梁 靜 楊怡萍 王 冠 雷 磊 車 宇

原發(fā)性膽囊癌是肝外膽道常見(jiàn)的惡性腫瘤,發(fā)病率居消化道腫瘤的第6位[1-2],早期無(wú)特異性癥狀,就診時(shí)大多已至中晚期,放化療效果欠佳[3],文獻(xiàn)報(bào)道膽囊癌根治術(shù)后5年生存率不足5%[4]?，F(xiàn)已證實(shí)免疫逃逸、表觀遺傳、microRNA等多種因素參與膽囊黏膜從單純?cè)錾皆话┑陌l(fā)生發(fā)展過(guò)程[5-6],在PD-1/PD-L1信號(hào)通路通過(guò)抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞的增殖與活化使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[7]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于靶向PD-1基因的microRNA對(duì)膽囊癌細(xì)胞生物學(xué)特性的文獻(xiàn)較少。本文通過(guò)microRNA芯片篩選靶向PD-1基因的microRNA,分析其對(duì)膽囊癌 GBC-SD細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響,為膽囊癌的免疫治療提高理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù);DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司);胎牛血清(美國(guó) Gibco 公司);RT-PCR試劑盒(Fermentas公司);Trizol、LipofectamineTM2000 (Takara公司);雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司);PD-1抗體(美國(guó)Invitrogen公司);PD-1過(guò)表達(dá)PCDNA3.1載體、引物設(shè)計(jì)由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)、合成;Agilent Human miRNA Microarray,Release 21.0(上海數(shù)譜生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 GBC-SD細(xì)胞培養(yǎng)及PD-1轉(zhuǎn)染 膽囊癌GBC-SD細(xì)胞在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GBC-SD細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,置于電擊杯內(nèi),加入15 μg PD-1過(guò)表達(dá)PCDNA3.1載體,行電穿孔轉(zhuǎn)染,另取2組細(xì)胞做陰性對(duì)照、空白對(duì)照,3組細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中孵育48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 PD-1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、凋亡的變化 取上述3組細(xì)胞,TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA,以PD-1引物為模板(上游引物:5'-ATGCTTAGCCTAGAACCGG-3',下游引物:5'TTCCGAAGTCGAGGCCAAG-3'),β-actin為內(nèi)參,92 ℃預(yù)變性 5 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。取3組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GBC-SD細(xì)胞,0.25%胰酶消化,1×104個(gè)/孔濃度接種于96孔板,培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h,加入10 μL CCK8溶液,孵育2 h,酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度 (A)值,每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。收集各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞,4 ℃ PBS 洗滌重懸,加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 4 μL,37 ℃避光孵育30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.3 靶向PD-1基因的microRNA篩選及驗(yàn)證 取PD-1轉(zhuǎn)染后GBC-SD細(xì)胞,TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA,依據(jù)miRNA Microarray說(shuō)明書制備poly(A) Tailing Mix,將100 μL總RNA注入miRNA芯片進(jìn)行雜交、清洗染色,SAM&R軟件分析芯片數(shù)據(jù),Cluster3.0軟件行聚類分析,選取表達(dá)差異最顯著的microRNA,Real Time法加以驗(yàn)證。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證PD-1是miRNA210的靶基因 通過(guò)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA210通過(guò)3'-UTR與PD-1結(jié)合,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GBC-SD細(xì)胞,常規(guī)胰酶消化后,按照雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明將PD-1過(guò)表達(dá)PCDNA3.1載體轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞,通過(guò)LipofectamineTM2000將miRNA210-mimic轉(zhuǎn)染至GBC-SD細(xì)胞,另取2組細(xì)胞做陰性對(duì)照、空白對(duì)照,采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組雙熒光素酶活性。

