張雅麗 張 敏 邢曉英 孫萌萌 齊冉 喬淑凱

急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)是一個(gè)全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題,與高發(fā)生率、高病死率和高醫(yī)療成本相關(guān),腎臟缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是發(fā)生AKI的重要原因,腎損傷早期功能尚可恢復(fù),如果損傷進(jìn)一步加重可進(jìn)展至腎衰竭狀態(tài),腎功能難以恢復(fù),目前臨床缺乏有效的治療方法,仍以血液透析、腎臟替代治療等為主,醫(yī)療費(fèi)用高。因此,尋找早期腎損傷標(biāo)志物以及具有腎臟保護(hù)作用的干預(yù)方法顯得尤為重要。

近年來(lái),中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutmphil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)作為早期AKI的生物學(xué)標(biāo)志物備受關(guān)注[1～3]。NGAL屬載脂蛋白超家族成員,生理狀態(tài)下可在多種正常組織中表達(dá),在某些良性疾病和惡性腫瘤中呈異常高表達(dá)。目前,有關(guān)NGAL的功能及其在I/R損傷方面的作用尚缺乏系統(tǒng)研究。有研究發(fā)現(xiàn),缺氧和缺血性腎損傷均可誘導(dǎo)自噬發(fā)生,但是自噬在I/R損傷中的作用仍需進(jìn)一步證實(shí)[4]。本研究通過(guò)建立大鼠腎臟I/R損傷模型,明確在NGAL及自噬在大鼠腎臟I/R損傷過(guò)程中的表達(dá)情況,旨在探討NGAL表達(dá)及自噬狀態(tài)在腎臟I/R損傷中發(fā)揮的作用。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:30只SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,體質(zhì)量為250～300g,飼養(yǎng)在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有的實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):2022-AE29)。大鼠購(gòu)進(jìn)后在SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)1周,實(shí)驗(yàn)前12h禁食、不禁水。將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組,即假手術(shù)組(Sham組)和缺血/再灌注組(I/R組),I/R組按照恢復(fù)再灌注后不同時(shí)間分為4個(gè)亞組,分別是2h、6h、24h和48h,每組各6只。

2.模型建立:以戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,采用兩側(cè)背部切口剪開(kāi)皮膚和肌層進(jìn)腹,顯露右側(cè)腎臟及腎蒂血管,迅速切除右腎。左側(cè)腎臟血管分離后,無(wú)損傷動(dòng)脈夾持續(xù)夾閉左腎動(dòng)脈,肉眼觀腎臟迅速由紅潤(rùn)變?yōu)樽虾谏砻鲓A閉成功,45min后松開(kāi)動(dòng)脈夾行再灌注,恢復(fù)左腎血流,若灌注后5min內(nèi)左腎由暗黑轉(zhuǎn)為紅潤(rùn)則表示灌注成功。然后于再灌注后不同時(shí)間切取大鼠左腎留取組織標(biāo)本,摘眼球法采取血標(biāo)本,隨后脊椎脫臼法處死大鼠。Sham組僅游離左腎動(dòng)脈但不予夾閉,余處理同I/R組。

3.腎功能檢測(cè):上述各組大鼠均采取摘眼球取血的方法留取血液標(biāo)本,置于離心管中,隨即在離心機(jī)上以3000r/min離心10min(離心半徑12cm),分別留取上層血清,利用Olympus AU2700全自動(dòng)生化分析儀(日本奧林巴斯)檢測(cè)。

4.NGAL水平檢測(cè):取上述各組大鼠的血液及尿液標(biāo)本,然后應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA)檢測(cè)血清及尿液中的NGAL表達(dá)水平。具體步驟參閱試劑盒說(shuō)明書(shū)。首先包被抗體,將捕獲抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度(0.8μg/ml),取100μl稀釋的抗體加入96孔酶標(biāo)板中在室溫下孵育過(guò)夜。隨后封閉抗體,并分別加入血液及尿液標(biāo)本,室溫孵育2h后檢測(cè)抗體,最后上機(jī)檢測(cè),加入底物溶液并封板室溫孵育,充分顯色后加入50μl的終止液并在BIO-RAD 550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)上測(cè)定450nm處波長(zhǎng)吸光度(A)值。

