李 磊 武海波 邢偉只

前列腺癌是臨床常見男性泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,多發(fā)于65歲以上中老年人群,可伴發(fā)骨髓壓抑癥、副腫瘤綜合征,并骨瘤轉(zhuǎn)移至全身各處,引發(fā)循環(huán)系統(tǒng)衰竭,危及患者生命安全[1]。近年來,我國新增前列腺癌發(fā)病人數(shù)已居亞洲首位,且隨著老齡化社會的到來及膳食模式的改變,其發(fā)病率增高明顯[2]。臨床治療早期前列腺癌通常采用外科切除手術(shù)及根治性放療術(shù),治療效果良好,但對于晚期及轉(zhuǎn)移患者來說,僅能激素療法及化療,在激素抵抗、化療耐藥及高副作用的影響下,治療效果并不理想[3]。淫羊藿苷是從中藥淫羊藿中提取的中藥單體,具有抗炎、抗病毒、增加血流量、調(diào)節(jié)免疫、提升骨代謝等多種生物學(xué)效應(yīng)[4]。有研究表明[5],淫羊藿苷可通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫抑制微環(huán)境,有效地觸發(fā)細胞凋亡并抑制乳腺癌細胞遷移,對女性泌尿生殖腫瘤表現(xiàn)出良好的抑制作用。然而,目前關(guān)于其對男性前列腺癌細胞的生物學(xué)影響及相應(yīng)機制研究尚少。本研究采用淫羊藿苷干預(yù)人前列腺癌PC3細胞,觀察其對該細胞增殖、凋亡的影響,并探討相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系

人前列腺癌PC3細胞系,購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2 藥物、主要試劑、儀器

淫羊藿苷(純度:98%,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司),Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路激動劑SB216763(上海百舜生物科技有限公司),細胞凋亡檢測試劑盒、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)試劑盒[愛必信(上海)生物科技有限公司],兔抗人糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)、β-catenin一抗(英國Abcam公司)。

Synergy-HT酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司),FACSCanto流式細胞儀(美國BD公司)。

1.3 細胞培養(yǎng)

取PC3細胞系恒溫37 ℃解凍,置于培養(yǎng)箱內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)條件(37 ℃,5% CO2)下,經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素及100 mg/L 鏈霉素)培養(yǎng),待細胞融合至貼壁,胰酶消化傳代,選取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。每個實驗設(shè)置5個復(fù)孔,取均值。

1.4 MTT法測定PC3細胞增殖活性

取對數(shù)期PC3細胞,胰酶消化重懸,調(diào)整細胞密度為1×105個/mL接種至6孔板,待細胞融合至貼壁,每孔分別加入終濃度(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)淫羊藿苷DMSO溶液,48 h后加入新鮮制備MTT溶液20 μL,作用2 h吸棄上清,再加入DMSO 150 μL,振蕩15 min后靜置,酶標(biāo)儀檢測490 nm處各孔吸光度值,計算各濃度細胞抑制率(%)=(1-各濃度孔吸光度值/對照細胞吸光度值)×100%,繪制折線圖得出半抑制濃度(median inhibition concentration,IC50)。

1.5 干預(yù)與分組[6]

取對數(shù)期PC3細胞,胰酶消化重懸,待其融合至貼壁,隨機分為對照組、淫羊藿苷組、激動劑組、聯(lián)合組,對照組在RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng),淫羊藿苷組培養(yǎng)基中加入淫羊藿苷DMSO溶液(終濃度100 μmol/L),激動劑組培養(yǎng)基中加入SB216763 DMSO溶液(終濃度20 μmol/L),聯(lián)合組加入淫羊藿苷DMSO溶液(終濃度100 μmol/L)、SB216763 DMSO溶液(終濃度20 μmol/L)。各組設(shè)置5個復(fù)孔,干預(yù)48 h進行后續(xù)實驗。

1.6 MTT法檢測各組增殖能力

取干預(yù)48 h后的各組細胞,胰酶消化重懸,調(diào)整細胞密度為1×106個/mL接種至96孔板,加入RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng),培養(yǎng)24、48、72 h 3個不同時刻分別加入新鮮制備MTT溶液20 μL,作用2 h吸棄上清,再加入DMSO 150 μL,振蕩15 min后靜置,酶標(biāo)儀檢測490 nm處各組各時刻吸光度值。

