劉俊華 李廣明 李 琤

肝癌(HCC)是臨床上常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。HCC的早期病癥隱秘,病情發(fā)展迅速,且復(fù)發(fā)率高,5年復(fù)發(fā)率高達(dá)70%[1]。所以對(duì)于HCC患者的早期診斷和預(yù)后分析至關(guān)重要[2]。目前主要采用影像學(xué)和病理特征作為臨床評(píng)判指標(biāo),需要醫(yī)師進(jìn)行一定程度的主觀判斷,使得HCC的早期診斷及預(yù)后分析的準(zhǔn)確度較差,導(dǎo)致HCC患者病情的延誤[3]。近年隨著腫瘤與分子生物學(xué)相關(guān)性研究的深入,發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)作為內(nèi)源小分子RNA,具有調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能,與腫瘤細(xì)胞的生成與進(jìn)展過程緊密相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn),HCC細(xì)胞存在多種miRNA的異常表達(dá)[5]。綜上,本次選取血清miR-126、miR-155及miR-18b的聯(lián)合檢測(cè),分析其對(duì)HCC早期診斷及預(yù)后評(píng)估中的價(jià)值,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年1月至2021年1月收治的HCC患者120例作為研究對(duì)象。男性83例,女性37例;年齡30～75歲,平均年齡(53.03±9.93)歲;腫瘤直徑<5 cm 57例,腫瘤直徑≥5 cm 63例;TNM分期:Ⅰ期38例,Ⅱ期46例,Ⅲ期34例,Ⅳ期2例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例,淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移52例。符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2017年版)》[6]。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)上腹CT或MRI檢查及臨床診斷,確診為HCC;②年齡≥18歲;③預(yù)計(jì)生存時(shí)間≥3個(gè)月;④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①患有其他惡性腫瘤者;②接受過化療、放療等治療者;③其他臟器如心、肝、腎功能障礙者;④無法配合治療及隨訪者。選取同期肝臟良性病變患者120例作為對(duì)照組,排除腎臟功能異常者。對(duì)照組男性92例,女性28例;年齡32～70歲,平均年齡(54.28±8.02)歲。兩組患者性別、年齡等一般資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 通過病歷、檢查結(jié)果收集HCC患者臨床資料,包括年齡、性別、TNM分期、腫瘤直徑等。

1.2.2 檢驗(yàn)方法 分別采集HCC組和對(duì)照組患者空腹靜脈血,以Trizol法取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒來自日本Takara公司;采用熒光定量PCR法檢測(cè)血清miR-126、miR-155、miR-18b水平,2-△△CT值表示相對(duì)表達(dá)量,miRNAs定量試劑盒來自蘇州吉瑪公司。比較兩組患者血清miR-126、miR-155、miR-18b水平。對(duì)HCC組患者應(yīng)用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)評(píng)估各指標(biāo)診斷HCC嚴(yán)重程度的效能。

1.2.3 病情控制與復(fù)發(fā)診斷標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)肝癌的改良實(shí)體瘤反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(mRECIST)[7]。復(fù)查上腹增強(qiáng)CT或MRI,查看動(dòng)脈期強(qiáng)化顯影的目標(biāo)病灶情況,病灶直徑總和增加<20%或減少乃至完全消失視為病情控制;病灶直徑總和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶視為病情復(fù)發(fā)。隨訪方式采用門診復(fù)查及電話詢問,隨訪時(shí)長(zhǎng)18個(gè)月,術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月各復(fù)查1次,之后每隔6個(gè)月復(fù)查一次,將腫瘤復(fù)發(fā)或患者死亡視為預(yù)后不良,其余視為預(yù)后良好。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-126、miR-155、miR-18b指標(biāo)對(duì)比

HCC組miR-126指標(biāo)水平低于對(duì)照組(P<0.05),HCC組miR-155、miR-18b指標(biāo)水平高于對(duì)照組(P<0.05),見表1。

表1 兩組血清miR-126、miR-155、miR-18b水平對(duì)比

2.2 ROC曲線分析對(duì)HCC的診斷價(jià)值

血清miR-126、miR-155、miR-18b對(duì)HCC患者早期診斷的聯(lián)合測(cè)定AUC(0.920)高于miR-126、miR-155及miR-18b單獨(dú)測(cè)定的AUC(0.780、0.869、0.741)(P<0.05),見表2和圖1。

