張婭薇 吳肖婕 楊 蕊 樊 翠 周嘉迪 薛江楠

白細(xì)胞相關(guān)免疫球蛋白樣受體1(leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor-1,LAIR-1)又稱CD305,是屬于免疫球蛋白超家族(immunoglobulins superfamily,IgSF)的抑制性受體[1]。LAIR-1分子的胞質(zhì)區(qū)內(nèi)含有2個(gè)免疫受體酪氨酸抑制性基序(immuno-receptor tyrosine-based inhibitory motif, ITIM),可募集蛋白酪氨酸磷酸酶,通過(guò)催化酪氨酸的去磷酸化而抑制活化性信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[1～3]。研究表明,LAIR-1可抑制包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞等多種免疫效應(yīng)細(xì)胞的功能,在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[4～6]。LAIR-1分子不僅表達(dá)在多種免疫細(xì)胞上,還表達(dá)于CD34+造血干/祖細(xì)胞。筆者團(tuán)隊(duì)前期的研究發(fā)現(xiàn),人早期巨核譜系細(xì)胞也高表達(dá)LAIR-1分子,提示LAIR-1可能參與早期髓系造血細(xì)胞分化發(fā)育的調(diào)控[1,7]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),LAIR-1分子表達(dá)異常與包括急性髓樣白血病(acute myeloid leukaemia, AML)在內(nèi)的多種造血疾病相關(guān),但其致病機(jī)制尚不完全清楚[8,9]。目前對(duì)LAIR-1在造血細(xì)胞分化中的作用研究較少。粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)是調(diào)節(jié)髓系造血的關(guān)鍵細(xì)胞因子,酪氨酸蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信號(hào)通路是GM-CSF下游重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)功能[10,11]。本研究采用慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染GM-CSF依賴的人巨核白血病細(xì)胞Mo7e,建立高表達(dá)LAIR-1分子的Mo7e-LAIR-1細(xì)胞模型,觀察LAIR-1對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移能力的影響并探討其機(jī)制,為進(jìn)一步研究LAIR-1在髓系造血中的作用提供新的資料。

材料與方法

1.細(xì)胞系與主要試劑:GM-CSF購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司;RPMI-1640購(gòu)自美國(guó)HyClone公司;無(wú)支原體胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和青-鏈霉素購(gòu)自上海索萊寶科技有限公司;LV-LAIR-1慢病毒、感染增強(qiáng)劑(polybrene)和轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基(enhance infection solution,ENi.s)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司;Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;PE標(biāo)記小鼠抗人LAIR-1mAb購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司;HRP偶聯(lián)山羊抗小鼠及兔IgG抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔抗人JAK2、STAT1、STAT3、STAT5抗體和兔抗人磷酸化JAK2、STAT1、STAT3、STAT5抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;細(xì)胞裂解液及BCA試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;磷酸酶抑制劑和聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所;Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司;FITC Annexin Ⅴ試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司;人巨核白血病細(xì)胞系Mo7e細(xì)胞為中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室惠贈(zèng)。

2.Mo7e-LAIR-1細(xì)胞株的建立:使用含10% FBS、100U/ml青鏈霉素、4ng/ml GM-CSF的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mo7e細(xì)胞。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,193×g,離心5min,調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/毫升,以100微升/孔的密度接種于96孔板,培養(yǎng)24h。棄上清,每孔加入ENi.s10μl,5μg/ml polybrene 10μl以及1E+7TU/ml的LV-LAIR-1慢病毒懸液80μl,繼續(xù)培養(yǎng)48h。加入含4μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選。擴(kuò)增獲得的Mo7e-LAIR-1細(xì)胞經(jīng)工作濃度為5μg/ml的強(qiáng)力霉素(doxycycline,DOX)誘導(dǎo)表達(dá)LAIR-1,獲得Mo7e-LAIR-1+細(xì)胞,未經(jīng)DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞不表達(dá)LAIR-1,為Mo7e-LAIR-1-細(xì)胞。

3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LAIR-1在Mo7e細(xì)胞中的表達(dá):收集Mo7e-LAIR-1+和Mo7e-LAIR-1-細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/毫升,每管加入100μl細(xì)胞懸液,5μl小鼠抗人LAIR-1-PE熒光抗體,并設(shè)小鼠抗人IgG1同型抗體對(duì)照。4℃避光孵育30min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

