張 蒙 王惠明

腎間質纖維化是多種慢性腎臟病的最終共同病理特征,給全球公共衛(wèi)生帶來了巨大負擔,其發(fā)病機制涉及到炎癥、自噬、氧化應激、細胞凋亡、能量代謝紊亂、上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)等多種過程[1～3]。淋巴增強子結合因子1(lymphoid enhancer binding factor 1, LEF1)是T細胞因子/LEF1家族的成員之一,是Wnt/β-catenin信號通路的重要下游介質,可以作為轉錄因子與特定的DNA序列(Wnt響應元件)結合而發(fā)揮調節(jié)基因轉錄的作用[4]。有研究表明,LEF1可以通過EMT、細胞周期阻滯和凋亡等途徑促進食管癌、結腸癌、膀胱癌等多種腫瘤的惡性進展,但LEF1在腎間質纖維化中是否發(fā)揮作用及其具體機制尚不明確[5～7]。本研究通過建立腎間質纖維化的體內和體外模型,探討LEF1在腎間質纖維化中的作用及機制,為腎間質纖維化的治療提供新的思路和靶點。

材料與方法

1. 動物模型構建及分組:飼養(yǎng)于武漢大學人民醫(yī)院動物實驗中心的6～8周齡野生型無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性C57BL/6小鼠18只,體質量為20±2g,購自鼠來寶(武漢)生物科技有限公司,許可證號:SYCK(京)2019-0013。采用完全隨機設計將18只小鼠隨機分為假手術組、單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)3天組和UUO 7天組,每組各6只。UUO模型組用4%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,取左側腹部切口,找到并游離左側輸尿管,于近腎盂處結扎離斷左側輸尿管,隨后將臟器復位后逐層縫合腹壁。假手術組除不結扎離斷輸尿管余同UUO組。假手術組和UUO 3天組于術后3天處死小鼠,UUO 7天組于術后7天處死小鼠,留取腎臟。

2.細胞培養(yǎng)及分組:人近端腎小管上皮細胞系(HK-2)購自武漢大學細胞庫,用含10%胎牛血清(美國Gibco公司)和1%青鏈霉素(美國Hyclone公司)的DMEM-F12培養(yǎng)液(美國Hyclone公司)置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)中培養(yǎng)。細胞用含0.5%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液同步化12h后用于實驗。按不同轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)(美國MCE公司)濃度處理分為3組,即對照組(培養(yǎng)基組)、10ng/ml TGF-β1組、20ng/ml TGF-β1組,刺激時間為24h。按siRNA轉染及TGF-β1處理分為4組,即Ctrl siRNA組、LEF1siRNA組、Ctrl siRNA+TGF-β1組和LEF1siRNA+TGF-β1組。

3.Western blot法:收集各組腎組織及各組細胞,用含蛋白酶抑制劑(美國MCE公司)和磷酸酶抑制劑(美國MCE公司)的裂解液(武漢碧云天生物技術有限公司)裂解,動物組織勻漿(美國Retsch公司),離心取上清,加熱變性。測蛋白濃度后取等量蛋白凝膠電泳,濕轉至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF膜),5%脫脂奶粉室溫封閉1h,一抗4℃孵育過夜,其中一抗分別為LEF1兔單抗(英國Abcam公司)、纖連蛋白(fibronectin,FN)、兔單抗(英國Abcam公司)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)兔單抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)、Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ)兔單抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)兔單抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)、波形蛋白(Vimentin)兔單抗(武漢賽維爾生物科技有限公司)、聚磷酸核糖聚合酶剪切體(cleaved poly ADP-ribose polymerase, cleaved PARP)(武漢愛博泰克生物科技有限公司)、半胱氨酸蛋白酶-3剪切體(cleaved caspase-3)(武漢愛博泰克生物科技有限公司),均為1∶1000稀釋。二抗(武漢安特捷生物技術有限公司)室溫孵育1h。凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)曝光條帶,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phophoate dehydrogenase, GAPDH)作為內參,以Image J軟件測量并分析條帶灰度。