圖1 血清miR-126、miR-155、miR-18b對(duì)于HCC的診斷ROC曲線

表2 血清miR-126、miR-155、miR-18b對(duì)于HCC的診斷價(jià)值分析

2.3 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組血清指標(biāo)比較

預(yù)后良好組miR-126指標(biāo)水平高于預(yù)后不良組(P<0.05),預(yù)后良好組miR-155、miR-18b指標(biāo)水平低于預(yù)后不良組(P<0.05),見表3。

表3 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組患者血清指標(biāo)比較

2.4 ROC曲線分析對(duì)HCC的預(yù)后評(píng)估價(jià)值

血清miR-126、miR-155、miR-18b對(duì)HCC患者的預(yù)后評(píng)估的聯(lián)合測(cè)定AUC(0.854)高于miR-126、miR-155及miR-18b單獨(dú)測(cè)定的AUC(0.754、0.746、0.676)(P<0.05)。見表4,圖2。

圖2 血清miR-126、miR-155、miR-18b對(duì)HCC預(yù)后評(píng)估的ROC曲線

表4 血清miR-126、miR-155、miR-18b對(duì)HCC的預(yù)后評(píng)估價(jià)值分析

2.5 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組患者臨床資料對(duì)比

預(yù)后良好組和預(yù)后不良組患者的臨床資料對(duì)比分析,年齡、腫瘤直徑、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血清miR-126、miR-155、miR-18b水平是HCC患者預(yù)后復(fù)發(fā)的影響因素(P<0.05),見表5。

表5 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組患者臨床資料比較/例

2.6 影響HCC患者預(yù)后的logistic回歸分析

對(duì)表5具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素進(jìn)行變量賦值,預(yù)后良好組=0,預(yù)后不良組=1;年齡:(<50歲=0,≥50歲=1);腫瘤直徑:(<5 cm=0,≥5 cm=1);TNM分期:(Ⅰ～Ⅱ期=0,Ⅲ～Ⅳ期=1);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:(未轉(zhuǎn)移=0,轉(zhuǎn)移=1);miR-126:(<431=0,≥0.431=1);miR-155:(<0.402=0,≥0.402=1);miR-18b:(<0.344=0,≥0.344=1)。采用二元Logistic分析,年齡≥50歲(OR=3.219,P=0.000)、腫瘤直徑≥5 cm(OR=50.907,P=0.000)、TNM為Ⅲ-Ⅳ分期(OR=9.545,P=0.007)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OR=6.172,P=0.001)、miR-155≥0.402(OR=29.371,P=0.000)、miR-18b≥0.344(OR=4.609,P=0.016),均為影響HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,miR-126≥0.431(OR=0.010,P=0.000)為影響HCC患者預(yù)后的有利因素。見表6。

表6 影響HCC患者預(yù)后的多因素分析

3 討論

近年來,隨著對(duì)分子生物學(xué)領(lǐng)域的深入研究,發(fā)現(xiàn)miRNA和靶基因之間存在復(fù)雜的網(wǎng)狀調(diào)節(jié)機(jī)制,參與了細(xì)胞的增殖、分化及調(diào)亡過程,引起機(jī)體的生理及病理變化,與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[8]。同時(shí)血清中的miRNAs可抵抗RNA酶的降解,在人體血液中水平穩(wěn)定,采用一般的總RNA提取法就可以獲取足夠的miRNA樣品,滿足臨床檢測(cè)要求,操作方式簡(jiǎn)便,不具有侵入性,是腫瘤早期檢測(cè)的理想標(biāo)志物[9]。越來越多研究發(fā)現(xiàn),HCC患者血液中多種miRNA存在異常表達(dá),說明miRNA在肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、凋亡等過程中起到密切的調(diào)節(jié)作用,但其作用機(jī)制尚不明確[10]。本次研究,分別檢測(cè)HCC組和對(duì)照組的血清miR-126、miR-155、miR-18b水平,結(jié)果顯示,HCC組miR-126指標(biāo)水平低于對(duì)照組(P<0.05),HCC組miR-155、miR-18b指標(biāo)水平高于對(duì)照組(P<0.05),以ROC曲線進(jìn)行分析,三者的聯(lián)合檢測(cè)的AUC可達(dá)到0.92,均高于miR-126、miR-155及miR-18b的單獨(dú)測(cè)定(P<0.05)。說明血清miR-126、miR-155、miR-18b三者的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于HCC的早期診斷具有較高的準(zhǔn)確性。