1.2.5 miRNA210轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、凋亡的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GBC-SD細(xì)胞,常規(guī)胰酶消化后,通過(guò)LipofectamineTM2000將miRNA210-mimic轉(zhuǎn)染至GBC-SD細(xì)胞,另取2組細(xì)胞做陰性對(duì)照、空白對(duì)照,取上述3組細(xì)胞,TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA,RT-PCR法檢測(cè)miRNA210 mRNA和PD-1 mRNA的相對(duì)表達(dá);收集各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞,4 ℃ PBS 洗滌重懸,加入Annexin V-FITC 5 μL、PI 4 μL,37 ℃避光孵育 30 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化;CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,2組以上數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、凋亡的變化

PD-1轉(zhuǎn)染后,GBC-SD細(xì)胞內(nèi)PD-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高,表明PD-1已成功轉(zhuǎn)染至GBC-SD細(xì)胞。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果繪制的生長(zhǎng)曲線顯示,PD-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖率高于陰性對(duì)照、空白對(duì)照組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,PD-1轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組(圖1),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.90,P<0.0001)。

A:PD-1 mRNA表達(dá)水平;B:CCK檢測(cè)細(xì)胞增殖;C:流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡;D:細(xì)胞凋亡變化。

2.2 靶向PD-1基因的microRNA篩選及驗(yàn)證

PD-1轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞后,miRNA Microarray分析結(jié)果顯示人GBC-SD細(xì)胞 miRNA表達(dá)譜明顯發(fā)生改變,共54個(gè)miRNAs差異表達(dá)(相差2倍以上),其中上調(diào)miRNAs 30個(gè),下調(diào)miRNA 24個(gè)(圖2),其中miRNA210表達(dá)差異最顯著。進(jìn)一步運(yùn)用RT-qPCR檢測(cè)加以驗(yàn)證,結(jié)果顯示miRNA210在轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)相對(duì)表達(dá)量為(0.12±0.03),明顯低于陰性對(duì)照(2.35±0.48)、空白對(duì)照組(2.62±0.53),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.90,P<0.,001),與microRNA芯片結(jié)果一致。

圖2 PD-1轉(zhuǎn)染后GBC-SD細(xì)胞內(nèi)miRNAs差異表達(dá)

miRNA210轉(zhuǎn)染后,miRNA210 mRNA表達(dá)水平達(dá)(12.5±3.8),高于陰性對(duì)照、空白對(duì)照組(F=33.56,P<0.0001),表明 miRNA210已成功轉(zhuǎn)染至GBC-SD細(xì)胞內(nèi);PD-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為(0.26±0.04),低于陰性對(duì)照(2.18±0.37)、空白對(duì)照組(2.44±0.41)(F=69.36,P<0.0001),表明 miRNA210可降低GBC-SD細(xì)胞內(nèi)PD-1的表達(dá)。熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,miRNA210共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性 (0.57±0.14),低于陰性對(duì)照、空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.51,P<0.0001),表明miRNA210可通過(guò)與PD-1 3'-UTR結(jié)合,降低PD-1 mRNA表達(dá)。

2.3 miRNA210轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、凋亡的變化

通過(guò)LipofectamineTM2000使GBC-SD細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)miRNA210,轉(zhuǎn)染后48 h,細(xì)胞增殖活性為(0.15±0.17),低于陰性對(duì)照(0.88±0.31)、空白對(duì)照組(0.85±0.29),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=4.134,P=0.0431)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,miRNA210轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯高于陰性對(duì)照、空白對(duì)照組(圖3),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.83,P<0.0001)。