5.腎組織病理學(xué)評(píng)價(jià):將各組大鼠腎組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,制作石蠟切片。石蠟切片在二甲苯中常規(guī)脫蠟至水,蘇木精染色10min,流水沖洗后伊紅染液染色2min,乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)膠封片。光鏡下觀察各組腎組織變化。各組大鼠腎損傷程度根據(jù)腎組織損傷積分進(jìn)行評(píng)價(jià),病理評(píng)分范圍為0～5分:正常為0分;損傷面積<10%為1分;損傷面積10%～25%為2分;損傷面積25%～50%為3分;損傷面積50%～75%為4分;損傷面積≥75%為5分[5,6]。

6.原位末端標(biāo)記法((TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況:上述各組大鼠按要求于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)切取左側(cè)腎臟,以無(wú)菌手術(shù)刀片做縱切面剖開(kāi),切取厚度約0.4cm的腎組織塊置于4%多聚甲醛中固定,常規(guī)石蠟包埋,制作石蠟切片。石蠟切片在二甲苯中常規(guī)脫蠟和水化后,根據(jù)檢測(cè)TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察,每張切片在高倍鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)不重疊視野,對(duì)每個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù),綠色熒光發(fā)亮者為凋亡細(xì)胞,于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域,隨機(jī)選取5個(gè)視野,熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)。

7.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測(cè)自噬相關(guān)基因表達(dá)情況:將各組腎組織標(biāo)本用研缽充分研磨并離心。Trizol法提取細(xì)胞總RNA,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度A260/A280比值均>1.8,并根據(jù)A280為1≈40mg/L RNA進(jìn)行含量測(cè)定。配制25μl反轉(zhuǎn)錄體系,獲取cDNA備用。所有引物及反應(yīng)條件參考相關(guān)文獻(xiàn)[7],并核對(duì)GenBank中原始cDNA序列,經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司鑒定并合成。配制PCR反應(yīng)體系,反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10min,然后95℃變性15s,60℃退火/延伸60s,40次循環(huán)結(jié)束。每個(gè)樣本的LC3、Beclin-1和內(nèi)參β-actin的檢測(cè)均做3個(gè)平行管,以保證其結(jié)果的準(zhǔn)確性。LC3和Beclin-1靶基因相對(duì)于內(nèi)參β-actin的表達(dá)量用2-ΔCt表示。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)測(cè)定3次,結(jié)果取平均值。引物序列、擴(kuò)增片段如下:LC3(NM 022867.2):上游引物:5′-CATGCCGTCCGAGAAGACCT-3′,下游引物:5′-GATGAGCCGGACATCTTCCACT-3′;Beclin-1(NM 001034117.1):上游引物:5′-TTGGCCAATAAGATGGGTCTGAA-3′,下游引物:5′-TGTCAGGGACTCCAGATACGAGTG-3′;β-actin (NM 006248886.1):上游引物:5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′,下游引物:5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。

結(jié) 果

1.腎功能評(píng)價(jià):大鼠經(jīng)腎臟缺血恢復(fù)再灌注不同時(shí)間后,除2h組BU、SCr水平較Sham組無(wú)明顯升高外;6h組、24h組和48h組的BU、SCr水平較Sham組均明顯升高,說(shuō)明大鼠腎臟I/R損傷模型建立成功,腎功能出現(xiàn)不同程度的異常。與Sham組比較,24h組和48h組的BU、SCr水平最高(P<0.01),說(shuō)明其腎損傷程度加重,而48h組BU、SCr水平較24h組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,證實(shí)腎臟缺血再灌注后24h損傷已經(jīng)非常明顯,詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠BU和SCr水平A.各組大鼠血BU水平;B.各組大鼠SCr水平。與Sham組比較,*P<0.01,**P<0.001

2.大鼠血及尿中NGAL的表達(dá)水平:ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示,與Sham組比較,缺血再灌注損傷后2h即可檢測(cè)出血及尿中NGAL不同程度地升高,6h組血及尿中的NGAL表達(dá)量升至最高,24h組及48h組NGAL表達(dá)有所下降,但仍高于正常,說(shuō)明在腎損傷早期NGAL表達(dá)量即可升高并被檢測(cè)到,詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠血清和尿液中NGAL表達(dá)量A.各組大鼠血清中NGAL的表達(dá)水平;B.各組大鼠尿液中NGAL的表達(dá)水平

