gè)參考指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取來(lái)我院就診的男性不育患者150例，擬接受體外受精-胚胎移植助孕的夫婦50例及正常生育志愿者50例為研究對(duì)象并簽署知情同意書(shū)。男性不育患者納入標(biāo)準(zhǔn)：同居兩年以上未避孕，性生活正常而未育，女方檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)異常，年齡≤ 45歲。正常生育志愿者納入標(biāo)準(zhǔn)：精液檢測(cè)參數(shù)在正常參考范圍內(nèi)且近2年內(nèi)已生育男性，年齡≤ 45歲。擬接受體外受精-胚胎移植助孕的夫婦納入標(biāo)準(zhǔn)為：（1）夫婦染色體檢查均為正常核型，男性檢査包括男性第二性征、陰莖、陰囊、精索、輸精管、附睪、睪丸等均無(wú)異常。（2）單純由女性輸卵管因素導(dǎo)致不育。女方年齡≤ 35歲，助孕次數(shù)≤ 2次，不孕年限≤ 5年，MⅡ卵子數(shù)≥ 4枚。本研究在實(shí)施前已通過(guò)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審查批準(zhǔn)（南昌市生殖醫(yī)院醫(yī)倫審字2021年第008號(hào)）。

1.2 分組為探討精子ROS與男性不育的關(guān)系，將研究對(duì)象分為：男性不育組（150例男性不育患者）和正常生育組（50例正常生育志愿者）。為探討精子ROS與精子膜功能和精子核DNA完整性的關(guān)系，根據(jù)精子ROS檢測(cè)結(jié)果將上述200例男性研究對(duì)象分為：ROS正常組（精子膜高ROS精子比例≤ 40%且線粒體高ROS精子比例≤ 55%）和ROS異常組（精子膜高ROS精子比例＞40%或線粒體高ROS精子比例＞55%）。為探討精子ROS與受精率，卵裂率，優(yōu)胚率及妊娠結(jié)局的關(guān)系，根據(jù)男方精液優(yōu)化處理后精子ROS檢測(cè)結(jié)果將50例擬接受體外受精-胚胎移植助孕的夫婦分為：IVF對(duì)照組（精子膜高ROS精子比例≤ 40%且線粒體高ROS精子比例≤ 55%）和IVF觀察組（精子膜高ROS精子比例＞40%或線粒體高ROS精子比例＞55%）。

1.3 研究方法

1.3.1 精液樣本采集及精液常規(guī)分析按《WHO人類(lèi)精液分析實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手冊(cè)》（第5版）要求對(duì)男性不育組及正常生育組進(jìn)行精液采集及常規(guī)分析和精子膜功能測(cè)定，并留取100 μL精液標(biāo)本存儲(chǔ)于-20 ℃冰箱用于精子核DNA完整性的測(cè)定。同時(shí)對(duì)其精子膜及線粒體ROS進(jìn)行測(cè)定并根據(jù)結(jié)果將研究對(duì)象分為ROS正常組及ROS異常組。

1.3.2 精子膜及線粒體ROS測(cè)定采用DCFHDA及MitoSOX Red對(duì)精子進(jìn)行染色，利用流式細(xì)胞儀對(duì)精子膜及線粒體ROS水平進(jìn)行檢測(cè)及分析。根據(jù)試劑盒提供的閾值：精子膜高ROS精子比例≤ 40%且線粒體高ROS精子比例≤ 55%者為活性氧正常，精子膜高ROS精子比例＞40%或線粒體高ROS精子比例＞55%者為活性氧異常。

1.3.3 精子膜功能測(cè)定精液液化后用伊紅Y對(duì)精子進(jìn)行染色，利用相差顯微鏡對(duì)染色后精子進(jìn)行觀察，分析精子膜功能情況。

1.3.4 精子核DNA完整性測(cè)定采用吖啶橙對(duì)精子進(jìn)行染色，利用流式細(xì)胞儀對(duì)精子核DNA完整性進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)DNA碎片指數(shù)（DFI）分析軟件對(duì)精子核DNA完整性進(jìn)行分析。

1.3.5 促排卵及取卵根據(jù)患者情況選擇合適的方案進(jìn)行促排卵，在B超監(jiān)測(cè)下行穿刺取卵術(shù)。

1.3.6 精液優(yōu)化處理采用雙層密度梯度離心法對(duì)接受體外受精-胚胎移植助孕夫婦的男方精液進(jìn)行優(yōu)化處理后，在充分保證體外受精所需精子的情況下，留取部分精子并進(jìn)行精子膜及線粒體ROS測(cè)定并根據(jù)結(jié)果將研究對(duì)象分為IVF對(duì)照組及IVF觀察組。

1.3.7 體外受精采用常規(guī)IVF受精方式進(jìn)行。

1.3.8 受精觀察及胚胎評(píng)估在取卵后的第1天（D1）進(jìn)行受精情況的觀察，第3天（D3）進(jìn)行卵裂期胚胎的觀察，第5天（D5）及第6天（D6）進(jìn)行囊胚期的觀察并記錄。