4.腎組織病理學檢查:取新鮮腎組織固定于4%多聚甲醛中,乙醇脫水,石蠟包埋并切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色及Masson染色,并于顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察腎組織病理變化。

5.免疫組化(immunohistochemistry,IHC)法:腎組織石蠟切片常規(guī)梯度脫蠟水化,高溫枸櫞酸鈉抗原修復,3%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化物酶,牛血清白蛋白室溫下封閉1h,LEF1一抗4℃過夜,二抗37℃孵育1h。滴加3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-Diaminobenzidine,DAB)顯色,顯微鏡下觀察,蘇木精復染,脫水透明封片。

6.siRNA轉染:待細胞長至60%～70%后,分別將ctrl siRNA(武漢生工生物工程股份有限公司)、LEF1siRNA(武漢生工生物工程股份有限公司)、Lipofectamine RNA iMAX(美國Invitrogen公司)加入無血清培養(yǎng)液中室溫靜置5min后,將RNA iMAX稀釋液以體積1∶1分別加入ctrl siRNA和LEF1siRNA稀釋液中混勻,室溫孵育15min,隨后將混合液加入細胞培養(yǎng)基中。37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12h,更換完全培養(yǎng)基并加入10ng/ml TGF-β1,處理24h后收集細胞。

7.流式細胞術:將上述分組細胞消化離心后磷酸鹽緩沖液洗滌2次,用加入了Annexin V-PE和7-AAD(美國BD公司)的Binding Buffer重懸混勻,室溫避光孵育15min后于流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)上機檢測。

結 果

1.腎組織病理改變:HE染色結果顯示,與假手術組比較,UUO后腎間質炎性細胞浸潤,部分小管擴張,且UUO 7天組比UUO 3天組改變更明顯(圖1)。Masson染色結果顯示,隨UUO時間的延長,膠原沉積逐漸增加(圖1)。小鼠腎間質纖維化模型構建成功。

圖1 小鼠腎間質纖維化模型的建立(×400)

2.小鼠腎間質纖維化后LEF1表達改變:Western blot法及IHC法檢測結果顯示,與假手術組比較,UUO 3天組及UUO 7天組LEF1的表達均升高,且主要表達于腎小管上皮細胞的細胞核中(P<0.05),詳見圖2。

圖2 UUO后腎組織中的LEF1表達升高A.免疫組化染色結果(×400);B.Western blot法檢測結果。與假手術組比較,*P<0.05

3.TGF-β1處理HK-2細胞后對LEF1的影響:用10ng/ml和20ng/ml TGF-β1處理HK-2細胞構建腎小管上皮細胞的纖維化反應模型,FN的表達水平逐漸增高,表明纖維化反應逐漸加重,同時LEF1的蛋白表達與對照組比較也呈升高趨勢(P<0.05),詳見圖3。

圖3 用TGF-β1處理的HK-2細胞中LEF1的蛋白表達水平升高與對照組比較,*P<0.05

4.LEF1敲低對HK-2細胞纖維化反應的影響:Western blot法檢測結果顯示,與Ctrl siRNA組比較,LEF1siRNA組LEF1的蛋白表達明顯降低(P<0.05),詳見圖4。與Ctrl siRNA組比較,Ctrl siRNA+TGF-β1組的纖維化反應標志物FN、collagen Ⅰ、α-SMA的表達明顯升高。而與Ctrl siRNA+TGF-β1組比較,LEF1siRNA+TGF-β1組的纖維化反應標志物表達水平相對減少,纖維化反應減輕(P<0.05),詳見圖4。