4.激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy, LSCM)觀察LAIR-1在Mo7e細(xì)胞中的表達(dá):調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/毫升,使用4%多聚甲醛固定30min,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)洗滌后羊血清封閉30min。加入50μl小鼠抗人LAIR-1mAb孵育40min,PBS洗滌后加入50μl FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,避光孵育1h,PBS洗滌后LSCM觀察。

5.Western blot法檢測(cè)LAIR-1在Mo7e細(xì)胞中的表達(dá):收集并裂解Mo7e細(xì)胞,提取總蛋白,BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度。10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉,加入小鼠抗人LAIR-1mAb,同時(shí)設(shè)置甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)對(duì)照,4℃孵育過(guò)夜。HRP-山羊抗小鼠IgG孵育90min,TBST洗膜后使用ECL發(fā)光試劑顯影。

6.反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)LAIR-1在Mo7e細(xì)胞中的表達(dá):Trizol法抽提細(xì)胞總RNA,Roche反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)LAIR-1分子的上游引物:5′-ATTCTCCCCACCCAC-3′,下游引物:5′-GTGTCTGGCAACGGCTG-3′,按照反應(yīng)條件為95℃ 2min,95℃ 30s,62℃ 30s,72℃ 1min,30個(gè)循環(huán),72℃ 10min退火,4℃延伸。瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

7.CCK-8法檢測(cè)LAIR-1對(duì)Mo7e細(xì)胞增殖的影響:使用滅菌的PBS稀釋Ⅰ型膠原,同時(shí)使用pH值9.6的碳酸氫鹽緩沖液稀釋胎牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA),以5μg/cm2的濃度包被96孔板。設(shè)膠原組為實(shí)驗(yàn)組,BSA組為對(duì)照組。分別收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/毫升,以100微升/孔的密度接種于預(yù)先包被的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。采用CCK-8試劑盒分別于0、12、24、36、48、60h檢測(cè)細(xì)胞增殖。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔,獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

8. Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移:使用不含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)細(xì)胞24h,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/毫升,Transwell上室中加入200μl細(xì)胞懸液,預(yù)先包被好膠原或BSA的下室中加入500μl含15%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液。24h后取出小室,拍照并計(jì)數(shù)下室細(xì)胞。收集下室中的細(xì)胞,CCK-8法測(cè)其在450nm下的光密度(A)值。

9.FITC Annexin Ⅴ法檢測(cè)LAIR-1對(duì)Mo7e細(xì)胞凋亡的影響:收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,以1×105個(gè)/孔的密度接種于預(yù)先包被Ⅰ型膠原和BSA的24孔板中,每孔500μl。培養(yǎng)48h后,用100μl的1×Binding Buffer重懸,每管加入FITC Annexin Ⅴ和碘化丙啶(Propidium iodide,PI)各5μl,避光孵育15min,加入400μl 1×Binding Buffer,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

10.Western blot法檢測(cè)LAIR-1對(duì)JAK/STAT通路的影響:取Mo7e-LAIR-1+細(xì)胞和Mo7e-LAIR-1-細(xì)胞,以1×105個(gè)/孔的密度分別接種于預(yù)先包被膠原和BSA的6孔板中培養(yǎng)30min。收集各組細(xì)胞并裂解細(xì)胞,提取總蛋白并用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后分別加入兔抗人JAK2、STAT1、STAT3、STAT5以及兔抗人磷酸化的JAK2、STAT1、STAT3、STAT5抗體,同時(shí)設(shè)置GAPDH對(duì)照,4℃孵育過(guò)夜。HRP-山羊抗兔IgG二抗室溫孵育2h,ECL曝光顯影。采用Image J軟件量化目的蛋白表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.LAIR-1在Mo7e細(xì)胞中的表達(dá)鑒定:流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,未經(jīng)DOX誘導(dǎo)的Mo7e-LAIR-1-細(xì)胞中的LAIR-1表達(dá)率為0.01%,經(jīng)DOX誘導(dǎo)后,Mo7e-LAIR-1+細(xì)胞中的表達(dá)率為98.30%(圖1中A);LSCM觀察結(jié)果顯示,LAIR-1主要表達(dá)于細(xì)胞膜上(圖1中B);Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,與Mo7e-LAIR-1-細(xì)胞比較,Mo7e-LAIR-1+細(xì)胞高水平表達(dá)LAIR-1分子(P<0.001,圖1中C);RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,Mo7e-LAIR-1+細(xì)胞在mRNA水平高表達(dá)LAIR-1(P<0.001,圖1中D)。