3.腎組織形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià):腎組織切片蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示,Sham組腎組織結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常。隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng),I/R組可見(jiàn)到腎小管上皮細(xì)胞不同程度損傷。I/R損傷后2h局部可觀察到腎小管上皮細(xì)胞腫脹,管腔擴(kuò)張;I/R損傷后6h可有上皮細(xì)胞脫落、變性、刷狀緣消失等現(xiàn)象發(fā)生,部分腎小管管腔狹窄;24h后可有腎小管上皮細(xì)胞核固縮、碎裂等,出現(xiàn)變性甚至壞死,腎小管結(jié)構(gòu)松散,輪廓不清晰,管腔內(nèi)可見(jiàn)壞死脫落的細(xì)胞碎屑、大量紅細(xì)胞及蛋白管型出現(xiàn);48h后部分病變的腎小管逐漸開(kāi)始出現(xiàn)修復(fù)現(xiàn)象,可觀察再生的上皮細(xì)胞不斷增多,可見(jiàn)核分裂象,管腔內(nèi)的細(xì)胞殘留物質(zhì)有所減少(圖3A)。與Sham組比較,2h組、6h組、24h組和48h組病理?yè)p傷評(píng)分均明顯升高(圖3B)。

圖3 各組腎組織病理學(xué)改變及病理?yè)p傷評(píng)分A.各組腎組織病理圖片(HE染色,×200)。Sham組顯示正常腎組織結(jié)構(gòu);腎臟缺血后恢復(fù)再灌注不同時(shí)間的腎組織結(jié)構(gòu)變化,如圖中藍(lán)色箭頭所示,2h組:管腔擴(kuò)張,上皮細(xì)胞腫脹;6h組:上皮細(xì)胞脫落、變性;24h組:腎小管結(jié)構(gòu)松散,輪廓不清晰,管腔內(nèi)可見(jiàn)壞死脫落的細(xì)胞碎屑;48h組:管腔內(nèi)的細(xì)胞殘留物質(zhì)有所減少。B. 各組腎組織病理?yè)p傷評(píng)分。與Sham組比較,*P<0.05,**P<0.01

4.細(xì)胞凋亡檢測(cè):TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示,Sham組TUNEL染色陰性,幾乎未見(jiàn)細(xì)胞發(fā)生凋亡;而發(fā)生I/R損傷后可見(jiàn)到TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞,24h組和48h組陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多。與Sham組比較,6h組、24h組和48h組凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯增多,而2h組可見(jiàn)到少數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù),但與Sham組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,詳見(jiàn)圖4。

圖4 各組腎組織TUNEL染色圖和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)A.有代表性的凋亡細(xì)胞免疫熒光圖片,TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞核被染成綠色(TUNEL染色,×200);B.平均每高倍視野的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。與Sham組比較,*P<0.05,**P<0.01

5.LC3、Beclin-1的mRNA表達(dá)水平:RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與Sham組比較,I/R組可檢測(cè)到LC3、Beclin-1的mRNA不同程度表達(dá),說(shuō)明大鼠腎臟I/R損傷后,自噬被激活。與Sham組比較,2h組雖能檢測(cè)到少量LC3、Beclin-1的mRNA表達(dá),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),6h組、24h組和48h組均可檢測(cè)到明顯LC3、Beclin-1的mRNA表達(dá)(P<0.01),提示自噬處于激活狀態(tài),詳見(jiàn)圖5。

圖5 各組LC3及Beclin-1的mRNA相對(duì)表達(dá)情況與Sham組比較,*P<0.05,**P<0.01

討 論

近年來(lái),隨著腎臟手術(shù)、腎移植、心臟外科體外循環(huán)、休克后微循環(huán)再通等不斷增加,使許多組織器官缺血后重新得到血液再灌注,導(dǎo)致I/R損傷日益增多。腎臟是一個(gè)高灌注器官,對(duì)于再灌注損傷尤其敏感。本研究成功建立了大鼠腎臟I/R損傷模型,觀察在I/R損傷后不同時(shí)間腎功能及病理變化情況,以及在此過(guò)程中NGAL表達(dá)及自噬激活情況,為進(jìn)一步探討NGAL及自噬對(duì)大鼠腎臟I/R損傷過(guò)程中的作用打下了基礎(chǔ)。