A:細(xì)胞增殖;B:細(xì)胞凋亡;C:流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

3 討論

膽囊癌是膽道系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤,位居消化道腫瘤第6位,早期起病隱匿,90%的膽囊癌患者就診時(shí)已屬中晚期,喪失根治性手術(shù)切除機(jī)會(huì),5年總體生存率不足5%,傳統(tǒng)放化療等治療手段療效不容樂(lè)觀,腫瘤免疫治療是新興的一種抗腫瘤治療,在多個(gè)實(shí)體腫瘤臨床應(yīng)用中嶄露頭角[8-10],負(fù)共刺激信號(hào)分子PD-1與配體PD-L1 結(jié)合后,引起PD-1胞質(zhì)內(nèi)N端具有免疫受體酪氨酸抑制基序磷酸化,使T細(xì)胞表面受體的CD-3s和ZAP7去磷酸化,進(jìn)而下調(diào)PI3K/AKt/mTOR信號(hào)通路[11-13]。PD-1/PD-L1信號(hào)通路繁冗復(fù)雜,其誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究,然而PD-1/PD-L1阻斷劑的臨床應(yīng)用正如火如荼開(kāi)展[14-15],文獻(xiàn)報(bào)道PD-1/PD-L1抗體藥物Pembrolizumab單藥治療晚期膽道惡性腫瘤客觀緩解率達(dá)17%[16],PD-1/PD-L1免疫阻斷劑Nivolumab已被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療消化系統(tǒng)多種惡性腫瘤。

哺乳動(dòng)物的基因組不編碼蛋白質(zhì)的序列稱為非編碼RNA,miRNA 是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子[17],通過(guò)與靶基因mRNA 3'-UTR結(jié)合,從而抑制蛋白質(zhì)的表達(dá),然而作為表觀遺傳調(diào)控的重要成員,參與膽囊癌發(fā)生發(fā)展的miRNA不計(jì)其數(shù)。本研究通過(guò)構(gòu)建PCDNA3.1載體使人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞內(nèi)多表達(dá)PD-L1,GBC-SD細(xì)胞的增殖活性明顯增強(qiáng),細(xì)胞凋亡減少,表明膽囊癌內(nèi)過(guò)表達(dá)的PD-L1可能參與了膽囊癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程,然而其具體機(jī)制不甚清楚。通過(guò)基因芯片篩選PD-L1相關(guān)的miRNA,從而為膽囊癌的表觀遺傳學(xué)研究提供理論數(shù)據(jù),本研究發(fā)現(xiàn)miRNA210是GBC-SD細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)最顯著的miRNA,通過(guò)檢索TargetScan miRNA研究數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)PD-L1有可能是miRNA210的靶基因,雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn),說(shuō)明表觀遺傳調(diào)控與腫瘤免疫相互作用共同參與膽囊黏膜從增生到癌變的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程。

免疫檢測(cè)點(diǎn)(check point)PD-1 結(jié)合配體 PD-L1誘導(dǎo)免疫耐受的信號(hào)通路研究較多[18],而且PD-1/PD-L1 抑制劑Nivolumab和Pembrolizumab的臨床效果較好,但對(duì)部分膽囊癌患者療效不甚理想,表明單一腫瘤免疫逃逸機(jī)制無(wú)法解釋部分膽囊癌患者PD-1/PD-L1 抑制劑的作用效果有限的原因。miRNA210在腎癌、腦膠質(zhì)瘤等腫瘤中起抑癌基因作用[19-20],本研究通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染使人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞內(nèi)多表達(dá)miRNA210后發(fā)現(xiàn)GBC-SD細(xì)胞的增殖活性變?nèi)?細(xì)胞凋亡增加,進(jìn)一步表明miRNA210通過(guò)與PD-L1 mRNA 3'-UTR結(jié)合后抑制細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,然而其在組織器官水平層面的作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。雖然有文獻(xiàn)報(bào)道PD-L1在膽囊癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)34.14%,顯著高于癌旁組織,且其表達(dá)程度與血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)[21],但對(duì)具體機(jī)制未加闡述。

膽囊癌的發(fā)生與基因突變、miRNA、免疫逃逸等多種因素相關(guān)。PD-L1具有促進(jìn)人膽囊癌GBC-SD細(xì)胞增殖作用,可能參與膽囊癌發(fā)生過(guò)程,miRNA210通過(guò)與PD-L1 mRNA 3'-UTR結(jié)合抑制PD-L1表達(dá),進(jìn)而抑制GBC-SD細(xì)胞增殖,因此,miRNA210和PD-L1有望成為膽囊癌研究的新方向,然而其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。