圖1 Mo7e-LAIR-1細(xì)胞株的表達(dá)鑒定A.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LAIR-1的表達(dá);B. LSCM觀察LAIR-1在Mo7e-LAIR-1+細(xì)胞中的表達(dá)定位;C.Western blot法檢測(cè)LAIR-1的表達(dá);D.RT-PCR檢測(cè)LAIR-1的表達(dá)

2.LAIR-1對(duì)Mo7e細(xì)胞增殖的影響:CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示,在Mo7e-LAIR-1-細(xì)胞中,BSA對(duì)照組與膠原刺激組比較,細(xì)胞的增殖能力無(wú)明顯差異,在Mo7e-LAIR-1+細(xì)胞中,與BSA對(duì)照組比較,膠原刺激組細(xì)胞的增殖受到顯著抑制(P<0.001,圖2)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LAIR-1與膠原的特異性結(jié)合能夠?qū)o7e細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用。

圖2 LAIR-1對(duì)Mo7e細(xì)胞增殖的影響

3.LAIR-1對(duì)Mo7e細(xì)胞遷移能力的影響:Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在Mo7e-LAIR-1+細(xì)胞中,BSA對(duì)照組的遷移細(xì)胞總數(shù)為8900.0±799.9,而膠原刺激組的遷移細(xì)胞總數(shù)為12800.0±418.9,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3);而在Mo7e-LAIR-1-細(xì)胞中,BSA對(duì)照組的遷移細(xì)胞總數(shù)為7100.0±816.4,與膠原刺激組的遷移細(xì)胞總數(shù)(9100±1994)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LAIR-1與其配體膠原的相互作用可促進(jìn)細(xì)胞遷移。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LAIR-1對(duì)Mo7e細(xì)胞遷移的影響

4.LAIR-1對(duì)Mo7e細(xì)胞凋亡的影響:凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Mo7e-LAIR-1+細(xì)胞中BSA對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為48.00%±2.43%,而膠原刺激組為55.50%±2.81%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在Mo7e-LAIR-1-細(xì)胞中,BSA對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為17.37%±0.91%,而膠原刺激組為22.46%±0.68%,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,膠原刺激能夠促進(jìn)Mo7e細(xì)胞的凋亡。

圖4 LAIR-1對(duì)Mo7e細(xì)胞凋亡的影響A.LAIR-1對(duì)Mo7e細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果;B.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

5.GM-CSF對(duì)Mo7e細(xì)胞JAK/STAT信號(hào)通路的影響:Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,在Mo7e-LAIR-1+中,與無(wú)GM-CSF刺激細(xì)胞的對(duì)照組比較,GM-CSF刺激組細(xì)胞p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖5)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GM-CSF能夠上調(diào)Mo7e細(xì)胞JAK2、STAT1、STAT3、STAT5的酪氨酸磷酸化水平,從而激活JAK-STAT信號(hào)通路。

圖5 GM-CSF上調(diào)JAK2、STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化水平A.Western blot法檢測(cè)GM-CSF對(duì)p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5蛋白表達(dá)水平的影響;B.Western blot法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與+GM-CSF比較,*P<0.05

6.LAIR-1對(duì)GM-CSF介導(dǎo)的JAK-STAT信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用:Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,在Mo7e-LAIR-1-中,膠原刺激組和BSA對(duì)照組JAK2、STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化水平均無(wú)顯著改變;在Mo7e-LAIR-1+中,與BSA對(duì)照組比較,膠原刺激組細(xì)胞STAT1、STAT3和STAT5的磷酸化明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖6),而JAK2的磷酸化水平無(wú)明顯變化。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LAIR-1與其配體膠原特異性結(jié)合后,可能通過(guò)抑制JAK/STAT信號(hào)通路中信號(hào)分子STAT1、STAT3和STAT5的酪氨酸磷酸化而調(diào)節(jié)JAK2/STAT5信號(hào)通路活化。

圖6 LAIR-1降低STAT1、STAT3、STAT5的磷酸化水平A.Westerm blot法檢測(cè)LAIR-1對(duì)p-JAK2、p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5蛋白表達(dá)水平的影響;B.Western blot法檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。與BSA-MoTC-LAIR-1-比較,*P<0.05