1.7 流式細胞術(shù)檢測各組凋亡率

取干預(yù)48 h后的各組細胞,胰酶消化重懸,調(diào)整細胞密度為1×106個/mL接種至6孔板,加入RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)48 h,PBS洗滌,低溫離心8 min(3 000 r/min,r=10 cm),binding buffer液標(biāo)記細胞,加入AnnexinV-FITC 5 μL染色,再加入PI 5 μL二次染色,避光染色20 min,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,并計算各組凋亡率。

1.8 檢測細胞上清液VEGF水平

收集各組細胞上清液,經(jīng)ELISA法檢測細胞上清液VEGF水平,根據(jù)試劑盒說明書設(shè)計實驗步驟,酶標(biāo)儀檢測波長450 nm處吸光度值,繪出曲線計算VEGF濃度。

1.9 免疫印跡法檢測細胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達

取干預(yù)48 h后的各組細胞,PBS洗滌,RIPA液裂解細胞,移至離心管內(nèi),低溫離心15 min(10 000 r/min,r=12 cm),吸棄上清,經(jīng)BCA法定量蛋白。取40 μg待測樣本與4倍體積SDS-PAGE緩沖液混合,沸水浴加熱變性,離心取上清,行上樣電泳分離,濕轉(zhuǎn)至PVDF膜,BSA液封閉2 h,加入兔抗人GSK-3β、β-catenin一抗(1∶500),4 ℃冷藏過夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000)常溫孵育2 h,TBST清洗,加入電化學(xué)發(fā)光試劑發(fā)光,暗室顯影,成像分析儀分析各條蛋白條帶灰度值,以GSK-3β、β-catenin蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值之比代表細胞GSK-3β、β-catenin相對蛋白表達量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各濃度淫羊藿苷對細胞的增殖抑制率及IC50

經(jīng)終濃度(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)淫羊藿苷干預(yù)后,PC3細胞增殖抑制率逐漸升高,IC50位于50～100 μmol/L之間,后續(xù)實驗均采用100 μmol/L作為淫羊藿苷干預(yù)劑量。見圖1。

圖1 各濃度淫羊藿苷對細胞的增殖抑制率

2.2 各組細胞增殖能力

與對照組比較,淫羊藿苷組24、48、72 h吸光度值降低(P<0.05),激動劑組24、48、72 h吸光度值升高(P<0.05);與淫羊藿苷組比較,聯(lián)合組24、48、72 h吸光度值升高(P<0.05);與激動劑組比較,聯(lián)合組24、48、72 h吸光度值降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞MTT吸光度值比較

2.3 各組細胞凋亡率

與對照組比較,淫羊藿苷組凋亡率升高,激動劑組凋亡率降低(P<0.05);與淫羊藿苷組比較,聯(lián)合組凋亡率降低(P<0.05);與激動劑組比較,聯(lián)合組凋亡率升高(P<0.05)。見表2,圖2。

表2 各組細胞凋亡率比較

圖2 細胞凋亡流式圖

2.4 各組細胞上清液VEGF水平

與對照組比較,淫羊藿苷組上清液VEGF水平降低,激動劑組上清液VEGF水平升高(P<0.05);與淫羊藿苷組比較,聯(lián)合組上清液VEGF水平升高(P<0.05);與激動劑組比較,聯(lián)合組上清液VEGF水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組各組細胞上清液VEGF水平比較

2.5 各組細胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達

與對照組比較,淫羊藿苷組GSK-3β蛋白表達升高,β-catenin蛋白表達降低(P<0.05),激動劑組GSK-3β蛋白表達降低,β-catenin蛋白表達升高(P<0.05)。與淫羊藿苷組比較,聯(lián)合組GSK-3β蛋白表達降低,β-catenin蛋白表達升高(P<0.05);與激動劑組比較,聯(lián)合組GSK-3β蛋白表達升高,β-catenin蛋白表達降低(P<0.05)。見表4,圖3。

