袁錦鑫 杜 鍇 袁 洋 李洪飛

宮頸癌是原發(fā)于子宮頸部位的惡性腫瘤,是女性生殖道最常見的婦科惡性腫瘤,且多發(fā)于50～55歲女性[1]。在宮頸癌早期及時進(jìn)行宮頸癌根治手術(shù)治療,治愈率可達(dá)到80%以上,但單一的宮頸癌根治術(shù)仍可能出現(xiàn)宮頸癌復(fù)發(fā)情況[2]。宮頸癌根治術(shù)的范圍包括廣泛子宮切除術(shù)與淋巴結(jié)切除術(shù),既往對宮頸癌的臨床分期未考慮患者淋巴結(jié)狀態(tài),隨著臨床對宮頸癌的不斷深入探究,研究發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與宮頸癌患者預(yù)后密切相關(guān)[3]。相關(guān)研究[4]報(bào)道,腹主動脈旁淋巴結(jié)(para-aortic lymph node,PALN)受累患者的預(yù)后生存質(zhì)量顯著低于淋巴結(jié)陰性者。因此早期檢出宮頸癌患者腹主動脈淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,提高宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測效能,及時進(jìn)行預(yù)防,對改善患者術(shù)后生存質(zhì)量具有重要意義。宮頸癌在絕大多數(shù)情況下是由人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染引起的,并且可以在腫瘤中發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤病毒DNA序列,循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor,ctDNA)是在血液或腫瘤組織中存在的少部分腫瘤細(xì)胞壞死分泌的DNA片段,可用作腫瘤病情的評估;國內(nèi)外研究[5-6]報(bào)道,宮頸癌患者的血漿ctDNA與宮頸癌病情進(jìn)展存在一定的相關(guān)性。本研究將HPV ctDNA作為研究指標(biāo),探索其與宮頸癌患者PALN受累和術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2019年5月我院收治的宮頸癌患者102例,年齡32～66歲,平均(48.45±7.49)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①臨床體征和影像學(xué)檢查均符合宮頸癌相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7],并經(jīng)病理檢查確診是否存在PALN受累;②入組前均未接受癌癥相關(guān)治療;③均行宮頸癌根治術(shù),其中PALN受累患者同時行腹主動脈旁淋巴結(jié)切除術(shù);術(shù)后接受放、化療等輔助治療;④患者及其家屬愿意配合本研究,并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①存在其他心腦、肝腎等全身重要器官損傷;②存在其他惡性腫瘤;③中途退出本研究或失訪。本研究符合《赫爾辛基宣言》相關(guān)倫理準(zhǔn)則。

1.2 臨床資料收集

根據(jù)本研究目的,設(shè)計(jì)調(diào)查問卷由醫(yī)院專業(yè)人員收集患者年齡、BMI、病理類型、臨床分期、分化程度、腫瘤直徑、肌層浸潤深度、PALN受累等一般資料。

1.3 HPV ctDNA表達(dá)水平檢測

血漿樣本:抽取宮頸癌患者外周靜脈血10 mL于EDTA抗凝試管中,搖晃使血液充分混勻,離心處理分離后,保存血漿于-80 ℃冰箱中待提取ctDNA。腫瘤組織樣本:取10～20 mg腫瘤組織加入到600 μL冷凍細(xì)胞裂解液中,65 ℃孵育15～30 min;使用HiPure游離DNA抽提試劑盒(廣州美基生物科技有限公司)從血漿離心管或腫瘤組織水化液中提取ctDNA,超聲打斷至300 bp大小;使用核酸定量分析試劑盒(蘇州瑞諾德生物科技有限公司)檢測游離DNA的濃度,然后使用High sensitivity DNA Rragents 試劑盒(美國安捷倫科技有限公司)和High sensitivity DNA chips 試劑盒(美國安捷倫科技有限公司)進(jìn)行片段分析;使用NEBNext?UltraTMII DNA 文庫制備試劑盒(美國Illumina公司)進(jìn)行DNA文庫構(gòu)建,對文庫進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增;應(yīng)用HiSeq X10 平臺(美國Illumina公司)上機(jī)測序,應(yīng)用 Control-FREEC(version 10.3)對 BAM 文件進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析,window 選取50 kb,并使用 GC 矯正以及健康人群參照隊(duì)列矯正。計(jì)算每條染色體臂所有 window 的平均值得到該條染色體臂的 cov值;ctDNA百分含量=(染色體長臂cov值-染色體短臂cov值)/其中較小者。結(jié)果判定:設(shè)定以ctDNA 百分含量<0.1%為陰性標(biāo)準(zhǔn),>0.1%為陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 隨訪

出院后定期通過電話或門診對所有患者進(jìn)行隨訪,隨訪截止時間至2022年5月31日或患者術(shù)后復(fù)發(fā),隨訪時間范圍為12個月～36個月,記錄患者術(shù)后復(fù)發(fā)(發(fā)現(xiàn)新發(fā)病灶或出現(xiàn)明顯自覺癥狀)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同臨床病理參數(shù)宮頸癌患者的血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)水平

宮頸癌患者血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)水平與年齡、是否絕經(jīng)、病理類型、腫瘤直徑無顯著相關(guān)性(P>0.05),與PALN受累、臨床分期、分化程度、肌層浸潤深度存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。見表1。

2.2 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組的臨床病理參數(shù)比較

復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組患者在年齡、是否絕經(jīng)、病理類型、腫瘤直徑方面比較無明顯差異(P>0.05),在PALN受累、臨床分期、分化程度、肌層浸潤深度、血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)水平比較存在顯著差異(P<0.05)。見表2。