1.3.9 胚胎移植對(duì)適合新鮮移植的患者，在取卵后的第3天進(jìn)行卵裂胚的移植或在取卵后的第5天或第6天進(jìn)行囊胚移植。對(duì)不適合新鮮移植的患者，則將可用胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍并保存，擇期移植。

1.3.10 妊娠結(jié)局隨訪移植后35 d隨訪臨床妊娠情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別精子膜及線粒體ROS檢測(cè)結(jié)果比較男性不育組與正常生育組比較，精子膜高ROS精子比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而精子線粒體高ROS精子比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在精子ROS異常率方面，男性不育組顯著高于正常生育組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同組別精子膜及線粒體ROS檢測(cè)結(jié)果比較Tab.1 The comparison of sperm membrane and mitochondrial ROS levels in different groups ±s

表1 不同組別精子膜及線粒體ROS檢測(cè)結(jié)果比較Tab.1 The comparison of sperm membrane and mitochondrial ROS levels in different groups ±s

組別男性不育組正常生育組t值χ2值P值例數(shù)150 50膜高ROS精子比35.71 ± 15.00 28.10 ± 12.17-3.247-0.001線粒體高ROS精子比44.66 ± 15.65 44.10 ± 11.19-0.234-0.815 ROS異常率（%）49.33（74/150）30.00（15/50）-4.920 0.027

2.2 不同組別精子膜功能及核完整性檢測(cè)結(jié)果比較ROS正常組與ROS異常組比較，精子膜功能正常率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而精子核DNA完整性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同組別精子膜功能及核完整性檢測(cè)結(jié)果比較Tab.2 The comparison of sperm membrane function and nuclear integrity in different groups ±s，%

表2 不同組別精子膜功能及核完整性檢測(cè)結(jié)果比較Tab.2 The comparison of sperm membrane function and nuclear integrity in different groups ±s，%

組別ROS正常組ROS異常組t值P值例數(shù)111 89精子膜功能正常率46.74 ± 6.63 41.65 ± 9.75-4.381＜0.001精子DNA碎片指數(shù)14.66 ± 9.12 16.37 ± 9.59 1.288 0.199

2.3 不同組別臨床資料比較IVF對(duì)照組與IVF觀察組比較，年齡，不孕年限，獲卵數(shù)，移植胚胎種類(lèi)、數(shù)量、評(píng)分及子宮內(nèi)膜等基本情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。IVF對(duì)照組、IVF觀察組受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及臨床妊娠率分別為：75.44%vs.66.21%，95.27%vs.97.51%，49.07%vs.44.26%，61.90%vs.58.62%，兩組結(jié)果比較，受精率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而卵裂率、優(yōu)胚率及臨床妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3、4。

表3 不同組別臨床資料比較Tab.3 The comparison of clinical data in different groups ±s

表3 不同組別臨床資料比較Tab.3 The comparison of clinical data in different groups ±s

組別IVF對(duì)照組IVF觀察組t值χ2值P值例數(shù)21 29年齡（歲）31.62 ± 3.29 30.89 ± 3.21-0.786-0.436不孕年限（年）3.28 ± 1.59 3.14 ± 1.68-0.297-0.767獲卵數(shù)（個(gè)）10.67 ± 4.08 12.55 ± 4.15 1.592-0.118囊胚/卵裂移植比（%）31.25（5/16）20.83（5/24）-0.046 0.830移植胚胎數(shù)（個(gè)）1.67 ± 0.48 1.76 ± 0.43 0.696-0.490移植優(yōu)胚比（%）80.00（28/35）84.31（43/51）-0.052 0.819內(nèi)膜厚度（mm）11.05 ± 1.07 11.31 ± 1.17 0.803-0.426

表4 不同組別受精率、卵裂率、優(yōu)胚率及臨床妊娠率比較Tab.4 The comparison of fertilization rate，cleavage rate，superior embryo rate and clinical pregnancy rate in different groups

3 討論

目前，我國(guó)不孕癥的患病率為7%～10%［8］，其中接近50%是由男性因素引起的［9］。在引起男性不育的眾多因素中，ROS被認(rèn)為是其中的主要原因之一［10］。在日常生活環(huán)境當(dāng)中，許多常見(jiàn)因素如吸煙［11］、手機(jī)輻射［12］等均可促進(jìn)精子ROS的產(chǎn)生，因此精子ROS與男性生殖關(guān)系密切。雖然已有許多關(guān)于ROS與精子功能的研究，但臨床應(yīng)用甚少，且檢測(cè)樣本往往采用精漿，受精液中白細(xì)胞及非精子細(xì)胞的影響較大，容易產(chǎn)生偏差，從而限制了其臨床應(yīng)用。而精子膜及線粒體ROS檢測(cè)的是精子本身，受其他因素影響較少，特異性更強(qiáng)，結(jié)果也更準(zhǔn)確。