表4 各組細胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達比較

圖3 各組細胞GSK-3β、β-catenin蛋白表達

3 討論

前列腺癌是起源自前列腺上皮細胞的一種生殖器官癌癥,早期無癥狀,逐漸表現(xiàn)為骨骼疼痛、進行性貧血、腎功能衰竭、呼吸衰竭等重度并發(fā)癥[7]。該病發(fā)病隱匿、進展緩慢,多數(shù)患者確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移,失去根治機會,高增殖性及低凋亡性是導(dǎo)致前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移的主要原因[8]。因此,探尋抑制前列腺癌細胞增殖并促進其凋亡的新藥物,是治療該病的關(guān)鍵。中醫(yī)將前列腺癌歸于“癥積”、“淋證”、“血尿”等癥范疇,治療應(yīng)以溫陽補腎、祛濕解毒為主[9]。中藥淫羊藿是臨床常用補益中藥,可補助腎陽而小便自利,溫通氣血、消化凝結(jié),通行經(jīng)絡(luò),祛除寒濕痹[10]。以淫羊藿為原料提取的中藥單體對前列腺癌的治療作用也逐漸受到關(guān)注。

VEGF是重要的腫瘤血管生長促進因子,在腫瘤自體生長及間質(zhì)血管生成過程中發(fā)揮重要作用,其水平升高可增強瘤體新陳代謝、提升營養(yǎng)供給,從而促進癌細胞增殖,高水平VEGF亦會增加血管通透性,增強癌細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力[11]。淫羊藿苷是一種天然植物類黃酮,可增強巨噬細胞非特異性殺傷作用及T細胞對癌細胞的毒作用,從而提升細胞免疫功能,抑制腫瘤生長[12]。Li等[13]研究認為,淫羊藿苷可抑制宮頸癌SiHa細胞活力及瘤體組織生長,增強體內(nèi)抗腫瘤體液免疫,促進癌細胞凋亡,提示淫羊藿苷或可成為實體腫瘤補充治療藥物。本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,淫羊藿苷組24、48、72 h吸光度值降低,上清液VEGF水平降低,凋亡率升高,提示淫羊藿苷可抑制前列腺癌細胞增殖及血管新生,促進其凋亡。

Wnt/β-catenin信號通路是一條保守的癌基因通路,在腫瘤細胞增殖、凋亡及調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程中扮演重要角色,其中GSK-3β、β-catenin是該通路重要組成蛋白[14]。β-catenin是一種細胞結(jié)構(gòu)蛋白,在正常細胞內(nèi)可與E鈣粘蛋白結(jié)合,發(fā)揮細胞黏附作用,GSK-3β是Wnt信號通路調(diào)控酶,作為β-catenin拮抗蛋白起負向調(diào)控作用,在癌細胞內(nèi)Wnt信號增強,其在細胞膜上與相應(yīng)跨膜蛋白結(jié)合,抑制GSK-3β活性,使β-catenin磷酸化降解減少,未降解β-catenin移至細胞核,促使Wnt/β-catenin通路異常激活,參與下游促癌靶基因轉(zhuǎn)錄,從而促進前列腺癌細胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[15]。Zou等[16]研究認為,抑制Wnt/β-catenin通路活性可顯著抑制CRC細胞遷移及增殖,并促進細胞凋亡,從而抑制結(jié)直腸癌裸鼠腫瘤生長和肺轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,淫羊藿苷組GSK-3β蛋白表達升高,β-catenin蛋白表達降低,且在淫羊藿苷基礎(chǔ)上增用Wnt/β-catenin通路激動劑SB216763可減弱淫羊藿苷對前列腺癌的治療作用,提示淫羊藿苷可能通過抑制該通路對前列腺癌細胞的增殖和凋亡產(chǎn)生調(diào)控作用。

綜上所述,淫羊藿苷可抑制前列腺癌細胞增殖及血管新生,促進其凋亡,其作用機制可能與抑制Wnt/β-catenin信號通路活性有關(guān)。本研究仍然存在一定不足,例如前列腺癌細胞系有多種,本研究在實驗條件的限制下僅選用一種細胞系,可能存在實驗證據(jù)不足的問題。此外,本文研究結(jié)果僅初步提示了淫羊藿苷可通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控人前列腺癌細胞的增殖和凋亡,后續(xù)需進一步驗證。