圖4 LEF1敲低可減輕HK-2細胞的纖維化反應與Ctrl siRNA組比較,*P<0.05;與Ctrl siRNA+TGF-β1組比較,#P<0.05

5.LEF1敲低對HK-2細胞EMT的影響:EMT是腎間質纖維化的重要機制之一,為了探究LEF1敲低減輕腎小管上皮細胞纖維化反應的機制,本研究進一步檢測了敲低LEF1后HK-2的EMT指標。與Ctrl siRNA組比較,Ctrl siRNA+TGF-β1組發(fā)生了EMT,表現(xiàn)為上皮細胞標志物E-cadherin表達下降及間充質細胞標志物Vimentin表達上調(P<0.05)。而轉染LEF1siRNA后可以明顯抑制TGF-β1誘導的EMT,詳見圖5。

圖5 LEF1敲低可抑制HK-2細胞的EMT與Ctrl siRNA組比較,*P<0.05;與Ctrl siRNA+ TGF-β1組比較,#P<0.05

6.LEF1敲低對HK-2細胞凋亡的影響:Western blot法及流式細胞儀檢測各組細胞凋亡結果情況,結果顯示,Ctrl siRNA+TGF-β1組比Ctrl siRNA組發(fā)生了更多的凋亡,表現(xiàn)為cleaved PARP及cleaved caspase-3蛋白表達升高和細胞凋亡率的增加,且敲低LEF1可以抑制TGF-β1引起的凋亡(P<0.05),詳見圖6。

圖6 LEF1敲低可減少HK-2細胞的凋亡A.Western blot法檢測結果;B.流式細胞術檢測結果與Ctrl siRNA組比較,*P<0.05;與Ctrl siRNA+ TGF-β1組比較,#P<0.05

討 論

慢性腎臟病是導致全球死亡率的主要原因之一,已經嚴重威脅到了人類健康,目前尚沒有特異性的治療方案。腎間質纖維化是多種慢性腎臟病發(fā)展至終末期腎病的最終共同途徑,其治療和預防也是慢性腎臟病治療和預防的關鍵[8]。腎間質纖維化的發(fā)病機制比較復雜,涉及炎性反應、氧化應激、代謝紊亂、自噬、EMT等多種過程[9～11]。其中EMT是指上皮細胞向間充質細胞轉化的一系列過程,在此過程中不僅上皮極性遭到破壞,失去正常結構,而且極性紊亂的腎小管上皮細胞還可以分泌一些細胞因子誘導炎性反應及肌成纖維細胞激活,啟動并促進腎間質纖維化的發(fā)生、發(fā)展[12～14]。

LEF1是Wnt信號通路重要的轉錄因子之一,雖然已有共識指出Wnt信號通路在腎間質纖維化中發(fā)揮作用,但是既往研究主要集中于Wnt信號通路的上游分子,如Wnt和β-catenin,而關于LEF1在腎間質纖維化中的具體作用鮮有報道[15～18]。研究表明,LEF1在食管鱗癌、膀胱癌、前列腺癌等多種腫瘤中通過EMT促進腫瘤的進展[5,7,19,20]。本研究結果顯示,在小鼠UUO的腎間質纖維化模型中,LEF1表達上調,主要為核表達,且與梗阻時間呈正相關,表明LEF1參與了腎間質纖維化的進程。

腎間質纖維化的發(fā)生、發(fā)展涉及到多種機制,為了明確腎小管細胞表達的LEF1在腎間質纖維化中的具體作用及機制,本研究采用體外的細胞模型進行進一步研究。結果表明,敲低LEF1的表達確實可以減輕腎小管上皮細胞的纖維化反應,同時,上皮細胞標志物E-cadherin表達也相對升高,間充質細胞標志物Vimentin相對下降,EMT進程也被減緩。這表明LEF1能促進TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞發(fā)生EMT,這可能是其參與腎間質纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。而LEF1調控纖維化和EMT的具體分子機制是筆者團隊今后深入研究的重點。

綜上所述,LEF1在體內腎間質纖維化小鼠模型及體外TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞纖維化反應模型中均為高表達,其激活可以通過促進腎小管上皮細胞發(fā)生EMT而導致腎間質纖維化,降低其表達有可能延緩甚至逆轉腎間質纖維化,LEF1有望成為慢性腎病新的治療靶點。