2.3 血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)對宮頸癌患者PALN的診斷價值

根據(jù)ROC曲線分析可知,血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)診斷宮頸癌患者PALN受累的AUC分別為0.841、0.823(P<0.05),兩種檢測方式AUC比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=0.495,P=0.621)。見圖1、表3。

圖1 血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)診斷宮頸癌患者PALN受累的ROC曲線

表3 血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)對宮頸癌患者PALN受累的診斷價值

2.4 血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)對宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值

根據(jù)ROC曲線分析可知,血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)預(yù)測宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC分別為0.759、0.735(P<0.05),兩種檢測方式AUC比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=0.821,P=0.412)。見圖2、表4。

圖2 血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)預(yù)測宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的ROC曲線

表4 血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)對宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值

3 討論

世界衛(wèi)生組織2018年最新發(fā)布數(shù)據(jù)顯示,全球?qū)m頸癌發(fā)病率為13/10萬,2018年全球新發(fā)人數(shù)約為56.9萬例,死亡約31.1萬例[8]。宮頸癌預(yù)后與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān),PALN轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是宮頸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,一旦發(fā)生PALN轉(zhuǎn)移,患者預(yù)后生存質(zhì)量顯著下降[9]。多項(xiàng)臨床研究[10-11]表明,宮頸癌早期手術(shù)治療后會復(fù)發(fā),且復(fù)發(fā)后患者死亡風(fēng)險(xiǎn)極高。因此,若能早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療,可以有較好的根治及預(yù)后效果。HPV是引起宮頸癌的主要原因,癌組織中的HPV DNA陽性可認(rèn)為是宮頸癌的特征性表現(xiàn)[12]。

ctDNA是人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的攜帶一定特征(包括突變,缺少,插入,重排,拷貝數(shù)異常,甲基化等)來自腫瘤基因的DNA片段,主要來源于壞死或凋亡的腫瘤細(xì)胞[13]。既往研究[14]報(bào)道,由HPV病毒引起的腫瘤,通過病毒基因組可以區(qū)分ctDNA和正常細(xì)胞來源的cfDNA,因此,可以通過對患者血漿和癌組織中HPV ctDNA檢測來了解患者的腫瘤負(fù)荷情況。Jeannot等[15]的研究發(fā)現(xiàn),血漿中HPV ctDNA和PALN受累顯著相關(guān);K?hler等[16]的研究發(fā)現(xiàn),HPV DNA與宮頸癌患者主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌患者血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)水平與PALN受累顯著相關(guān),存在PALN受累的宮頸癌患者血漿和腫瘤組織HPV ctDNA陽性表達(dá)較高。與上述報(bào)道相似,提示HPV ctDNA表達(dá)與宮頸癌患者PALN受累存在關(guān)聯(lián)。同時本研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌患者血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)水平與臨床分期、分化程度、肌層浸潤深度存在顯著相關(guān)性,進(jìn)一步提示HPV ctDNA表達(dá)水平可能與宮頸癌的病情發(fā)展有一定的相關(guān)性,但本研究納入樣本數(shù)量較少,可能存在數(shù)據(jù)的偏倚,后期仍需進(jìn)一步采用多中心、大樣本臨床研究深入分析。

既往研究[17]報(bào)道,ctDNA表達(dá)可作為多種癌癥術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志,如在Ⅱ/Ⅲ期結(jié)直腸癌患者中,術(shù)后連續(xù)ctDNA檢測可預(yù)測較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn),并先于影像學(xué)診斷疾病復(fù)發(fā);ctDNA檢測的分子殘留病灶可以識別出復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高的患者,并可以促進(jìn)輔助治療背景下新治療的強(qiáng)化研究,以提高生存率。本次研究發(fā)現(xiàn),復(fù)發(fā)組宮頸癌患者血漿和腫瘤組織HPV ctDNA陽性表達(dá)率顯著高于未復(fù)發(fā)組,本研究結(jié)果結(jié)合上述報(bào)道,提示血漿和腫瘤組織HPV ctDNA表達(dá)水平與宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)存在關(guān)聯(lián)。同時本研究發(fā)現(xiàn),復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組宮頸癌患者在PALN受累、臨床分期、分化程度、肌層浸潤深度方面存在顯著差異,與雷雅潔等[18]的報(bào)道基本一致,提示PALN受累可能會增加宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。

本研究還發(fā)現(xiàn),血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)診斷宮頸癌患者PALN轉(zhuǎn)移的AUC分別為0.841、0.823,預(yù)測宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC分別為0.759、0.735,檢測方式AUC比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示臨床可選擇HPV ctDNA表達(dá)作為宮頸癌患者PALN診斷和術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測指標(biāo),選取患者血漿還是癌組織樣本根據(jù)實(shí)際采集難易度進(jìn)行決定。

綜上所述,血漿和癌組織HPV ctDNA表達(dá)水平與宮頸癌患者PALN受累、術(shù)后復(fù)發(fā)存在顯著相關(guān)性,HPV ctDNA表達(dá)水平較高的患者更易發(fā)生PALN受累和術(shù)后復(fù)發(fā)。但本研究仍存在部分不足,如樣本數(shù)量較少、單中心研究,可能對數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性存在偏倚,且未明確HPV ctDNA預(yù)測宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的作用機(jī)制,后期仍需進(jìn)一步采用多中心、大樣本臨床試驗(yàn)深入分析HPV ctDNA對宮頸癌患者病情發(fā)展的影響,并進(jìn)行動物試驗(yàn)分析HPV ctDNA不同表達(dá)水平對宮頸癌患者預(yù)后的影響。