NGAL屬于載脂蛋白超家族成員,最初在活化的中性粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。NGAL參與機(jī)體多種生物學(xué)過(guò)程,如胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、炎癥及免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、糖類(lèi)脂質(zhì)代謝等多種生理及病理過(guò)程[8～10]。本研究結(jié)果顯示,在大鼠腎臟I/R損傷后的不同時(shí)段,均可有不同程度的腎小管上皮細(xì)胞的腫脹、壞死,甚至核固縮、碎裂,伴隨有細(xì)胞凋亡的發(fā)生,證明本研究大鼠腎臟I/R損傷模型成功建立。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明,腎臟I/R損傷后傳統(tǒng)的腎損傷指標(biāo)BU和SCr水平的升高與腎組織病理學(xué)損傷程度的變化趨勢(shì)具有一致性,均可用于評(píng)價(jià)腎臟I/R損傷的嚴(yán)重程度,但其弊端同樣不可忽略,BU及SCr值在腎臟I/R損傷后6h才開(kāi)始升高,24h達(dá)到高峰,但病理學(xué)顯示腎臟I/R損傷后2h即可觀察到局部腎小管上皮細(xì)胞腫脹,管腔擴(kuò)張,腎組織病理評(píng)分較Sham組已明顯升高,說(shuō)明腎損傷已經(jīng)發(fā)生,而此時(shí)BU及SCr值仍處于正常水平,當(dāng)腎臟I/R損傷6h BU及SCr檢測(cè)到升高時(shí),腎損傷已處于較為嚴(yán)重狀態(tài),腎小管上皮細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,而這種程度的損傷有時(shí)是不可逆的,因此,傳統(tǒng)的腎損傷指標(biāo)BU及SCr在診斷時(shí)限上有明顯的延后性,導(dǎo)致臨床上有可能會(huì)喪失治療AKI的最佳時(shí)機(jī)。

在腎臟I/R損傷后2h即可檢測(cè)出血清及尿液中NGAL水平的升高,至6h時(shí)NGAL水平已升至最高,充分說(shuō)明在腎損傷早期NGAL水平即可升高并被檢測(cè)到,更能真實(shí)、同步地反映腎損傷的嚴(yán)重性,從而驗(yàn)證了NGAL可以作為早期診斷腎臟I/R損傷的理想分子指標(biāo),相關(guān)研究目前已經(jīng)受到廣泛關(guān)注[11～13]。然而,NGAL表達(dá)水平的升高對(duì)于腎臟I/R損傷而言,究竟是發(fā)揮保護(hù)性作用還是進(jìn)一步加重?fù)p傷,目前尚未有這方面的研究報(bào)道。因此需要進(jìn)一步的研究來(lái)驗(yàn)證NGAL對(duì)腎臟I/R損傷的作用以及可能涉及的機(jī)制。

I/R損傷可造成細(xì)胞功能障礙,同時(shí)可觸發(fā)凋亡、自噬和壞死。自噬又稱(chēng)為Ⅱ型細(xì)胞死亡,是細(xì)胞在自噬相關(guān)基因(Atg)的調(diào)控下利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和高分子物質(zhì)的過(guò)程。自噬可以清除細(xì)胞中損傷或衰老的細(xì)胞器及生物高分子,維持細(xì)胞的自我穩(wěn)態(tài)。Beclin-1是一種獨(dú)特的自噬相關(guān)蛋白,在調(diào)解其他自噬蛋白形成預(yù)自噬體結(jié)構(gòu)時(shí)的定位方面發(fā)揮重要作用。LC3是哺乳動(dòng)物的同源酵母Atg8,也是自噬研究中最重要、最可靠的標(biāo)志物[14]。本研究結(jié)果顯示,2h組檢測(cè)的LC3、Beclin-1的mRNA表達(dá)與Sham組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,腎臟I/R損傷后6h則可以檢測(cè)到LC3、Beclin-1的mRNA表達(dá)水平較Sham組顯著增加,提示自噬處于激活狀態(tài)。國(guó)外有研究顯示,腎臟I/R損傷后腎小管細(xì)胞中自噬激活,并在腎臟I/R損傷的細(xì)胞和動(dòng)物模型中均得到證明,這與本研究結(jié)果基本一致[15～17]。

綜上所述,關(guān)于自噬對(duì)于腎臟I/R損傷的作用,國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果尚不一致。多數(shù)研究認(rèn)為自噬參與腎臟I/R損傷,并起到保護(hù)性作用;但也有相反的觀點(diǎn)認(rèn)為自噬雖然在腎損傷中扮演保護(hù)角色,但是過(guò)度自噬可加重腎細(xì)胞損傷或死亡。NGAL能否通過(guò)調(diào)控自噬對(duì)腎臟I/R損傷發(fā)揮保護(hù)作用,需開(kāi)展進(jìn)一步研究予以證實(shí)。