莫明子 韓曉群 鄭 智 饒 軍

結(jié)直腸癌是惡性程度非常高的腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率有明顯增高的趨勢。全球每年約有120萬的新發(fā)病例,約有50萬人死于結(jié)直腸癌,已成為第三大類癌癥死因[1]。目前,結(jié)腸鏡檢查及腹部 CT 等方法被廣泛應用于結(jié)腸癌的診斷,然而,大多數(shù)患者由于確診時已處于腫瘤晚期而錯過了最佳的治療機會,如果能夠找到一些特定的關(guān)鍵分子以及有效的治療靶點,那么這將有助于對結(jié)腸癌的早期診斷、預后判斷、新藥開發(fā)和臨床治療[2]。

三結(jié)構(gòu)域(tripartitemotif,TRIM)家族蛋白可調(diào)控腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和自噬等多種生物學行為,介導多個分子調(diào)控機制,如p53信號通路、NF-κB信號通路、泛素化以及染色體異位和轉(zhuǎn)錄等[3]。TRIM26基因定位于6號染色體上的一個主要區(qū)域,此區(qū)域稱為主要組織相容性復合體(MHC),該基因表達出的蛋白質(zhì)主要存在于細胞質(zhì)中[4]。有關(guān)研究表明,具有E3泛素化連接酶活性的TRIM26結(jié)構(gòu)為包含RING結(jié)構(gòu)域、Box1、Box2和螺旋卷曲結(jié)構(gòu)的RBCC結(jié)構(gòu)[5]。本研究對結(jié)腸癌組織中 TRIM26蛋白的表達進行檢測,觀察結(jié)腸癌組織中TRIM26蛋白的表達情況及其與患者臨床病理特征之間的相關(guān)性,以期為結(jié)腸癌的早期診斷、治療和預后評估提供一個新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

從上海芯超生物科技有限公司的組織樣本庫中選取了99例結(jié)腸癌患者樣本,其中女性患者43例,男性患者55例,1例缺失;年齡<70歲的患者43例,年齡≥70歲的患者50例,6例缺失;病理分級Ⅱ級的患者69例,病理分級Ⅲ級的患者30例;T分期中Ⅰ～Ⅲ期的患者82例,Ⅳ期的患者13例,4例缺失;N分期中無區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0期)患者61例,N1～N2期患者37例,1例缺失;TNM 分期中Ⅰ～Ⅱ期患者61例,Ⅲ～Ⅳ期患者37例,1例缺失。所有病例均經(jīng)病理確診為結(jié)腸癌且未接受任何的術(shù)前治療。手術(shù)時間為2006年7月至2007年5月,最終隨訪時間均為2015年7月。99例患者均包含癌組織,其中有73例還包含與癌組織相匹配的距離癌1.5 cm的癌旁組織。

1.2 制作組織芯片

組織芯片的制作由上海芯超生物科技有限公司來進行。常規(guī)的病理切片后,所有供體組織蠟塊進行HE染色,由病理學專家對其進行第二次診斷后標記HE切片上的典型病理區(qū)。使用組織芯片制作儀(BeecherInstruments.Inc)在受體蠟塊(空白蠟塊)上進行有序的打孔(孔的直徑為1.5 mm),在供體組織蠟塊上的相應位置-HE切片上的標記部位獲取目標組織芯,放入受體蠟塊陣列孔中,重復上述步驟,完成1個結(jié)腸癌組織和癌旁組織相匹配的180點陣列塊(HCol-Ade180Sur-06)的制作。使用切片機(Leica,德國)連續(xù)切割成4～5 μm厚的切片,用防脫片處理進口載玻片,然后將切片放置在進口載玻片上,完成組織芯片的制作。

1.3 免疫組織化學實驗

免疫組織化學實驗采用EnVision二步法。在光學顯微鏡下隨機觀察3個高倍鏡視野,計≥3×102個細胞中的陽性細胞數(shù),然后計算陽性細胞數(shù)占全部細胞數(shù)的染色陽性率。染色陽性率評分分為四個等級:0分(陰性),1分(1～25%),2分(26%～50%),3分(51%～75%),4分(76%～100%)。染色強度評分分為四個等級:無陽性著色(陰性)計0分,弱陽性(+)計1分,陽性(++)計2分,強陽性(+++)計3分。總評分為“染色強度評分”與“染色陽性率評分”之積,并據(jù)此來進行分組,總評分<12分的是TRIM26低表達組,總評分≥12分的是TRIM26高表達組。