miR-126是一種血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性高表達(dá)miRNA,位于人染色體9q34.3,處于表皮生長(zhǎng)因子域7(EGFL-7)的第7與第8外顯子間的內(nèi)含子區(qū)域,可能與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的分泌有關(guān)[11]。王瑞等[12]研究發(fā)現(xiàn),在降低體內(nèi)miR-126表達(dá)水平后,VEGF的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯上升。眾多研究表明,miR-126在多種腫瘤組織中均存在表達(dá)水平下降,并且起到抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。李平等[13]研究表明,miR-126表達(dá)水平上升可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖;在干擾miR-126表達(dá)后,細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng),形成腫瘤的幾率提高。在本次研究中,HCC組的miR-126水平低于對(duì)照組(P<0.05),且預(yù)后良好組的miR-126水平高于預(yù)后不良組(P<0.05),說明miR-126是起到抑癌作用,與上述研究相同。

miR-155位于人染色體21q21,處于B細(xì)胞整合簇(BIC)基因第3個(gè)外顯子的區(qū)域,參與細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、炎癥的生理過程,同時(shí)調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)和造血細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn),miR-155在胃癌早期能通過促進(jìn)蛋白SMAD2,起到抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移,但到了晚期卻會(huì)引起腫瘤穿透漿膜,引起淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移,同時(shí)胰腺癌細(xì)胞的侵襲遷移也與miR-155的表達(dá)呈正相關(guān)[14]。說明,miR-155在腫瘤的不同時(shí)期及不同腫瘤之間的作用機(jī)制并不相同。本次研究中,HCC組的miR-155水平高于對(duì)照組(P<0.05),且預(yù)后良好組的miR-155水平低于預(yù)后不良組(P<0.05),說明miR-155高水平表達(dá)能促進(jìn)HCC腫瘤的發(fā)展,可作為HCC的診斷和預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。也有研究顯示,丙型肝炎病毒(HCV)患者體內(nèi)的miR-155表達(dá)上調(diào),HCV通過miR-155激活Wnt信號(hào)抑制肝細(xì)胞調(diào)亡,促進(jìn)肝細(xì)胞增殖,形成腫瘤[15]。本次研究結(jié)果與其一致。

目前miR-18b與HCC的相關(guān)研究較少,在焦文鵬等[16]的研究中提到,miR-18b-5p可靶向調(diào)節(jié)B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因3(BTG3)促進(jìn)HCC細(xì)胞的侵襲遷移,而miR-18b-5p作為莖環(huán)序列miR-18b的成熟體,與其呈正相關(guān)。本次研究中,HCC組的miR-18b水平高于對(duì)照組(P<0.05),且預(yù)后良好組的miR-18b水平低于預(yù)后不良組(P<0.05),說明miR-18b促進(jìn)HCC腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移,與上述研究類似。

HCC術(shù)后療效受到多重因素影響。在樂琪等[17]對(duì)HCC患者術(shù)后療效的研究中發(fā)現(xiàn),門脈癌栓,腫瘤數(shù)目,最大直徑,腫瘤分化程度等可能是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。本次研究結(jié)果表明年齡、腫瘤直徑、TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移是HCC患者預(yù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。除上述傳統(tǒng)因素外,血清中的miR-126、miR-155、miR-18b也是HCC復(fù)發(fā)的影響因素,其中miR-126為有利因素,miR-155、miR-18b為危險(xiǎn)因素,對(duì)預(yù)后具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值?？赡茉蚴莔iR-126抑制VEGF分泌,阻止了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,對(duì)HCC預(yù)后起到了積極作用,而miR-155、miR-18b均參與了細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)和代謝過程,對(duì)于腫瘤細(xì)胞增殖起到了促進(jìn)作用,從而導(dǎo)致腫瘤的侵襲遷移。此外,在對(duì)預(yù)后良好組和預(yù)后不良組血清指標(biāo)進(jìn)行ROC曲線分析后,三者的聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.854,且高于miR-126、miR-155及miR-18b的單獨(dú)測(cè)定(P<0.05)。說明血清miR-126、miR-155、miR-18b三者的聯(lián)合檢測(cè)可作為HCC患者的預(yù)后評(píng)估的重要指標(biāo)。

綜上,血清miR-126、miR-155及miR-18b在HCC患者體內(nèi)均存在異常表達(dá),三者在HCC的早期診斷和預(yù)后評(píng)估的聯(lián)合檢測(cè)AUC分別為0.920和0.854,均具有診斷及預(yù)后評(píng)估價(jià)值。