在輔助生殖技術(shù)中，往往需要對(duì)精液進(jìn)行優(yōu)化處理以回收高活力精子，這部分用于受精的精子ROS水平也許更能反映其真實(shí)狀況。有研究［13］提示，高ROS水平會(huì)導(dǎo)致精子DNA碎片率的增加，進(jìn)而使男性生育力降低，同時(shí)增加女方復(fù)發(fā)性流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，影響IVF助孕結(jié)局［14-15］。另外，有研究［16］表明：當(dāng)ROS含量過(guò)高時(shí)，可損害精子膜的流動(dòng)性，提高膜的通透性，使精子質(zhì)膜受體和下游信號(hào)通路紊亂，從而降低精子活力，影響精子形態(tài)。

為進(jìn)一步明確精子ROS對(duì)男性生育力的影響及其在輔助生殖中的應(yīng)用價(jià)值，以及精子ROS與精子核DNA完整性和精子膜功能的相關(guān)性。本項(xiàng)目利用DCFH-DA進(jìn)行精子膜ROS的檢測(cè)，利用MitoSOX Red進(jìn)行精子線粒體ROS的檢測(cè)。由于DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，可以自由通過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的脂酶水解生成DCFH，其不能透過(guò)細(xì)胞膜，從而使探針容易被標(biāo)記到細(xì)胞內(nèi)。在ROS存在的條件下，DCFH被氧化成熒光物質(zhì)DCF，發(fā)綠色熒光，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS呈正比。而MitoSOX Red是一種可以自由通過(guò)細(xì)胞膜的脂溶性陽(yáng)離子染料，染料的脂溶性增加了其透過(guò)細(xì)胞膜及線粒體膜的透過(guò)率，帶正電可以使其特異性的與超氧陰離子結(jié)合并固定在核酸之上。當(dāng)MitoSOX Red被超氧陰離子氧化后會(huì)與線粒體DNA結(jié)合使線粒體發(fā)出紅色熒光，熒光強(qiáng)度與超氧陰離子水平呈正比。因此該檢測(cè)方案具有較好的準(zhǔn)確性及科學(xué)性。本研究顯示：（1）男性不育組精子膜ROS水平明顯高于正常生育組，精子ROS異常率也顯著增高，說(shuō)明精子ROS水平與男性生育力具有一定聯(lián)系，這與既往研究結(jié)果也是相符的［17-18］。（2）ROS正常組、ROS異常組精子膜功能正常率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），本研究提示：精子膜及線粒體ROS水平與精子膜功能呈負(fù)相關(guān)，其機(jī)制可能為精子膜及線粒體ROS可通過(guò)氧化應(yīng)激使精子軸絲受損，誘導(dǎo)精子形態(tài)缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致精子膜功能下降［19-20］。這與現(xiàn)有研究結(jié)果也是一致的［21］。（3）ROS正常組、ROS異常組精子核DNA完整性并差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明精子膜及線粒體高ROS精子比例與精子核DNA完整性無(wú)直接關(guān)系，這與既往研究顯示的高水平ROS會(huì)增加精子DNA斷裂率并不一致，其原因可能是：本研究檢測(cè)的指標(biāo)是高ROS精子占所檢測(cè)精子的比例，反映的并不是精子ROS的絕對(duì)濃度，所以結(jié)論存在一定偏差。這也提示精子膜及線粒體ROS檢測(cè)可作為反映精子功能的一個(gè)獨(dú)立指標(biāo)。（4）IVF對(duì)照組與IVF觀察組比較，受精率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明精子膜及線粒體ROS水平與受精率具有一定關(guān)系，ROS水平過(guò)高可導(dǎo)致精子受精能力降低。而本研究并未發(fā)現(xiàn)ROS與卵裂率、優(yōu)胚率及臨床妊娠率間具有顯著關(guān)聯(lián)，推測(cè)其原因可能為：過(guò)量ROS可導(dǎo)致精子頂體膜過(guò)氧化和頂體活性降低，使精卵融合受損導(dǎo)致受精失?。?2］，而并不參與受精卵后續(xù)發(fā)育過(guò)程。另外，由于本次的研究對(duì)象有限，且導(dǎo)致不孕不育的機(jī)制復(fù)雜，因此結(jié)果可能存在一定偏差，需有待于更多的樣本數(shù)據(jù)和更詳細(xì)的分子機(jī)制去驗(yàn)證。

綜上可見(jiàn)，精子ROS與男性生育力具有一定關(guān)系，ROS異?？蓪?dǎo)致精子膜功能受損，并可影響精子受精能力，從而影響男性生育功能。精子ROS檢測(cè)可作為男性生育力評(píng)估的一個(gè)新手段并可為男性不育的診療提供依據(jù)。對(duì)于輔助生殖助孕患者，特別是卵子數(shù)量較少者，為盡力避免由于ROS過(guò)高導(dǎo)致受精率下降而影響后續(xù)胚胎的獲得，可根據(jù)精子ROS情況選擇合適的助孕時(shí)機(jī)。