討 論

造血干細(xì)胞在造血微環(huán)境中的分化發(fā)育受細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)等多種分子的復(fù)雜調(diào)控。其中負(fù)性調(diào)控因素對(duì)造血細(xì)胞的正常分化發(fā)育至關(guān)重要,負(fù)性調(diào)控分子的缺失或表達(dá)異常與造血系統(tǒng)疾病密切相關(guān)[12～14]。LAIR-1是屬于IgSF家族的抑制性受體,其胞質(zhì)區(qū)的2個(gè)ITIM基序中的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化后,可募集蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1(SH1domain-containing tyrosine phosphatases-1)以及SHP-2 (SH2domain-containing tyrosine phosphatases-2)等,通過(guò)催化蛋白酪氨酸的去磷酸化而抑制活化性信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo),進(jìn)而抑制多種免疫細(xì)胞的功能[13]。LAIR-1也表達(dá)于CD34+造血干/祖細(xì)胞上,而且其配體膠原分子廣泛存在于造血微環(huán)境中,提示LAIR-1與膠原分子的相互作用可能是調(diào)控造血細(xì)胞增殖分化的一個(gè)重要因素[15,16]。目前有關(guān)LAIR-1分子的研究主要集中在其對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用方面,而對(duì)其在髓系造血調(diào)節(jié)中的作用及其機(jī)制的研究相對(duì)較少。

本研究結(jié)果顯示,LAIR-1與其配體結(jié)合后能明顯抑制GM-CSF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖,提示LAIR-1可能通過(guò)對(duì)造血細(xì)胞因子GM-CSF功能的影響,參與對(duì)髓系造血細(xì)胞的增殖分化的調(diào)節(jié)。GM-CSF是調(diào)節(jié)髓系造血的關(guān)鍵細(xì)胞因子,能夠刺激骨髓前體細(xì)胞增殖成熟,參與調(diào)節(jié)不同譜系髓樣細(xì)胞的增殖分化。GM-CSF與其受體GM-CSFR高親和力結(jié)合后,可導(dǎo)致與受體β亞基胞質(zhì)區(qū)結(jié)合的酪氨酸激酶JAK2被激活,催化下游信號(hào)分子的酪氨酸殘基磷酸化,啟動(dòng)JAK/STAT、PI3K和MAPK等信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。JAK/STAT信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)髓系造血細(xì)胞存活、增殖及分化等生物學(xué)功能。

本研究結(jié)果顯示,LAIR-1與其配體結(jié)合后能夠抑制STAT1蛋白分子第701位、STAT3蛋白分子第705位以及STAT5蛋白分子第694位的酪氨酸殘基的磷酸化水平,但對(duì)JAK2的第1007位和第1008位的酪氨酸磷酸化水平無(wú)顯著影響。上述結(jié)果提示,LAIR-1可能通過(guò)其胞質(zhì)區(qū)的ITIM基序募集蛋白酪氨酸磷酸酶,直接催化JAK/STAT信號(hào)通路下游STAT1、STAT3和STAT5分子酪氨酸殘基的去磷酸化,進(jìn)而發(fā)揮對(duì)GM-CSF信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。功能性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,LAIR-1分子的表達(dá)可以促進(jìn)Mo7e細(xì)胞的遷移,提示LAIR-1作為黏附分子可能參與調(diào)節(jié)造血細(xì)胞在造血微環(huán)境中的定向遷移。凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Mo7e-LAIR-1+細(xì)胞經(jīng)膠原刺激能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡,但在Mo7e-LAIR-1-細(xì)胞中,膠原刺激組的細(xì)胞凋亡率亦高于對(duì)照組。由于髓系造血細(xì)胞上存在除LAIR-1以外的其他膠原受體[17]。因此,本研究結(jié)果不能確定LAIR-1和膠原的特異性結(jié)合能夠促進(jìn)Mo7e細(xì)胞的凋亡。

綜上所述,抑制性受體LAIR-1可能作為一種負(fù)調(diào)控分子,通過(guò)抑制GM-CSF信號(hào)通路的活化而參與對(duì)造血細(xì)胞增殖分化的精細(xì)調(diào)控。研究結(jié)果為深入探討髓系造血調(diào)控機(jī)制提供了新的材料,也為信號(hào)通路異常活化而導(dǎo)致的造血疾病的診斷和治療研究提供了新的思路。