1.4 統(tǒng)計分析

采用χ2檢驗分析TRIM26在結(jié)腸癌與癌旁組織中的表達情況、TRIM26表達與結(jié)腸癌患者臨床指標之間的相關(guān)性,P值<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。TRIM26的表達與結(jié)腸癌預后的相關(guān)性分析:生存期單因素分析采用Kaplan-Meier生存分析法和log-rank統(tǒng)計檢驗;在單因素分析中得到有統(tǒng)計學意義的變量,將這些變量納入COX多因素生存回歸分析,P值<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌和癌旁組織中TRIM26的表達分析

免疫組織化學的實驗結(jié)果表明:TRIM26在結(jié)腸癌和癌旁組織的細胞質(zhì)中表達,其表達定位與抗體說明書一致?？ǚ綑z驗分析顯示:TRIM26在結(jié)腸癌中的表達顯著高于癌旁組織(P<0.001)。分析結(jié)果見表1和圖1。

***為兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

表1 TRIM26在結(jié)腸癌及癌旁組織中的表達比較/例

2.2 TRIM26的表達與結(jié)腸癌患者臨床指標相關(guān)性

卡方檢驗分析顯示:TRIM26的表達與病理分級、N分期、TNM分期、PDL1密切相關(guān)(P<0.05)。TRIM26的表達與年齡、性別、T分期、MLH1、MSH6、MSH2、PMS2無明顯統(tǒng)計學關(guān)系(P>0.05),見表2。

表2 TRIM26表達與結(jié)腸癌患者臨床指標相關(guān)性/例

2.3 TRIM26的表達與結(jié)腸癌預后的相關(guān)性

結(jié)腸癌患者的隨訪情況如下:死于結(jié)腸癌的有59例患者,中位隨訪時間為28個月(1～87個月);仍存活的有40例患者,其中位隨訪時間為101.5個月(98～108個月)。生存期單因素分析顯示:癌組織TRIM26表達低的結(jié)腸癌患者相對于癌組織TRIM26表達高的結(jié)腸癌患者擁有更長的總生存期(P=0.0141),其5年生存率明顯高于TRIM26表達高的結(jié)腸癌患者[59.5%(25/42)vs 40.4%(23/57)]。具體分析結(jié)果見圖2。

圖2 TRIM26的表達與結(jié)腸癌患者預后的相關(guān)性

2.4 結(jié)腸癌預后的獨立相關(guān)因素分析

將單因素分析中有統(tǒng)計學意義的變量納入COX多因素生存回歸分析,分析結(jié)果顯示:TRIM26的表達不是結(jié)腸癌預后的獨立預測因素,而患者年齡、病理分級、T分期、N分期、PDL1可作為結(jié)腸癌預后的獨立預測因素(P<0.05),見表3。

表3 影響結(jié)腸癌患者預后的因素分析

3 討論

TRIM26作為TRIM超家族成員之一,可以作為抑癌基因或者癌基因影響腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲遷移等多個生物學過程[6-8]。如TRIM26在肝細胞癌(HCC)組織中的表達與正常組織相比明顯下調(diào),TRIM26沉默可促進肝癌細胞的增值、遷移和侵襲能力[9]。TRIM26限制了肺癌的生長,過表達TRIM26可通過下調(diào)BCL-2抑制細胞生長并誘導細胞凋亡[10]。沉默TRIM26表達可阻礙乳腺癌MCF-7細胞增殖、侵襲與遷移能力,并誘導細胞凋亡[11]。與正常組織相比,TRIM26在膠質(zhì)瘤組織中的表達顯著增高,TRIM26的表達與膠質(zhì)瘤細胞U87及U251的增殖呈正相關(guān)[12]。盡管如此,TRIM26與結(jié)直腸癌的相關(guān)性研究則未有報道。

本研究選取了99個帶有隨訪信息的結(jié)腸癌病例,基于免疫組織化學技術(shù)和統(tǒng)計學分析,以探討TRIM26的表達與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后之間相關(guān)性。實驗結(jié)果表明:TRIM26的表達定位于細胞質(zhì)基質(zhì)中,與癌旁組織相比,其在結(jié)腸癌組織中的表達顯著提高(P<0.001)。臨床指標相關(guān)性分析顯示,結(jié)腸癌組織TRIM26的表達與病理分級、N分期、TNM分期、PDL1密切相關(guān)(P<0.05)。這個結(jié)果提示TRIM26可參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程,并發(fā)揮重要調(diào)控作用。另外,TRIM26的表達與結(jié)腸癌預后的相關(guān)性分析表明,癌組織 TRIM26表達低的結(jié)腸癌患者比癌組織 TRIM26表達高的結(jié)腸癌患者擁有更長的總生存期(59.5% vs 40.4%,P=0.0141),證明癌組織 TRIM26 的高表達可能加強了腫瘤的惡性以及促進了其不良預后。

綜上所述,TRIM26 與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著十分緊密的關(guān)系,這為結(jié)腸癌的診斷以及預后評價提供了一定的理論和實驗參考。